彭夢(mèng)穎， 馮慧成， 常洪龍， 尋文鵬

（1. 西北工業(yè)大學(xué)機(jī)電學(xué)院， 西安 710072； 2.西北工業(yè)大學(xué)無(wú)人系統(tǒng)技術(shù)研究院， 西安 710072；3. 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司， 深圳 518055）

1 引言

流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)高速流動(dòng)的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞、多參數(shù)分析的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等領(lǐng)域，可以在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)不同種類細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)的一般步驟是先對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)不同目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行特異標(biāo)記；然后將細(xì)胞樣本流聚焦，使得細(xì)胞成單列依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域，通過(guò)熒光檢測(cè)或者電阻抗檢測(cè)等方式對(duì)樣本細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別與分類計(jì)數(shù)。

傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀通常帶有龐大的鞘流聚焦系統(tǒng)，其熒光檢測(cè)系統(tǒng)也需要復(fù)雜的光學(xué)組件，對(duì)光路對(duì)準(zhǔn)等技術(shù)要求嚴(yán)格，難以適用于大型實(shí)驗(yàn)室之外的場(chǎng)合。 微流控芯片技術(shù)是一種使用微型管道對(duì)微小流體系統(tǒng)進(jìn)行處理或操縱的技術(shù)，具有集成化、微型化的特征，為流式細(xì)胞儀開拓了一種新的發(fā)展方向。 二者的結(jié)合為流式細(xì)胞儀的低成本化、全自動(dòng)化、小型便攜化發(fā)展提供了可能。

本文首先對(duì)微流控芯片與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)合-微流式細(xì)胞術(shù)的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展總結(jié)與回顧。 綜述微流式細(xì)胞術(shù)的步驟，預(yù)處理、細(xì)胞聚焦、細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的國(guó)內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀；闡述微流式細(xì)胞術(shù)在臨床診斷中的廣泛應(yīng)用，以及航天醫(yī)學(xué)檢測(cè)對(duì)微流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用需求。 其次，介紹了應(yīng)用于載人航天的微流式細(xì)胞儀。 該設(shè)備解決了樣本預(yù)處理、細(xì)胞聚焦以及細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)在航天環(huán)境中面臨的眾多難題，通過(guò)了微重力實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2 微流式細(xì)胞術(shù)的研究進(jìn)展

2.1 樣本預(yù)處理技術(shù)

為了達(dá)到對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的檢測(cè)功能，首先要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，提取出所需要的目標(biāo)細(xì)胞，消除其他細(xì)胞對(duì)后續(xù)檢測(cè)流程的干擾。 預(yù)處理方式大致分為2 種，一種是裂解紅細(xì)胞并對(duì)全血中不同種類的白細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記，另一種是直接進(jìn)行細(xì)胞分選。

2.1.1 細(xì)胞裂解

細(xì)胞裂解的預(yù)處理方式是對(duì)全血樣本中的紅細(xì)胞進(jìn)行裂解，排除紅細(xì)胞對(duì)后續(xù)白細(xì)胞檢測(cè)的干擾；同時(shí)對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記，以便在后續(xù)的熒光檢測(cè)中對(duì)形態(tài)大小區(qū)別不大的白細(xì)胞類群進(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)分。

最具有代表性的全血預(yù)處理研究是NASA 于1999 年研制出的一種可以進(jìn)行全血染色的裝置，完成了世界上首次太空全血樣本預(yù)處理。但是，這種裝置人工參與度高，結(jié)果的一致性難以得到保證。 美國(guó)Honeywell 實(shí)驗(yàn)室研制出了一種由聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）制作的微流控芯片，可以對(duì)全血樣本自動(dòng)進(jìn)行預(yù)處理。 但是該芯片由7 層結(jié)構(gòu)組成，結(jié)構(gòu)太過(guò)復(fù)雜，不易實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)，并且不具備微重力適用性。 2015 年，以色列LeukoDx 公司研發(fā)出了可以進(jìn)行敗血癥診斷的全自動(dòng)CD64 檢測(cè)流式細(xì)胞儀Accellix。 該細(xì)胞儀的微流控芯片是一次性的，具備對(duì)全血樣本的紅細(xì)胞裂解功能和細(xì)胞聚焦的功能。 但是，它采用大容積的儲(chǔ)液、混合腔室，不能在空間站這種微重力的環(huán)境中完成工作。

2.1.2 細(xì)胞分選

以往血液以裂解紅細(xì)胞的方式進(jìn)行預(yù)處理，通常具有裂解孵化時(shí)間長(zhǎng)，裂解液昂貴等缺點(diǎn)。直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選成為微流控領(lǐng)域越來(lái)越重要的一個(gè)研究?jī)?nèi)容。 細(xì)胞分選分為主動(dòng)分選和被動(dòng)分選2 種。

主動(dòng)細(xì)胞分選利用微流控相關(guān)技術(shù)，在微流控芯片上根據(jù)各類細(xì)胞的不同性質(zhì)，由外力進(jìn)行分選。 根據(jù)分選原理又可以分為電學(xué)方法、光學(xué)方法、聲學(xué)方法等。

電學(xué)方法中具有代表意義的是介電泳（Di?electrophoresis， DEP ） 法 和 誘 導(dǎo) 電 荷 電 滲（Induced?Charged Electro?Osmosis， ICEO）法。

介電泳是指極化粒子在非均勻電場(chǎng)中受到電場(chǎng)力作用而發(fā)生的運(yùn)動(dòng)。 由DEP 力引起的位移的大小和方向取決于環(huán)境電場(chǎng)和粒子及溶液的性質(zhì)。 大多數(shù)生物細(xì)胞都可以被DEP 力操縱，且包裹細(xì)胞的液滴也具有這種特性。 因此，細(xì)胞或液滴可以通過(guò)非均勻電場(chǎng)中的DEP 力來(lái)控制。該方法可實(shí)現(xiàn)30 000 細(xì)胞／秒的高通量液滴分選。 然而，生物細(xì)胞在高頻電場(chǎng)中的存活率不能得到保證，并且這種方法的特異性差，對(duì)于一些相似細(xì)胞難以進(jìn)行精準(zhǔn)分離，高電壓引起的焦耳熱可能會(huì)降低細(xì)胞的分選效率和生存能力。

ICEO 所需的驅(qū)動(dòng)電壓低、流動(dòng)溫和可調(diào)，為粒子分選提供了另一種方法。 在特定的ICEO漩渦中，輕粒子被捕獲并在斯托克斯力的驅(qū)動(dòng)下繞渦核運(yùn)動(dòng)；重粒子從漩渦中逃逸出來(lái)，聚集于電極中心的滯留線（圖1），從而實(shí)現(xiàn)不同密度微粒的分選。 ICEO 分選芯片同樣可以實(shí)現(xiàn)不同大小顆粒的分離，通過(guò)優(yōu)化中央電極的結(jié)構(gòu)，分選效率得到進(jìn)一步提升， 并展現(xiàn)出實(shí)用化前景。

圖1 ICEO 分選示意圖［9］Fig.1 Schematic diagram of ICEO sorting［9］

光學(xué)分選方法有3 個(gè)特點(diǎn)：①尺寸匹配，典型激光束的直徑可以控制在1 ～20 μm，這與微流控系統(tǒng)完美匹配；②力匹配，光學(xué)驅(qū)動(dòng)器分別提供溫和或強(qiáng)大的力來(lái)控制細(xì)胞或流動(dòng)；③生物兼容性，光束功率和波長(zhǎng)的可控性使得其對(duì)生物樣品的影響較小。 然而，高光功率的激光設(shè)備可能會(huì)阻礙光學(xué)系統(tǒng)的小型化，并且激光設(shè)備的成本一直很高。

在聲學(xué)微芯片中，粒子或細(xì)胞的分離可以通過(guò)微通道上駐波的輻射力將顆?？刂频綁毫?jié)點(diǎn)或波腹來(lái)實(shí)現(xiàn)。 移動(dòng)距離取決于細(xì)胞的大小、密度和可壓縮性、周圍介質(zhì)性質(zhì)和聲波的波長(zhǎng)。 聲學(xué)方法的一個(gè)瓶頸是臨界分離細(xì)胞大小由聲波的頻率決定，為了分離小細(xì)胞（＜1 μm），這些聲波發(fā)生器需要更高的頻率和功率。 大功率聲波可能導(dǎo)致通道內(nèi)溫度升高，解決發(fā)熱問(wèn)題是這些器件小型化的一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

被動(dòng)細(xì)胞分選是在微流控芯片上依據(jù)細(xì)胞自身差異使得它們?cè)谔囟ǖ沫h(huán)境中受到不同程度的作用力而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選的一種方法。 主要包括微過(guò)濾法、慣性分離法等。

微過(guò)濾法是最基本的技術(shù)。 它具有分離效率高、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、控制精確等優(yōu)點(diǎn)。 根據(jù)微通道中的過(guò)濾結(jié)構(gòu)，過(guò)濾有4 種分類：堰、柱、橫流和膜（圖2）。 基于過(guò)濾的方法無(wú)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，芯片易于制造，并且能夠提供連續(xù)分離。 然而，微過(guò)濾法的高剪切應(yīng)力會(huì)影響被困細(xì)胞的存活率，此外，這種方法只能分離不同大小的細(xì)胞，而且容易遇到耐久性差、堵塞等問(wèn)題。

圖2 微濾器設(shè)計(jì)示意圖［16］Fig.2 Schematic diagram of various micro filter designs［16］

基于流體動(dòng)力學(xué)分選方法具有單步、高選擇性和無(wú)標(biāo)簽的特點(diǎn)，而且還提供了并行化、高通量細(xì)胞分選的潛力。 其典型代表慣性分選技術(shù)在醫(yī)療、生物和化學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，在多種細(xì)胞分離和富集過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。 根據(jù)微通道結(jié)構(gòu)的不同，慣性平臺(tái)可分為直線型和曲線型。 學(xué)者們?cè)谑褂镁哂胁煌瑱M截面結(jié)構(gòu)的大直通道進(jìn)行基于尺寸的細(xì)胞或顆粒分選方面做了大量研究（圖3（a））。 曲線型微通道中，靠近通道中心線的流體微元傾向于繞曲線向外流動(dòng)，從而在通道的徑向形成壓力梯度。 在封閉的通道中，由于離心力的作用，當(dāng)壁面附近相對(duì)靜止的流體重新向內(nèi)循環(huán)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生2 個(gè)對(duì)稱的渦（迪恩渦流）。 顆粒在彎曲微通道中的位置取決于慣性力和迪恩力的平衡，不同大小的細(xì)胞處于彎曲通道截面的不同位置。 在Lin 等的工作中，一個(gè)稱為迷宮的彎曲微通道被用于分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells， CTCs）和白細(xì)胞（White Blood Cells， WBCs），該通道使用了銳角和環(huán)的組合（圖3（b））。 此方法分選純度高（WBCs 為 91.4% ± 3.3%， CTCs 為 91.5% ±0.9%），通量高（2.5 mL／min）。 雖然慣性方法具有高通量和結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但是很難分離出大小和密度相似的不同類型的細(xì)胞。 作為主要的被動(dòng)方法之一，這些方法常因堵塞的發(fā)生而發(fā)展受阻。

圖3 分離器設(shè)計(jì)及工作原理Fig.3 Separator design and working principle

2.2 細(xì)胞聚焦技術(shù)

為了實(shí)現(xiàn)流式細(xì)胞儀中后續(xù)的檢測(cè)功能，通常會(huì)對(duì)細(xì)胞樣本流進(jìn)行細(xì)胞聚焦。 在微流控芯片領(lǐng)域，細(xì)胞聚焦方法依據(jù)是否需要外加作用力而分為2 個(gè)大類：①是主動(dòng)聚焦方法，包括水動(dòng)力聚焦、介電泳聚焦、超聲波聚焦等；②是被動(dòng)聚焦方法，包括慣性聚焦和基于泊松過(guò)程的無(wú)鞘流聚焦等。

2.2.1 主動(dòng)聚焦方法

水動(dòng)力聚焦利用鞘流液擠壓樣本流，實(shí)現(xiàn)樣本流中細(xì)胞的高精度聚焦。 其在聚焦維度上可以分為二維聚焦和三維聚焦。 二維聚焦的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、易用。 三維微流控聚焦系統(tǒng)的芯片設(shè)計(jì)要比二維方法復(fù)雜得多，因?yàn)闃颖玖髟谒椒较蚝痛怪狈较蛏隙际艿角柿饕簲D壓聚焦，所得結(jié)果也將更加準(zhǔn)確可靠。

介電泳聚焦法的原理是通過(guò)集成在芯片上的微型電極產(chǎn)生的具有特定梯度的誘導(dǎo)電場(chǎng)，電場(chǎng)力使細(xì)胞向場(chǎng)強(qiáng)最大的地方移動(dòng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞聚焦的功能，并可以對(duì)等體積顆粒進(jìn)行分類，還具有其他優(yōu)點(diǎn)，例如避免了堵塞的可能性，并可調(diào)整外部電壓來(lái)滿足不同的分析需求。

超聲波聚焦使用換能器在微通道內(nèi)產(chǎn)生超聲駐波，依靠聲波壓力梯度將細(xì)胞聚焦在駐波的波峰或波谷節(jié)點(diǎn)位置，能夠達(dá)到與水力聚焦相當(dāng)?shù)木劢剐Ч?美國(guó)Life Technologies 公司于2010 年推出了第一款使用超聲波增強(qiáng)聚焦的流式細(xì)胞儀Attune，相對(duì)于傳統(tǒng)儀器，超聲波聚焦技術(shù)允許其以較常規(guī)儀器更緩慢的速度對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行更高精度的分析，但該儀器仍然需要鞘流系統(tǒng)的輔助以保證聚焦效果并避免流動(dòng)室污染。 Galanzha等開發(fā)了如圖4 所示的諧振器，由2 個(gè)半管或1 個(gè)半管和1 個(gè)帶有附加壓電換能器的平板基板組成，在血管或淋巴管中心生成駐波，利用超聲和光聲波誘發(fā)的梯度聲力，探索了小鼠耳和腸系膜血液和淋巴流中的細(xì)胞聚焦。

圖4 聲學(xué)聚焦示意圖（左）和石英毛細(xì)管（右）的實(shí)驗(yàn)裝置［26］Fig.4 Acoustic focusing diagram （left） and quartz capillary （right） of the experimental appara?tus［26］

2.2.2 被動(dòng)聚焦方法

慣性聚焦屬于被動(dòng)聚焦方法，不依賴外界輸入，通道中的細(xì)胞在剪切力和拖曳力等慣性力的共同作用下會(huì)發(fā)生橫向移動(dòng)，而通過(guò)合理設(shè)計(jì)通道結(jié)構(gòu)能夠產(chǎn)生特定方向的二次流，從而可以控制細(xì)胞向受力平衡位置移動(dòng)實(shí)現(xiàn)聚焦。 由于具有高通量、簡(jiǎn)單、操作精確和低成本等優(yōu)點(diǎn)，慣性微流體技術(shù)在細(xì)胞樣品處理中具有廣闊的應(yīng)用前景，特別是對(duì)于低豐度樣品。

基于泊松過(guò)程的無(wú)鞘流聚焦使用小尺寸的微通道形成低至數(shù)十皮升的檢測(cè)區(qū)體積，針對(duì)濃度一定的細(xì)胞樣本，根據(jù)泊松過(guò)程可以保證幾乎所有的細(xì)胞依次單個(gè)通過(guò)檢測(cè)區(qū)，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞聚焦的效果。 相對(duì)于其他細(xì)胞聚焦方法，無(wú)鞘流通道聚焦只能保證細(xì)胞單個(gè)通過(guò)檢測(cè)區(qū)，而無(wú)法使細(xì)胞聚焦在一條直線上并通過(guò)檢測(cè)區(qū)的某一固定位置，這會(huì)在一定程度上降低檢測(cè)性能。 但得益于其簡(jiǎn)單的通道結(jié)構(gòu)和良好的適用性，該技術(shù)仍然廣泛地應(yīng)用包括上述儀器在內(nèi)的多臺(tái)流式細(xì)胞儀中，充分證明了其實(shí)用性和可靠性。

2.3 細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)

微流式細(xì)胞術(shù)中的微粒檢測(cè)技術(shù)主要分為光學(xué)檢測(cè)和電學(xué)檢測(cè)。 光學(xué)檢測(cè)包括熒光檢測(cè)和散射光檢測(cè)，檢測(cè)精度較高。 電學(xué)檢測(cè)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、制作方便，便于小型化，但是其在分析精度、特異性以及分析參數(shù)上與光學(xué)檢測(cè)有些差距。

2.3.1 光學(xué)檢測(cè)

光學(xué)檢測(cè)分為傳統(tǒng)的外置光路檢測(cè)與將光學(xué)元件集成在芯片上的光流控芯片檢測(cè)。

1） 外置光路檢測(cè)。 根據(jù)熒光收集與激發(fā)光照射的光路布局不同，芯片外置的傳統(tǒng)熒光檢測(cè)光路可分為透射式和反射式2 種。 加州理工研制的微流式細(xì)胞儀和LeukoDx 公司推出的Accellix平臺(tái)采用了如圖5（a）所示的透射式檢測(cè)光路，激發(fā)光由芯片底面射入，前向散射光（FSC）和熒光從芯片頂面收集檢測(cè)。 這種光路結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)潔，所需元件數(shù)量也較少，但只能檢測(cè)熒光和前向散射光。 南安普頓大學(xué)等單位采用如圖5（b）所示的反射式檢測(cè)光路，通過(guò)使用二向色分光鏡從芯片的一面同時(shí)完成激光入射和熒光收集。 這種布局比較緊湊，有利于縮小整機(jī)體積。

圖5 外置傳統(tǒng)光路方案［28，31］Fig.5 Conventional external optical path scheme［28，31］

2） 光流控芯片檢測(cè)方案。 光流控芯片能夠集成光纖、聚焦透鏡等光學(xué)元件，從而可以顯著地減小整個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的體積。 微芯片電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)技術(shù)是一種在單細(xì)胞水平上進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析的理想方法，但難以同時(shí)檢測(cè)多種代謝產(chǎn)物。

2.3.2 電阻抗檢測(cè)

光學(xué)采集和檢測(cè)系統(tǒng)價(jià)格昂貴，制作復(fù)雜，檢測(cè)前通常需要額外的生化標(biāo)記，這大大限制了光學(xué)微流式細(xì)胞儀的低成本發(fā)展。 電阻抗流式細(xì)胞儀用簡(jiǎn)單的電極代替復(fù)雜的光學(xué)元件，可以通過(guò)電阻抗測(cè)量來(lái)提取細(xì)胞的生物物理特性。 在微通道底部制作共面微電極是一種常規(guī)的電阻抗檢測(cè)方式，其主要缺點(diǎn)是檢測(cè)區(qū)域電場(chǎng)不均勻，檢測(cè)精度低。 為了解決這一問(wèn)題，學(xué)者們開發(fā)了平行對(duì)稱的微電極來(lái)生成均勻電場(chǎng)并提高檢測(cè)精度。

3 微流式細(xì)胞術(shù)在航天免疫評(píng)估的應(yīng)用

微流式細(xì)胞術(shù)在分子生物學(xué)、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、疾病診斷、病理學(xué)和治療等領(lǐng)域都有著普遍的應(yīng)用，而在航天方面，針對(duì)航天員身體健康開展的航天醫(yī)學(xué)監(jiān)測(cè)與醫(yī)學(xué)保障工作是保證載人航天任務(wù)順利實(shí)施的重要保障。 多項(xiàng)研究表明，航天飛行的極端環(huán)境會(huì)導(dǎo)致人體免疫功能異化。 血液中的白細(xì)胞幾乎參與人體所有的免疫反應(yīng)，不同種類白細(xì)胞的濃度能夠直接反映人體免疫功能狀況，因此檢測(cè)白細(xì)胞及其亞群的濃度也自然成為免疫功能診斷的必要手段。

國(guó)內(nèi)外已有多家研究機(jī)構(gòu)開展了用于流式細(xì)胞術(shù)的微流控芯片技術(shù)研究，而專門針對(duì)航天需求開展相關(guān)工作的單位較少，具有代表性的單位有NASA、加州理工學(xué)院和加拿大航天局。 NASA研制的Guava 流式細(xì)胞儀和加拿大航天局的Microflow1使用常規(guī)的固定式流路和流動(dòng)室，需要定期沖洗和維護(hù)，一旦發(fā)生污染或堵塞問(wèn)題將很難由航天員在軌解決。 加州理工的微流式細(xì)胞儀和LeukoDx 公司的Accellix采用一次性微流控芯片方案避免了這種問(wèn)題，但仍需要解決芯片對(duì)準(zhǔn)和側(cè)向散射光（Side Scatter， SSC）檢測(cè)的問(wèn)題，以實(shí)現(xiàn)一次性芯片的實(shí)用化和淋巴細(xì)胞亞群的分類。 因此目前仍未有能完全滿足航天使用需求的流式細(xì)胞儀。

4 一款面向載人航天的微流式細(xì)胞儀

針對(duì)載人航天中的在軌免疫檢測(cè)需求，本課題組對(duì)航天微流式細(xì)胞術(shù)中的樣品預(yù)處理、細(xì)胞聚焦和熒光檢測(cè)3 個(gè)環(huán)節(jié)中的微流控芯片技術(shù)進(jìn)行了研究，研制了全血自動(dòng)預(yù)處理芯片和無(wú)鞘流細(xì)胞聚焦芯片2 種聚合物基微流控芯片以及高容錯(cuò)熒光檢測(cè)光路方案，解決流式細(xì)胞術(shù)的在軌應(yīng)用難題，開發(fā)了一款航天用全自動(dòng)微流式細(xì)胞儀樣機(jī)（ACC Microflow Cytometer 1.0）。

4.1 適應(yīng)微重力的自動(dòng)預(yù)處理微流控芯片

自動(dòng)預(yù)處理微流控芯片能夠適應(yīng)微重力環(huán)境，確定淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)所需的全血與試劑用量，對(duì)基于延時(shí)截止閥的自動(dòng)定量取樣技術(shù)和適應(yīng)微重力的多通道流體混合技術(shù)進(jìn)行了研究，并對(duì)比驗(yàn)證了全血的自動(dòng)預(yù)處理效果。

4.1.1 自動(dòng)預(yù)處理芯片設(shè)計(jì)

樣本預(yù)處理模塊的目的是對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行染色以及裂解紅細(xì)胞。 需要完成微重力環(huán)境下對(duì)液體試劑的加注、混勻以及孵育。 因此該芯片需要具有以下特性：全血樣本定量進(jìn)樣，樣本與試劑混合孵育，操作可自動(dòng)進(jìn)行。 按照上述要求設(shè)計(jì)如圖6 所示的具備微重力適應(yīng)性的全血自動(dòng)預(yù)處理芯片，尺寸為50.5 mm×28.0 mm×5.0 mm。 抗體試劑和裂解液存儲(chǔ)于儲(chǔ)液通道內(nèi)，芯片通過(guò)底面的4 個(gè)驅(qū)動(dòng)口與預(yù)處理模塊內(nèi)的4 個(gè)注射泵連接。

圖6 自動(dòng)預(yù)處理芯片設(shè)計(jì)［49］Fig.6 Design of automatic pretreatment chip［49］

4.1.2 自動(dòng)定量取樣技術(shù)

為解決微重力環(huán)境下全血定量加樣的問(wèn)題，遂提出一種基于高吸水樹脂吸水溶脹的延時(shí)截止閥，實(shí)現(xiàn)了微流控芯片上的全血自動(dòng)定量取樣。利用該閥門自動(dòng)延時(shí)關(guān)斷的特性可以實(shí)現(xiàn)原理如圖7 所示的自動(dòng)定量取樣。 取樣通道一端的A口連接預(yù)處理芯片的驅(qū)動(dòng)口，另一端B 口連接后續(xù)混合通道，C 和D 兩口通過(guò)延時(shí)截止閥分別與全血加樣口和排氣口相連。 由C 口加入血樣時(shí)，首先經(jīng)過(guò)閥1，由于A 和B 兩口被芯片底面的密封膠帶封閉，血樣只能沿定量通道段流動(dòng)并由D口經(jīng)閥2 流出至溢樣通道。 2 個(gè)延時(shí)截止閥在血樣流過(guò)后分別開始逐漸關(guān)斷，并最終將血樣截取在定量通道段內(nèi)。

圖7 自動(dòng)取樣工作原理［49］Fig.7 Working principle of the automatic sampling［49］

4.1.3 預(yù)處理芯片的微重力適應(yīng)性

全血預(yù)處理中需要驅(qū)動(dòng)全血樣本、抗體試劑和裂解液3 路液體進(jìn)行混合。 針對(duì)微重力環(huán)境下的液體混合需求，設(shè)計(jì)了一種4 路聯(lián)動(dòng)的液路驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)。 全血預(yù)處理芯片中的所有液體操作均在細(xì)長(zhǎng)微通道內(nèi)進(jìn)行，借助段塞流特性使各部分液體保持整體連續(xù)。 使用差動(dòng)驅(qū)動(dòng)方式保證液體驅(qū)動(dòng)精度以使參與混合的2 路液體同時(shí)到達(dá)通道交叉口以防止混入氣泡，通過(guò)彎曲通道內(nèi)的往復(fù)流動(dòng)實(shí)現(xiàn)血樣與試劑的混勻。對(duì)經(jīng)由手動(dòng)處理和預(yù)處理芯片處理后的血樣進(jìn)行檢測(cè)，得到散點(diǎn)圖如圖8 所示，2 種處理方式得到的散點(diǎn)圖相似度高，該預(yù)處理芯片可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)手動(dòng)預(yù)處理。

圖8 手動(dòng)處理（a?c）與芯片處理（d?f）的檢測(cè)結(jié)果散點(diǎn)圖［48］Fig.8 Manual processing and chip processing test results with the scatter plot［48］

4.2 無(wú)鞘流聚焦微流控芯片技術(shù)

無(wú)鞘流聚焦微流控芯片研究了基于泊松過(guò)程的無(wú)鞘流聚焦原理，針對(duì)淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)設(shè)計(jì)了聚焦微流控芯片（圖9）。 基于泊松過(guò)程的無(wú)鞘流聚焦僅依靠微通道的尺寸將細(xì)胞樣本流聚焦，結(jié)構(gòu)和驅(qū)動(dòng)液路最為簡(jiǎn)潔。 設(shè)計(jì)的集成血樣和廢液儲(chǔ)液通道的無(wú)鞘流聚焦芯片如圖10 所示，外形尺寸為80 mm×22 mm×7.5 mm。

圖9 聚焦通道結(jié)構(gòu)圖［48］Fig.9 Schematic diagram of focus channel［48］

圖10 無(wú)鞘流聚焦芯片［48］Fig.10 Sheathless flow focusing chip［48］

4.3 高容錯(cuò)單光四色熒光檢測(cè)技術(shù)

熒光檢測(cè)光路采用正交光路方案識(shí)別SSC淋巴細(xì)胞。 為了提高熒光檢測(cè)的靈敏度，需要選用數(shù)值孔徑較大的鏡頭以獲得較高的熒光收集效率。 從與聚焦微通道距離較近的芯片頂面（厚1.5 mm）收集熒光信號(hào)，從靠近微通道的一側(cè)（厚3 mm）入射激光，如圖11 所示。

圖11 熒光檢測(cè)光路方案［48］Fig.11 Optical path scheme of fluorescence detection［48］

在無(wú)鞘流聚焦微流控芯片中，樣本流尺寸即為聚焦微通道尺寸，為50 μm×50 μm，且聚焦微通道存在±15 μm 的位置誤差，細(xì)胞可能出現(xiàn)的區(qū)域尺寸為80 μm×80 μm，超出了傳統(tǒng)熒光檢測(cè)光路的檢測(cè)范圍。 因此針對(duì)無(wú)鞘流聚焦微流控芯片的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)區(qū)域大于80 μm×80 μm的高容錯(cuò)熒光檢測(cè)光路，以實(shí)現(xiàn)對(duì)所有細(xì)胞的一致性熒光檢測(cè)。

4.4 性能及微重力適應(yīng)性驗(yàn)證

整套航天用自動(dòng)微流式細(xì)胞儀樣機(jī)（ACC Microflow Cytometer 1.0）如圖12 所示，由全血預(yù)處理芯片與無(wú)鞘流聚焦芯片2 種即插即用的一次性微流控芯片，以及全血預(yù)處理模塊和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)模塊2 個(gè)儀器模塊組成。

圖12 航天用自動(dòng)流式細(xì)胞儀（ACC microflow cy?tometer 1.0）［51］Fig.12 Automated flow cytometry for aerospace ap?plications［51］

對(duì)同一份血樣，分別使用ACC Microflow Cy?tometer 1.0 檢測(cè)10 份實(shí)驗(yàn)組樣本，使用傳統(tǒng)手段檢測(cè)的4 份對(duì)照組樣本。 檢測(cè)結(jié)果如圖13 所示。和對(duì)照組結(jié)果對(duì)比可知，雖有差異但符合臨床要求。

圖13 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果對(duì)比［48］Fig.13 Comparison of lymphocyte subsets detection［48］

為了進(jìn)一步驗(yàn)證淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)功能，樣機(jī)參加了綠航星際4 人180 天受控生態(tài)生保系統(tǒng)集成試驗(yàn)。 試驗(yàn)共成功進(jìn)行了4 次淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，其中2 名參試者的淋巴細(xì)胞亞群數(shù)據(jù)如圖14 所示。 2 名參試者的淋巴細(xì)胞亞群比例在試驗(yàn)期間略有波動(dòng)，但整體比較平穩(wěn)且均處于正常參考范圍內(nèi)，說(shuō)明2 人免疫功能水平正常。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中使用了300 多支芯片，用于操作手冊(cè)編寫、參試志愿者前期培訓(xùn)和正式進(jìn)艙試驗(yàn)。

圖14 綠航星際試驗(yàn)中兩名參試者的淋巴細(xì)胞亞群數(shù)據(jù)［48］Fig.14 Data of lymphocyte subsets from two volunteers in 180 CELSS integration experiment［48］

其后，樣機(jī)在法國(guó)國(guó)家太空研究中心的拋物線飛行飛機(jī)ZERO?G 上進(jìn)行了微重力適用性測(cè)試。 每次失重約20 s。 表1 結(jié)果表明，微重力和超重力階段的CV 性能略有下降。 這是由于該拋物線操縱是加速度在±0.05 G 內(nèi)，而不是精確的0 G。 這種加速度的變化可能會(huì)干擾微通道內(nèi)的流動(dòng)，導(dǎo)致CV 的增加。 使用處理熒光分辨率數(shù)據(jù)的方法將飛行實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)劃分為3 個(gè)不同的重力階段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，通過(guò)熒光MESF 校準(zhǔn)曲線計(jì)算得到FITC 通道熒光靈敏度，結(jié)果如表1 所示。 其中3 種飛行階段的FITC 通道MESF值略高于地面對(duì)照組，但并無(wú)顯著差別。 因此失重和超重環(huán)境對(duì)微流式細(xì)胞儀的熒光靈敏度性能無(wú)顯著影響。

表1 熒光分辨率與熒光靈敏度指標(biāo)對(duì)比［48］Table 1 Comparison of fluorescence resolution and fluo?rescence sensitivity indexes［48］

該樣機(jī)能夠滿足淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)需求，且具備良好的微重力適應(yīng)性。 表2 列舉了國(guó)內(nèi)外最具代表性的若干小型流式細(xì)胞儀及其關(guān)鍵性能指標(biāo)。

表2 部分小型流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)對(duì)比［51］Table 2 Comparison of performance indicators of some small flow cytometers［51］

5 總結(jié)與展望

本文首先對(duì)微流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀進(jìn)行了概述，包括預(yù)處理技術(shù)、細(xì)胞聚焦技術(shù)、細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)；其次，著重介紹了其在航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，即實(shí)現(xiàn)對(duì)航天員免疫狀態(tài)的實(shí)時(shí)、在軌監(jiān)測(cè)；最后，針對(duì)載人航天中的在軌免疫檢測(cè)需求，介紹了航天微流式細(xì)胞術(shù)中的樣品預(yù)處理、細(xì)胞聚焦和熒光檢測(cè)3 個(gè)環(huán)節(jié)中的微流控芯片技術(shù)的研究，包括開發(fā)了全血自動(dòng)預(yù)處理芯片和無(wú)鞘流細(xì)胞聚焦芯片兩種聚合物基微流控芯片以及高容錯(cuò)熒光檢測(cè)光路方案，研制了航天用全自動(dòng)微流式細(xì)胞儀樣機(jī)（ACC Microflow Cytometer 1.0）。

流式細(xì)胞術(shù)仍然具有很大的發(fā)展空間。 目前，流式細(xì)胞儀的其中一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)是從實(shí)驗(yàn)用大型儀器向便攜式、高質(zhì)量分選、高分辨率檢測(cè)的研究用流式細(xì)胞儀發(fā)展。 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用對(duì)象也不僅局限于常規(guī)的血細(xì)胞，一些非細(xì)胞體，如病毒、細(xì)胞核、染色體、原生質(zhì)體等也是流式細(xì)胞儀的檢測(cè)對(duì)象。 實(shí)際上，用顆粒而不僅僅是細(xì)胞來(lái)定義流式細(xì)胞儀的檢測(cè)對(duì)象，顯然更有代表意義。這樣，也帶來(lái)了擴(kuò)大檢測(cè)范圍的考驗(yàn)。 可以預(yù)見，具有更強(qiáng)的專業(yè)性和臨床型的流式細(xì)胞儀在之后的研究中將帶來(lái)更多的成果，最終實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)流式檢測(cè)。