張 娜， 曹小勇,2*， 胡選萍,2， 秦公偉,2， 王思蘄， 趙 垚

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000)

蘭科植物自古以來便被賦予了不同的寓意和象征，擁有著高貴的品質(zhì)，散發(fā)著自然之美和人文之美[1]。作為種類最多、分布最廣的有花植物之一，蘭科植物的生態(tài)類型豐富，且多為珍稀瀕危植物，藥用、觀賞價值較高[2]。

蘭科植物資源再生及合理開發(fā)利用多采用種子共生萌發(fā)與非共生萌發(fā)，其中，非共生萌發(fā)應(yīng)用更為廣泛[2]。白及(Bletillastriata)[3]的非共生萌發(fā)研究表明，白及種胚膨大至突破種皮后形成原球莖，原球莖的頂端分化葉芽，基部生根形成幼苗[4]。千代蘭(Ascocenda‘FuchsGold’)[5]、西藏虎頭蘭(Cymbidiumtracyanum)[6]、蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)[7]等植物種子非共生萌發(fā)的過程與白及相同。對建蘭(C.ensifolium)[3]的非共生萌發(fā)研究中發(fā)現(xiàn)，其種胚形成原球莖后進行伸長生長，至根狀莖階段可持續(xù)增殖，根狀莖繼代培養(yǎng)形成芽后成苗[8]。墨蘭(C.sinense)[9]、春蘭(C.goeringii)[10]、寒蘭(C.kanran)[11]、大花蕙蘭(C.hybrid)[12]等蘭科植物種子非共生萌發(fā)的過程與建蘭的相同。蘭科植物種子非共生萌發(fā)除白及和建蘭的萌發(fā)成苗模式外，是否還存在與上述二者差異的形式，目前尚未見報道。

本課題組在對杜鵑蘭(Cremastraappendiculata)種子非共生萌發(fā)研究中，發(fā)現(xiàn)其萌發(fā)過程與白及、建蘭不同。本文通過對白及、杜鵑蘭、建蘭3種蘭科植物非共生萌發(fā)成苗過程比較觀察，展示3種蘭科植物種子非共生萌發(fā)成苗的差異，為蘭科植物非共生萌發(fā)研究提供參考。

1 試驗

1.1 材料

非共生萌發(fā)培養(yǎng)材料：采集白及、建蘭、杜鵑蘭成熟未開裂蒴果分別置于廣口瓶內(nèi)，自來水沖洗3～4次后，置SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺上使用體積分數(shù)75%酒精和質(zhì)量分數(shù)10%次氯酸鈉溶液對蒴果消毒，無菌水沖洗3～4次，取出置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)切除蒴果兩端，劃開側(cè)面，用鑷子夾取蒴果，將種子抖入無菌玻璃瓶內(nèi)。晾干后存儲于4 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

白及種子(2021年1月播種，2021年2月成苗，培養(yǎng)50 d)：1/2MS固體培養(yǎng)基；杜鵑蘭種子(2020年10月播種，2021年4月成苗，培養(yǎng)6個月)：1/2MS+2 g/L水解酪蛋白+0.5 mg/L NAA液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至多數(shù)產(chǎn)生分支后移入配制相同的固體培養(yǎng)基內(nèi)；建蘭種子(2019年10月播種，2021年5月成苗，培養(yǎng)19個月)：種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基，根狀莖分化培養(yǎng)基為1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA固體培養(yǎng)基。

培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照時間12 h/d，靜置培養(yǎng)。白及光照培養(yǎng)，光照2500～3000 lx；杜鵑蘭弱光培養(yǎng)，光照500～1000 lx；建蘭種子萌發(fā)前暗培養(yǎng)，萌發(fā)后(140 d)移至光下培養(yǎng)，光照2500～3000 lx。

1.2.2 觀察記錄

Nikon SMZ800體視顯微鏡定期觀察白及、杜鵑蘭、建蘭種子的非共生萌發(fā)生長情況。觀察白及時，未形成原球莖前可隔瓶身觀察，形成原球莖后，需每次選20個樣本挑出至培養(yǎng)皿后，在體視顯微鏡下觀察；杜鵑蘭與建蘭在形成根狀莖后，不同生長階段各選20個樣本挑出觀察。圖像采集使用Leica M205C體視顯微鏡。

2 結(jié)果觀察

2.1 白及非共生萌發(fā)成苗

培養(yǎng)7 d，大多數(shù)種子種胚膨大，變綠，種胚突破種皮，形成原球莖(圖1-A)，原球莖呈卵圓形，綠色均勻。培養(yǎng)15 d，原球莖頂端生長出葉片(圖1-B)，基部形成簇狀假根，均勻分布。培養(yǎng)約30 d，原球莖基部分化出不定根(圖1-C)。培養(yǎng)50 d,形成三葉兩根幼苗(圖1-D)。

圖1 白及非共生萌發(fā)成苗過程

2.2 杜鵑蘭非共生萌發(fā)成苗

培養(yǎng)約20 d，種胚膨大至突破種皮(圖2-A)。培養(yǎng)30 d，形成原球莖，出現(xiàn)假根。培養(yǎng)約60 d,形成根狀莖(圖2-B)，少數(shù)根狀莖形成分支，一些呈綠色，頂端鱗片無色。根狀莖生長過程中會彎曲，形成背腹面，假根在背面較多，腹面較少。培養(yǎng)約90 d，出現(xiàn)褐變，根狀莖產(chǎn)生多級分支，次級分支頂端形成休眠芽(圖2-C，上面箭頭)。培養(yǎng)約130 d，根狀莖頂端產(chǎn)生葉片。培養(yǎng)180 d，著生葉片的部位分化出根，形成幼苗(圖2-D)。培養(yǎng)240 d，形成假鱗莖。杜鵑蘭根狀莖大多為水平生長，不伸入培養(yǎng)基內(nèi)部。根狀莖也存在不產(chǎn)生分支的情況，根狀莖伸長，產(chǎn)生多枚鱗片后，頂端出現(xiàn)葉片分化成苗。

圖2 杜鵑蘭非共生萌發(fā)成苗過程

杜鵑蘭種子非共生萌發(fā)過程與白及不同。白及非共生萌發(fā)成苗過程為種胚膨大至突破種皮，形成原球莖，原球莖上端形成葉片，隨后形成根直接成苗。杜鵑蘭原球莖形成后，伸長生長形成根狀莖，頂端分化出葉芽，葉基部長出根發(fā)育成苗。白及非共生萌發(fā)各階段整齊度高，杜鵑蘭整齊度較低。

2.3 建蘭非共生萌發(fā)成苗

種子在萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約140 d，種胚膨大突破種皮，形成無色的原球莖(圖3-A)。培養(yǎng)約250 d形成基部為綠色根狀莖(圖3-B)。根狀莖持續(xù)分支，呈現(xiàn)明顯向地性，頂端沒有芽的分化，培養(yǎng)450 d形成大量鮮綠色分支(圖3-C)。根狀莖頂端呈錐狀，具鱗片，下側(cè)是大量簇狀假根(圖3-D)。當(dāng)根狀莖轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)60 d，根狀莖頂端膨大，形成由數(shù)枚光滑覆瓦狀鱗片包裹的芽(圖3-E)。培養(yǎng)約120 d形成具有葉和根的幼苗(圖3-F)。圖3-E中箭頭指示部位表示根狀莖分化，圖3-F中箭頭指示根的位置。

圖3 建蘭非共生萌發(fā)成苗過程

杜鵑蘭原球莖形成根狀莖后僅進行有限分支即可分化成苗，分支期間會形成休眠芽且大多水平分布于培養(yǎng)基表面。建蘭原球莖形成根狀莖后，持續(xù)產(chǎn)生分支增殖，改變培養(yǎng)基激素后才可進入分化階段，且其根狀莖有明顯向地性。

3 分析與討論

大多數(shù)蘭科植物的非共生萌發(fā)培養(yǎng)過程與白及相同，如千代蘭(Ascocenda‘FuchsGold’)[5]、西藏虎頭蘭(C.tracyanum)[6]、扇形文心蘭(Psygmorchispusilla)[13]、蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)[7]、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)[14]、小葉兜蘭(Paphiopedilumbarbigerum)[3]、卡特蘭(Cattleyahybrida)[3]、大花君子蘭(Cliviaminiata)[3]、金邊龍舌蘭(Agaveamericana‘Variegata’Nichols)[15]、樹蘭(EpidendreaeHumb)[16]、鶴望蘭(Strelitziareginae)[17]等。3種成苗模式的蘭科植物如圖4所示。

圖4 3種成苗模式的蘭科植物

扇形文心蘭種子非共生萌發(fā)種胚一端產(chǎn)生芽，隨后產(chǎn)生多枚葉片，形成根(圖4-A)[13]。蝴蝶蘭原球莖頂端存在生長點，根由原球莖下部分化產(chǎn)生，且其原球莖增殖產(chǎn)生大量原球莖，或直接分化成苗(圖4-B)[7,18]，故白及是絕大多數(shù)蘭科植物種子萌發(fā)成苗的模式。

與建蘭非共生萌發(fā)過程相同的蘭科植物有墨蘭(C.sinense)[9]、春蘭(C.goeringii)[10]、寒蘭(C.kanran)[11]、大花蕙蘭(C.hybrid)[12]、蕙蘭(C.faberi)[19]、蓮瓣蘭(C.tortisepalum)[20]等。墨蘭根狀莖持續(xù)增殖最合適的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基(圖4-C)[9]；寒蘭根狀莖在分化培養(yǎng)基中頂端分生組織分化出芽(圖4-D)[11]。建蘭類的成苗模式中存在根狀莖持續(xù)增殖階段，需改變培養(yǎng)基激素才能分化成苗。

與杜鵑蘭相同的蘭科植物有黃花火燒蘭(Epipactisflava)[21]、多花指甲蘭(Aeridesrosea)[22]、巨蘭(Grammatophyllumspeciosum)[23]、山蘭(Oreorchispatens)[24]、地寶蘭(Geodorumdensiflorum)[25]等。E.flava的體外繁殖研究中展示了其成苗模式圖，與杜鵑蘭的相似，存在休眠芽，呈現(xiàn)顯著頂端優(yōu)勢(圖4-E)[21]；地寶蘭根狀莖水平生長，只進行有限分支后便可成苗(圖4-F)[25]。杜鵑蘭根狀莖大多水平分布在培養(yǎng)基表面，但當(dāng)培養(yǎng)基中萘乙酸濃度呈倍數(shù)高于6-BA濃度時，其根狀莖也存在伸入培養(yǎng)基內(nèi)部的情況，故激素可能會影響植物的形態(tài)發(fā)生。建蘭持續(xù)增殖根狀莖與分化根狀莖，杜鵑蘭根狀莖上的休眠芽與繼續(xù)生長的分支，除外部形態(tài)存在差別外，內(nèi)部結(jié)構(gòu)也可能存在差異，可制作石蠟切片觀察。

蘭科作為被子植物第三大科[2]，種子萌發(fā)過程可能存在更多類型?，F(xiàn)有資料中還存在兩種特別的類型：鬼蘭(Dendrophylaxlindenii)種子發(fā)育成個體的過程沒有葉的分化，光合作用器官為根(圖5-A)[26]；天麻(Gastrodiaelata)種子萌發(fā)形成個體的過程沒有根和葉的分化，植株只具莖和花(圖5-B)[3]。圖5-A中箭頭指示為根[26]；圖5-B中上側(cè)箭頭指示花序，下側(cè)箭頭指示塊莖。二者種子萌發(fā)產(chǎn)生的個體形態(tài)與本文描述的3種模式存在差異，也可據(jù)此作為兩種“成苗”模式，但廣義的成苗過程包括葉與根的發(fā)生[27]，上述二者可能不符合廣義的成苗模式。

圖5 兩種蘭科植物

綜上所述，本文將蘭科植物種子離體培養(yǎng)成苗區(qū)分為3種模式(白及、杜鵑蘭、建蘭)，白及是絕大多數(shù)蘭科種子萌發(fā)成苗的模式。在蘭科植物的非共生萌發(fā)研究中，培養(yǎng)早期就可根據(jù)這3種成苗模式，確定該材料后續(xù)培養(yǎng)方案。另外，原球莖或根狀莖的增殖有利于優(yōu)良品種的高效工廠化生產(chǎn)和蘭科植物快速繁殖技術(shù)的發(fā)展。白及模式的原球莖和杜鵑蘭模式的根狀莖增殖與芽分化均可同時進行，建蘭模式根狀莖的持續(xù)增殖特點可提供大量根狀莖，分瓶轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基上便可大規(guī)模生產(chǎn)幼苗。