唐 慧，王 默，李 偉，張 靜，周 雯，程 東

(1.山東省疾病預(yù)防控制中心，濟(jì)南 250014； 2.山東省立醫(yī)院，濟(jì)南 250021；3.濟(jì)南市槐蔭區(qū)疾病預(yù)防控制中心，濟(jì)南 250022 )

翅果油樹(shù)是胡頹子科、胡頹子屬落葉直立喬木或灌木，距今已有200多萬(wàn)年的歷史[1]，僅在晉、陜兩地小范圍內(nèi)零星分布，是我國(guó)獨(dú)有的珍稀優(yōu)良油料樹(shù)種，被稱(chēng)作“植物國(guó)寶”。翅果油樹(shù)果實(shí)種仁含有豐富的油脂，翅果油中亞麻酸與亞油酸含量比約為1∶7[2]，接近母乳中這兩種成分的比例(約為1∶10)；翅果油中維生素E的含量較高，達(dá)0.98%；此外，翅果油中還含有少量的植物甾醇和黃酮類(lèi)化合物[3-4]。研究表明，翅果油具有降脂減肥、抗疲勞、抗氧化及抗炎等作用[5-8]。2011年翅果油被批準(zhǔn)為新資源食品[9]，但產(chǎn)量少、規(guī)模小、成本高阻礙了對(duì)其廣泛深入地開(kāi)發(fā)和利用，因此在過(guò)去的十年間，市面上翅果油及其相關(guān)產(chǎn)品屈指可數(shù)。我國(guó)葡萄種植面積居世界第二，作為葡萄酒工業(yè)副產(chǎn)品之一的葡萄籽油，其價(jià)格相對(duì)較低且生物活性多樣，在保健食品、醫(yī)藥和工業(yè)領(lǐng)域得到市場(chǎng)的高度認(rèn)可。翅果油中添加葡萄籽油，可在結(jié)合兩種優(yōu)良油脂多種功效的同時(shí)，有助于降低翅果油產(chǎn)品的成本，提高市場(chǎng)認(rèn)知度，對(duì)于擴(kuò)大翅果油植株種植面積，促進(jìn)當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)特色產(chǎn)業(yè)的形成具有重要的意義。

此前的研究多側(cè)重于翅果油單品的生物活性，未見(jiàn)其復(fù)方制劑被應(yīng)用于保健食品的報(bào)道。本研究對(duì)以翅果油、葡萄籽油為原料組方的復(fù)方翅果油進(jìn)行初步的安全性評(píng)價(jià)，為其長(zhǎng)期食用提供毒理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

復(fù)方翅果油，為透明油狀液體，山西某公司提供，由翅果油和葡萄籽油組成，每100 g中含亞油酸42 g、亞麻酸2 g、維生素E 800 mg，人體推薦劑量為0.06 g/(kg·d)；花生油。

環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞公司；敵克松(Dexon)，美國(guó)Chemservice公司；2-氨基芴(2-AF)，美國(guó)Sigma-Aldich 公司；甲基磺酸甲酯(MMS)，德國(guó)Merck-Schuchand公司；1，8-二羥基蒽醌，比利時(shí)Acros Organics公司；肌酐試劑盒，上海復(fù)興長(zhǎng)征公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、總蛋白、白蛋白試劑盒，北京利德曼公司。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠及SD大鼠，北京華阜康生物科技股份有限公司。試驗(yàn)動(dòng)物均適應(yīng)3 d后方可開(kāi)始試驗(yàn)。

1.1.3 試驗(yàn)菌株

鼠傷寒沙門(mén)氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100和TA102，上海寶錄公司。

1.1.4 主要儀器

Countermat Flash全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器，西班牙IUL公司；CD3700血細(xì)胞分析儀，美國(guó)Abbott公司；7180全自動(dòng)任選式生化分析儀，日本Hitachi公司；組織切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；Sakura Tissue-Tek Prisma & Tissue-TekGlasg2染色封片機(jī)，日本櫻花公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn)

采用最大耐受劑量(MTD)法進(jìn)行試驗(yàn)。以食用花生油為溶劑，將復(fù)方翅果油配制成質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的溶液。選用18～21 g ICR小鼠20只，雄、雌各半，分兩次灌胃復(fù)方翅果油溶液，每次灌胃量為0.02 mL/g，兩次間隔4 h，合并染毒劑量為20.0 g/kg。染毒后連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠體重、中毒及死亡情況。

1.2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

1.2.2.1 Ames試驗(yàn)(平板摻入法)

稱(chēng)取5.0 g復(fù)方翅果油，經(jīng)0.055 MPa滅菌20 min，冷卻后以丙酮為溶劑配制成質(zhì)量濃度分別為50 000、10 000、2 000、400、80 μg/mL的溶液，待用。在加或不加代謝活化系統(tǒng)(S-9)的條件下，分別取0.1 mL不同質(zhì)量濃度受試物與測(cè)試菌株(TA97、TA98、TA100、TA102)增菌液混合，倒入底層培養(yǎng)基平板，對(duì)應(yīng)受試物劑量分別為5 000、1 000、200、40、8 μg/皿，另外設(shè)置自發(fā)回變組、溶劑對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，于37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)回變菌落數(shù)。

1.2.2.2 骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

以食用花生油為溶劑，將復(fù)方翅果油配制成質(zhì)量濃度分別為0.125、0.250、0.500 g/mL的溶液。選用體重25～30 g ICR小鼠，10只/組，雄、雌各半，分兩次灌胃不同質(zhì)量濃度的復(fù)方翅果油溶液，灌胃量0.02 mL/g，兩次間隔24 h。末次染毒后6 h，處死小鼠，取胸骨骨髓制片。每張涂片鏡檢1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，計(jì)數(shù)出現(xiàn)微核的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算微核細(xì)胞率。記錄計(jì)數(shù)200個(gè)PCE的過(guò)程中觀察到的正染紅細(xì)胞(NCE)數(shù)量，計(jì)算PCE/NCE。另設(shè)溶劑對(duì)照組和環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組(劑量40 mg/kg)。

1.2.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

以食用花生油為溶劑，將復(fù)方翅果油配制成質(zhì)量濃度分別為0.125、0.250、0.500 g/mL的溶液。選用體重25～30 g雄性ICR小鼠，5只/組，連續(xù)5 d灌胃不同質(zhì)量濃度的復(fù)方翅果油溶液，灌胃量0.02 mL/g。灌胃后第35天處死小鼠，取兩側(cè)附睪制片。每張涂片計(jì)數(shù)1 000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子，記錄畸變精子的類(lèi)型及數(shù)量，計(jì)算精子畸變率。另設(shè)溶劑對(duì)照組和環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組(劑量40 mg/kg)。

1.2.3 亞急性毒性試驗(yàn)(30 d喂養(yǎng)試驗(yàn))

以食用花生油為溶劑，將復(fù)方翅果油配制成質(zhì)量濃度分別為0.019、0.038、0.075 g/mL的溶液。選用體重60～80 g雄、雌SD大鼠，10只/組，連續(xù)30 d灌胃不同質(zhì)量濃度的復(fù)方翅果油溶液，灌胃量0.08 mL/g。另外設(shè)置溶劑對(duì)照組。試驗(yàn)周期內(nèi)，觀察大鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況。每周稱(chēng)量大鼠體重和進(jìn)食量，計(jì)算每周食物利用率(每周增重/每周進(jìn)食量)及總食物利用率(總增重/總進(jìn)食量)。灌胃30 d后，大鼠空腹16 h，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，進(jìn)行血常規(guī)指標(biāo)和血生化指標(biāo)檢測(cè)；對(duì)大鼠進(jìn)行大體解剖觀察，取肝、脾、腎、睪丸等臟器稱(chēng)量濕重，計(jì)算臟體比(臟器質(zhì)量/空腹體重)；對(duì)肝、脾、腎、睪丸/卵巢、胃、腸等臟器進(jìn)行固定后，制成組織切片進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)量資料使用SPSS軟件進(jìn)行均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算和方差分析或秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)(MTD法)

試驗(yàn)期內(nèi)，試驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)狀況良好，未見(jiàn)中毒表現(xiàn)和死亡，受試物對(duì)雄、雌小鼠的經(jīng)口MTD均大于20.0 g/kg(見(jiàn)表1)。根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)方翅果油屬無(wú)毒級(jí)。

表1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.2.1 Ames試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表2)

由表2可看出，受試物各劑量組菌落數(shù)小于自發(fā)回變組菌落數(shù)的2倍，且無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系。

表2 Ames試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表3)

由表3可見(jiàn)，受試物各劑量組雄、雌小鼠的PCE/NCE均高于溶劑對(duì)照組的20%，表明受試物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。受試物各劑量組微核細(xì)胞率與溶劑對(duì)照組比較無(wú)明顯劑量反應(yīng)關(guān)系且無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而陽(yáng)性對(duì)照組與溶劑對(duì)照組之間存在極顯著性差異(P<0.01)。

2.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表4)

由表4可見(jiàn)，受試物各劑量組小鼠精子畸變率與溶劑對(duì)照組比較無(wú)明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系且無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而陽(yáng)性對(duì)照組與溶劑對(duì)照組之間存在極顯著性差異(P<0.01)。

表3 骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

表4 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

2.3 亞急性毒性試驗(yàn)

2.3.1 一般表現(xiàn)

各試驗(yàn)組大鼠在試驗(yàn)期內(nèi)生長(zhǎng)狀況良好，無(wú)中毒體征及死亡，體重增長(zhǎng)、進(jìn)食量、食物利用率等指標(biāo)與溶劑對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(見(jiàn)表5～表7)。

表5 復(fù)方翅果油對(duì)大鼠體重的影響

表6 復(fù)方翅果油對(duì)大鼠進(jìn)食量的影響

續(xù)表6

表7 復(fù)方翅果油對(duì)大鼠食物利用率的影響

2.3.2 血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表8)

由表8可見(jiàn)：受試物低、高劑量組雄性大鼠的中性粒細(xì)胞占比、淋巴細(xì)胞占比與溶劑對(duì)照組比較存在顯著性差異(P<0.05、P<0.01)，但數(shù)值均在實(shí)驗(yàn)室正常范圍內(nèi)，不認(rèn)為存在生物學(xué)意義；其他血常規(guī)指標(biāo)均在實(shí)驗(yàn)室正常范圍內(nèi)，且與溶劑對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表8 血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.3.3 血生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表9)

由表9可見(jiàn)：受試物雄性大鼠高劑量組、雌性大鼠中劑量組谷丙轉(zhuǎn)氨酶，雌性大鼠高劑量組白蛋白與溶劑對(duì)照組比較存在顯著性差異(P<0.05)，但數(shù)值均在實(shí)驗(yàn)室正常范圍內(nèi)，不認(rèn)為存在生物學(xué)意義；其他生化指標(biāo)均在實(shí)驗(yàn)室正常范圍內(nèi)，且與溶劑對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.3.4 大體解剖及病理組織學(xué)觀察結(jié)果

試驗(yàn)?zāi)┢诖笫蟠篌w解剖未見(jiàn)明顯異常。各試驗(yàn)組雄、雌大鼠的肝、脾、腎、睪丸等臟器濕重及臟體比與溶劑對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表10)。

表9 血生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表10 大鼠30 d喂養(yǎng)臟器濕重及臟體比結(jié)果

對(duì)大鼠肝、脾、腎、睪丸/卵巢、胃、腸的組織病理切片檢查結(jié)果顯示，高劑量組和溶劑對(duì)照組個(gè)別大鼠標(biāo)本可見(jiàn)肝小葉內(nèi)點(diǎn)狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)灶或肝臟匯管區(qū)內(nèi)點(diǎn)狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)灶(見(jiàn)圖1B、圖1C)，但所見(jiàn)病變程度輕，發(fā)生率低，且高劑量組的病變程度和發(fā)生率與溶劑對(duì)照組比較未見(jiàn)加重，屬于大鼠自發(fā)病變，未見(jiàn)高劑量組大鼠出現(xiàn)毒性相關(guān)的特異性病理改變。

注：A.溶劑對(duì)照組大鼠正常肝組織切片；B.高劑量組大鼠肝小葉內(nèi)點(diǎn)狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)；C.溶劑對(duì)照組大鼠肝臟匯管區(qū)點(diǎn)狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 結(jié) 論

本次試驗(yàn)條件下，復(fù)方翅果油急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，其對(duì)雄、雌小鼠的MTD均大于20 g/kg，根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于無(wú)毒級(jí)物質(zhì)；遺傳毒性試驗(yàn)階段，復(fù)方翅果油在體外、體內(nèi)兩個(gè)試驗(yàn)系統(tǒng)中，對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97、TA98、TA100、TA102無(wú)誘變陽(yáng)性，未見(jiàn)致小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核作用，也未觀察到致小鼠精子畸變作用，表明其對(duì)原核細(xì)胞、哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞與生殖細(xì)胞均未呈現(xiàn)遺傳毒性作用；亞急性毒性試驗(yàn)顯示，復(fù)方翅果油各劑量組大鼠在試驗(yàn)期間一般表現(xiàn)良好，體重及食物利用率等各項(xiàng)指標(biāo)正常，血常規(guī)及血生化各指標(biāo)均在實(shí)驗(yàn)室正常范圍內(nèi)，大鼠大體解剖與病理組織學(xué)檢查均未顯示特異性的病理改變。初步認(rèn)定復(fù)方翅果油無(wú)明顯毒副作用，可安全應(yīng)用于食品及保健食品。