段宏利， 蔣凌雁， 陳志堅(jiān)， 黃春瓊*

(1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院， 海南 ?？?570228； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 海口 571101)

我國南方雨水、光照條件優(yōu)越，但大多都為酸性土壤，鋁含量豐富[1]。鋁元素通常以氧化鋁或難溶性硅酸鹽的形式存在，對植物沒有毒害作用[2]；但是，當(dāng)土壤pH值<5時(shí)，鋁元素主要以Al3+的形式存在，對大多數(shù)植物都有毒害作用[3-4]。鋁對植物的毒害主要表現(xiàn)在根部，如：主根伸長受到抑制，根尖彎曲膨大[5]；此外，鋁脅迫也會影響植物對水分和其他元素的吸收[6]。因此，南方土壤中高濃度的Al3+是植物生長最主要的限制因素之一，鋁脅迫是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的重要科學(xué)問題。

狗牙根(Cynodondactylon(L.) Pers.)是禾本科狗牙根屬的C4型多年生草本植物，主要生長在熱帶及亞熱帶地區(qū)，是我國酸性土壤分布地區(qū)天然草地上常見的草種之一。該草種耐干旱和踐踏，有較強(qiáng)的繁殖能力和再生能力。狗牙根作為草坪草，已被廣泛應(yīng)用于公路護(hù)坡、庭院綠化、足球場和高爾夫球場建植等。同時(shí)，狗牙根也可作為優(yōu)質(zhì)牧草[7]，被牛羊等草食動(dòng)物采食。

本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，以耐鋁種質(zhì)狗牙根A22和敏鋁種質(zhì)狗牙根A326為研究材料，研究了不同時(shí)間、不同濃度鋁脅迫對狗牙根根長、鋁含量和營養(yǎng)元素吸收的影響，以期揭示狗牙根營養(yǎng)與耐鋁毒關(guān)系，為進(jìn)一步挖掘狗牙根耐鋁基因及在酸性土壤上開發(fā)利用狗牙根提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究利用前期篩選出的狗牙根耐鋁種質(zhì)A22(江蘇鹽城)及敏鋁種質(zhì)A326(廣西柳州)作為試驗(yàn)材料。這2份材料保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所草業(yè)研究室種質(zhì)資源圃。

1.2 試驗(yàn)材料處理

預(yù)培養(yǎng)：從試驗(yàn)種質(zhì)基地剪取大小、生長一致的帶有2個(gè)節(jié)的狗牙根匍匐莖，插于表面打孔的KT板上，其板上的孔可固定植株，把泡沫板架在盛有10 L 1/2Hoagland營養(yǎng)液(pH值5.8)的周轉(zhuǎn)箱上，營養(yǎng)液浸沒莖節(jié)，在大棚內(nèi)進(jìn)行水培生根，期間用增氧泵不斷通氣，以維持水中的氧含量。

鋁處理：參考李季膚等[8]鋁處理方法，預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，挑選根長5 cm左右、長勢一致的苗，在大棚溫室中鋁處理，期間用增氧泵不斷進(jìn)行通氣。在500 μM CaCl2溶液中，500 μM AlCl3鋁脅迫下，設(shè)計(jì)3個(gè)處理時(shí)間0 h，12 h，24 h；在24 h時(shí)，設(shè)4個(gè)不同的鋁處理濃度，分別為0(CK)，250，500，750 μM AlCl3(pH值4.0)。

1.3 指標(biāo)測定及數(shù)據(jù)處理

1.3.1相對根長測量 用根系掃描儀(EPSON，日本)掃描植株根長圖片(選擇最長根進(jìn)行測量)，參考羅佳佳等[9]方法進(jìn)行相對根長測定。使用ImageJ(National Institutes of Health，美國)軟件統(tǒng)計(jì)根長。將鋁處理前的根長記錄為RLAl0 h或RLCK0 h，鋁處理后記錄為RLAlnh或RLCKnh。

相對根長計(jì)算公式：(RLAlnh-RLAl0 h)/(RLCKnh-RLCK0 h)×100%

1.3.2鮮干重比測定 分別收取狗牙根根系及葉片，用濾紙吸去表面水分后稱重并記錄為鮮重。75℃烘干至恒重后稱重并記錄為干重。

鮮干比=鮮重/干重

1.3.3蘇木精染色 取鋁處理后的狗牙根，根尖先用去離子水浸泡15 min，再用0.5%蘇木素染劑-harris染色20 min，最后用去離子水浸洗10 min。取染色后的根尖在奧林巴斯顯微鏡SZX16下進(jìn)行觀察并拍攝圖片。

1.3.4狗牙根根系營養(yǎng)元素含量測定 采用微波消解ICP-AES法[10]測定狗牙根根系營養(yǎng)元素含量。收取狗牙根根系，105℃殺青30 min，75℃烘干至恒重，并將樣品粉碎。稱取根系樣品0.05 g左右置于消解管中，先加入4 mL超純水，再加入4 mL優(yōu)質(zhì)純硝酸和200 μL H2O2，預(yù)消解30 min，樣品經(jīng)微波消解后定容50 mL，混勻后靜置30 min，經(jīng)0.45 μL水相濾膜過濾后，分裝到儲存管(15 mL)備用，經(jīng)等離子發(fā)射光譜儀測定P，Ca，Mg，K，S，F(xiàn)e，Mn，Cu，Zn，B含量。

1.3.5數(shù)據(jù)處理 采用Word和Excel進(jìn)行記錄、統(tǒng)計(jì)，GraphPad Prism 7作圖，采用SPSS 25進(jìn)行分析，采用ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析；采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鋁處理時(shí)間對狗牙根根系的影響

2.1.1相對根長和鮮干比 圖1為不同鋁處理時(shí)間對狗牙根根系生長和鮮干比的影響。由圖1A可知，隨著鋁脅迫時(shí)間延長，A22和A326相對根長均呈減小趨勢。500 μM Alcl3處理12 h時(shí)，A22相對根伸長為67.7%，A326為59.6%；500 μM AlCl3處理24 h時(shí)，A22相對根伸長為58.4%，A326為38.7%。由此可知，隨著鋁脅迫時(shí)間的增加，根系伸長受抑制程度越大，A326受抑制程度大于A22，且鋁脅迫顯著抑制A326根系生長。

由圖1B可知，隨著鋁脅迫時(shí)間延長，A22和A326的鮮干比均先增加后減少，且都在鋁脅迫24 h時(shí)顯著減少。

圖1 不同鋁處理時(shí)間的狗牙根根系生長和鮮干比(500 μM AlCl3)

2.1.2鋁含量 圖2為不同鋁處理時(shí)間下狗牙根根系的蘇木精染色和鋁含量結(jié)果。有研究表明，蘇木精染色程度越深，說明根系鋁積累越多，根系受毒害越嚴(yán)重[11]。由圖2A所示，相對對照0 h鋁處理，根系蘇木精染色程度隨著鋁處理時(shí)間的延長而加深，在500 μM AlCl3鋁處理下，A22和A326根系蘇木精染色程度均為24 h時(shí)最深，且A326比A22染色更為明顯。

由圖2B所示，鋁處理時(shí)間越長，狗牙根根系鋁含量越大。在500 μM AlCl3鋁處理12 h和24 h情況下，A22的鋁含量無顯著增多，而A326的鋁含量顯著增多，說明敏鋁種質(zhì)受鋁毒害更深。

圖2 不同鋁處理時(shí)間下狗牙根根系蘇木精染色和鋁濃度分析(500 μM AlCl3)

2.1.3營養(yǎng)元素 由表1可知：不同時(shí)間鋁處理下，常量元素P的含量在A22和A326中均少于對照，其中A22與對照無顯著差異；而在A326中，P含量隨鋁處理時(shí)間的增加而減少，且在24 h時(shí)與對照呈顯著差異(P<0.05)。Ca含量在A22和A326中均少于對照，且在24 h時(shí)均與對照呈顯著差異。Mg，K含量在A22和A326中均顯著少于對照。S含量在A22中處理大于對照，但鋁處理12 h和24 h的差別很??；在A326中，S含量隨鋁處理時(shí)間的延長，在12 h時(shí)略有增加，24 h時(shí)顯著減少。Fe含量在A22和A326中均少于對照，且均隨處理時(shí)間的延長先減少而后增加；A22鋁處理與對照無顯著差異，A326鋁處理與對照呈顯著差異。

表1 不同時(shí)間鋁處理下狗牙根根系營養(yǎng)元素的含量(500 μM AlCl3)

微量元素Mn的含量在A22和A326中均隨鋁處理時(shí)間延長而減少，且鋁處理與對照呈顯著差異(P<0.05)。Cu含量在A22中鋁處理與對照無顯著差異，而在A326中顯著小于對照；隨處理時(shí)間的延長，Cu含量在A22中先增加后減小，而在A326中不斷減小。Zn的含量在A22和A326中鋁處理與對照均無顯著差異；隨處理時(shí)間的延長，Zn含量在A22中呈增加趨勢，而在A326中先增加后減小。B的含量在A22中鋁處理與對照無顯著差異；在A326中，24 h鋁處理顯著低于對照，且隨處理時(shí)間的延長，先減小后回升。

2.2 不同鋁處理濃度對狗牙根根系的影響

2.2.1相對根長和鮮干比 由圖3A可知，隨著鋁濃度增加，A22和A326相對根長減小，即根系伸長受抑制程度越大。在250，500，750 μM鋁處理24 h下，狗牙根A22相對根伸長分別為69.6%，58.4%和31.7%，A326相對根伸長分別為64.3%，38.7%和26.8%。在500 μM鋁脅迫時(shí)，A326根伸長已被顯著抑制，而A22在750 μM鋁脅迫時(shí)，根伸長才被顯著抑制。由此可知，敏鋁種質(zhì)A326根伸長受抑制程度更明顯。

由圖3B可知，狗牙根A22、A326隨鋁脅迫濃度增加，鮮干比出現(xiàn)先減少后增加。在鋁處理下，A22的鮮干比都顯著減小。

圖3 不同濃度鋁處理對狗牙根根系生長和鮮干比的影響(鋁處理24 h)

2.2.2鋁含量 由圖4A可知，相對對照0 h鋁處理，根系蘇木精染色程度隨著鋁處理濃度的增加而加深，且在750 μM鋁處理24 h下，A22,A326根系蘇木精染色程度最深。

從圖4B可知，在鋁處理24 h時(shí)，隨著鋁處理濃度的增加，狗牙根A22和A326根系鋁含量均增加，且在750 μM鋁處理下達(dá)到最高。鋁處理24 h下，狗牙根A22根系的鋁含量在750 μM鋁處理下時(shí)才顯著增多；而A326根系的鋁含量在500 μM時(shí)已顯著增多。

圖4 不同鋁處理濃度處理下狗牙根根系蘇木精染色和鋁濃度分析(鋁處理24 h)

2.2.3營養(yǎng)元素 由表2可知：隨鋁處理濃度的增加，常量元素P的含量在A22中不同濃度鋁處理均多于對照，但與對照均無顯著差異；在A326中，P含量先減少后增加，濃度為500 μM時(shí)與對照呈顯著減少(P<0.05)。Ca含量在A22中先增加后減少，在500 μM和750 μM鋁處理下顯著減少。Mg含量在A22中先增加后減少，在500 μM和750 μM鋁處理下顯著減少；在A326中，鋁處理均多于對照，且在750 μM鋁處理下顯著高于對照。K含量在A22和A326中，均多于對照。S含量在A22中，鋁處理均顯著增多；在A326中，在250 μM和750 μM鋁處理下顯著增多。Fe含量在A22和A326中均少于對照，且均與對照呈顯著差異。

表2 不同濃度鋁處理下狗牙根根系營養(yǎng)元素的含量(鋁處理24 h)

隨鋁處理濃度的增加，微量元素Mn的含量在A22和A326中，鋁處理均少于對照，在A22中，鋁處理與對照無顯著差異，而在A326中，鋁處理與對照均呈顯著差異。Cu含量在A22中，在250 μM和750 μM鋁處理下顯著減少；在A326中，在500 μM和750 μM鋁處理下顯著減少。Zn含量在A22中鋁處理均少于對照，而在A326中鋁處理均高于對照，但在A22和A32中鋁處理均與對照無顯著差異。B含量在A22和A326中均鋁處理與對照無顯著差異。

2.3 鋁脅迫下狗牙根根系鋁含量與營養(yǎng)元素的相關(guān)性

表3和表4分別為鋁脅迫下狗牙根A22和A326根系鋁含量與營養(yǎng)元素的相關(guān)性。表3結(jié)果表明，在A22中，S與Al呈正相關(guān)關(guān)系；Ca，Mg，K，F(xiàn)e，Mn和B與Al呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；P與Al呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Cu，Zn與Al呈負(fù)相關(guān)。表4結(jié)果表明，在A326中，P，Ca，Mg，K，S，F(xiàn)e，Mn，Cu，Zn，B與Al都呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中與Ca和Cu與Al呈顯著負(fù)相關(guān)。

表3 狗牙根A22根系鋁與營養(yǎng)元素含量的相關(guān)系數(shù)

表4 狗牙根A326根系鋁與營養(yǎng)元素含量的相關(guān)系數(shù)

3 討論

鋁脅迫限制植物根系的生長，任曉燕[12]研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫5 d，10 d和15 d，紫花苜蓿(MedicagosativaL.)幼苗的生長量明顯降低。根尖是植物對鋁最敏感的部位，根伸長的抑制是受Al毒害植物最重要的特征[13-14]，因此，植物根系伸長的抑制程度常作為鋁脅迫的重要指標(biāo)之一[15]。吳亞等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在鋁脅迫下多花黑麥草(LoliummultiflorumL.)的根長隨土壤鋁含量的升高而降低；許文花等[17]和姜娜等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在鋁處理下苜蓿根系生長均受到明顯的抑制。林雪瓊等[19]研究甜玉米(ZeamaysL.)耐鋁性的結(jié)果顯示,在用含鋁離子的營養(yǎng)液處理24 h后，耐鋁性較弱的甜玉米自交系根系相對伸長量明顯下降，表明其根系伸長受到鋁離子的明顯抑制。本研究表明，在不同時(shí)間鋁處理下，耐鋁種質(zhì)A22的相對根長無顯著降低，敏鋁種質(zhì)A326顯著降低；不同濃度鋁處理時(shí)，A22在750 μM處理時(shí)相對根長才顯著降低，而A326在500 μM處理時(shí)相對根長已顯著降低。說明敏鋁種質(zhì)A326根伸長受到的抑制遠(yuǎn)大于耐鋁種質(zhì)A22。

有研究報(bào)道，植物根尖鋁的積累量與植物對鋁脅迫的敏感程度有關(guān)，且耐鋁型植物根尖的鋁含量通常低于敏鋁型[20-21]。李嵐?jié)峓22]在紅三葉(Trifoliumpratense)中發(fā)現(xiàn)，與對照相比，鋁脅迫明顯提高了各品種根的鋁含量；張爭艷[23]在大豆(Glycinemax(L.) Merrill)中研究發(fā)現(xiàn)，耐鋁大豆‘浙春2號’根尖鋁含量較鋁敏感大豆‘浙春3號’低；除此之外，糧食作物如小麥(TriticumaestivumL.)[24]也發(fā)現(xiàn)隨鋁處理濃度的增加，根系的鋁含量增加。本試驗(yàn)與以上研究結(jié)果相似，數(shù)據(jù)顯示，隨著鋁處理時(shí)間延長和濃度增加，狗牙根A22和A326蘇木精的染色程度加深，鋁含量也隨之增加，且敏鋁種質(zhì)A326根系鋁含量多于耐鋁種質(zhì)A22。說明鋁脅迫促進(jìn)狗牙根根部鋁的積累，敏鋁種質(zhì)對鋁脅迫較耐鋁種質(zhì)更敏感。

鋁脅迫影響植物營養(yǎng)成分的吸收與積累[25]，應(yīng)小芳研究結(jié)果表明在大豆中發(fā)現(xiàn)，幼苗根系的營養(yǎng)元素含量隨鋁處理濃度的升高逐漸下降[26]。鋁過量會對植物根系P，Ca，Mg，K，F(xiàn)e和Cu等營養(yǎng)元素的積累和轉(zhuǎn)運(yùn)有不同程度的抑制[27-28]。除此之外，Al3+是陽離子通道阻斷劑，會影響植物對K的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累；還會阻斷植物對P和Cu等元素的吸收，造成植物營養(yǎng)元素的缺失，從而抑制植物的正常生長發(fā)育[29]。本研究表明，在狗牙根耐鋁種質(zhì)A22中，S與Al呈正相關(guān)關(guān)系，表明S的積累與Al的吸收是協(xié)同作用，而Ca，Mg，K，F(xiàn)e，Mn和B與Al呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Al的吸收是拮抗作用；在敏鋁種質(zhì)A326中，P，Ca，Mg，K，S，F(xiàn)e，Mn，Cu，Zn，B與Al都呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Al的吸收是拮抗作用。因此，在南方栽培草地的管理過程中，可以適當(dāng)增施Ca，Mg，K，F(xiàn)e，Mn和B肥，來緩解酸鋁的毒害作用。

4 結(jié)論

鋁脅迫抑制狗牙根根系的伸長，增加根系鋁的積累，抑制了狗牙根根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。敏鋁種質(zhì)A326較耐鋁種質(zhì)A22更易受到鋁的毒害，鋁處理下，A326根系伸長受抑制程度大于A22，根系鋁含量積累大于A22，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收少于A22。綜上所述，可以推斷A22和A326這兩個(gè)種質(zhì)可能存在基因型的差異。因此，在今后的研究中可以利用耐鋁性存在差異的狗牙根種質(zhì)作為研究材料，從基因水平上深入研究其耐鋁性機(jī)理，為揭示狗牙根耐鋁機(jī)理提供相關(guān)研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為在南方富酸鋁化土壤上種植的耐鋁型草坪草選育提供一定的理論依據(jù)。