楊 穎，金正雨，鄧永軍，區(qū)炳明，文 明

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550025；3.肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

【研究意義】大腸桿菌Nissle 1917(EscherichiacoliNissle 1917，EcN)作為益生菌使用已具有100多年的歷史[1]，其不含腸毒素、溶血素、細(xì)胞毒素等致病因子，無(wú)致突變、遺傳毒性及DNA損傷活性[2]，能合成細(xì)菌素和具有六鐵攝取系統(tǒng)以利于該菌株在腸道中與其他菌株競(jìng)爭(zhēng)[3]，此外，EcN可以利用復(fù)雜的機(jī)制靶向定殖腫瘤部位進(jìn)而用于腫瘤靶向治療[4]。因?yàn)镋cN的益生特性，其一直是德國(guó)等國(guó)家醫(yī)用藥品(Mutaflor?)的活性成分[5]，主要用于治療人類(lèi)消化道菌群失調(diào)的相關(guān)疾病[6-7]。隨著分子生物學(xué)和全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已完整注釋EcN的基因組序列[8]，基于此，更多EcN基因重組的研究構(gòu)建出具有新性質(zhì)的EcN衍生物，這將促進(jìn)其在未來(lái)成為生物活性分子載體或用于口服活疫苗開(kāi)發(fā)的載體系統(tǒng)[9-10]。【前人研究進(jìn)展】細(xì)菌鞭毛表面展呈技術(shù)是將外源抗原融合到鞭毛蛋白高變區(qū)，隨后構(gòu)建的嵌合鞭毛組裝成鞭毛絲，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌對(duì)外源抗原的展呈[11-12]。由于細(xì)菌鞭毛絲由成千上萬(wàn)個(gè)鞭毛蛋白單體組裝而成[13]，把外源抗原嵌合到鞭毛蛋白高變區(qū)，有利于外源抗原的大量表達(dá)，并且能利用鞭毛蛋白的佐劑效應(yīng)[14-15]，促進(jìn)機(jī)體對(duì)外源抗原的捕獲、加工和提呈?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】EcN具有發(fā)達(dá)的鞭毛系統(tǒng)，前期研究發(fā)現(xiàn)其鞭毛蛋白可以容許10個(gè)氨基酸的缺失和6個(gè)氨基酸外源抗原的插入[16]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為尋找外源抗原的其他可能插入位點(diǎn)，并嘗試插入更大片段的外源抗原，選用EcN無(wú)質(zhì)粒菌株(EcN cured of its two cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2，EcNc)，構(gòu)建EcNc鞭毛蛋白高變區(qū)隨機(jī)缺失質(zhì)粒庫(kù)，篩選可缺失位點(diǎn)和插入外源抗原進(jìn)行展呈，為EcN靶向投遞外源抗原提供操作策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 供試菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞的特征及來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 供試菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Marker購(gòu)自TaKaRa公司；TransStart FastPfu DNA Polymerase購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；MutExpress TM ⅡFast Mutagenesis Kit、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；BAL-31核酸酶購(gòu)自NEB(北京)有限公司；胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)均購(gòu)自O(shè)xoid公司；RPMI1640-F12(1∶1)細(xì)胞培養(yǎng)基、新生牛血清(NCS)均購(gòu)自Gibco(美國(guó))公司。

1.2 方法

1.2.1 EcNc fliC高變區(qū)隨機(jī)缺失質(zhì)粒庫(kù)的構(gòu)建SpeⅠ為fliC基因中部高變區(qū)內(nèi)唯一的酶切位點(diǎn)，選擇SpeⅠ單酶切pBR322-fliC重組質(zhì)粒，回收單一線性片段后，用Nuclease BAL-31經(jīng)不同時(shí)間(6、7、10、20 min)消化黏性末端，回收各時(shí)間段消化產(chǎn)物，用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow)大片段補(bǔ)齊黏性末端后，經(jīng)T4DNA ligase環(huán)化連接，轉(zhuǎn)化DH5α化學(xué)感受態(tài)，37 ℃培養(yǎng)1 h后加入10 mL LB(Amp)培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 fliC高變區(qū)缺失區(qū)域的篩選 將fliC高變區(qū)隨機(jī)缺失質(zhì)粒庫(kù)提取質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化EcNc ΔfliC感受態(tài)后，涂布LB(Amp)固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落接種半固體運(yùn)動(dòng)性平板[17]，檢測(cè)各菌株運(yùn)動(dòng)性能，并設(shè)計(jì)引物P1: 5′-ATGGCACAAGT CATTAATACCAACA，P2: TTAACCCTGCAGCAGAGACA GA-3′對(duì)相應(yīng)fliC基因進(jìn)行測(cè)序，分析缺失區(qū)域。

1.2.3 EcNc FliC高變區(qū)展呈外源抗原的構(gòu)建 設(shè)計(jì)引物P3: 5′-GCTGGGCAAACTGCTAGT-3′，P4：5′-TGCTACATCACCTGCTTTTGCT-3′，以pUC18-fliC質(zhì)粒為模板，進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增缺失fliC基因缺失910～927處的堿基序列；設(shè)計(jì)引物P5：5′-CAAAAGCAGGTGATGTAGCAAATGCATCTTATGCCGGTGT-3′，P6: 5′-CCACTAGCAGTTTGCCCAGCTACTCTTTGAA TCTGTCCGA-3′， 以F18菌株基因組為模板擴(kuò)增其FedF基因178～327位堿基序列；上述2種擴(kuò)增產(chǎn)物回收后混合，在Exnase?催化下，37 ℃反應(yīng)30 min完成重組反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)2個(gè)線性化DNA的體外環(huán)化，構(gòu)建pUC18-fliCF(fliCF片段為fliC基因910～927位插入F18FedF基因178～327位堿基序列的重組片段)，再將fliCF片段連接到自殺載體pRE112，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pRE112-fliCF并轉(zhuǎn)化EcNc，參照文獻(xiàn)[18]方法進(jìn)行重組菌株EcNcfliCF的篩選，并用引物P1、P2進(jìn)行fliCF序列擴(kuò)增和測(cè)序鑒定。

1.2.4 透射電鏡和運(yùn)動(dòng)性觀察 將EcNc與EcNcfliCF過(guò)夜培養(yǎng)的菌液分別1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮的LB中，37 ℃震搖培養(yǎng)至OD600nm約為1.0，各細(xì)菌均調(diào)整為1.0，參照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行電鏡觀察和運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)。

1.2.5 IPEC-J2 細(xì)胞黏附試驗(yàn) 調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌濃度至1×106CFU，以10∶1的比例加入96孔板中的單層IPEC-J2 細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中共孵育1 h，用PBS洗滌孵育孔3次，去除未黏附的細(xì)菌，然后加入0.5%的Triton X-100裂解液，37 ℃作用20 min裂解細(xì)胞獲得其表面黏附的細(xì)菌，梯度稀釋涂布LB平板，培養(yǎng)過(guò)夜后計(jì)算黏附細(xì)菌數(shù)目，利用Graphpad軟件作圖并分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 fliC高變區(qū)隨機(jī)缺失質(zhì)粒庫(kù)的構(gòu)建

提取質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果(圖1)表明，Nuclease BAL-31經(jīng)不同時(shí)間(6、7、10、20 min)消化EcNcfliC高變區(qū)、再經(jīng)補(bǔ)齊黏性末端環(huán)化轉(zhuǎn)化DH5α化學(xué)感受態(tài)后，質(zhì)粒提取物在瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)彌散條帶，表明EcNcfliC高變區(qū)出現(xiàn)不同程度的缺失，獲得EcNcfliC高變區(qū)隨機(jī)缺失質(zhì)粒庫(kù)。

M: λ-EcoT14 I digest; 1～4: 經(jīng)Nuclease BAL-31分別消化6、7、10、20 min構(gòu)建的質(zhì)粒庫(kù); 5: pBR322-fliC; 6: pBR322M: λ-EcoT14 I digest; 1-4: The plasmids library is constructed by digestion of Nuclease BAL-31 for 6, 7, 10 and 20 minutes respectively; 5: pBR322-fliC; 6: pBR322圖1 EcNc fliC高變區(qū)隨機(jī)缺失質(zhì)粒庫(kù)鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of random deletion plasmid library in hypervariable region of EcNc fliC

2.2 fliC基因高變區(qū)缺失區(qū)域的篩選

從圖2看出，EcNcfliC高變區(qū)隨機(jī)缺失質(zhì)粒庫(kù)電轉(zhuǎn)化EcNc ΔfliC感受態(tài)后，挑取過(guò)夜培養(yǎng)的單菌落接種半固體運(yùn)動(dòng)性平板，運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)顯示，大部分菌株未呈運(yùn)動(dòng)性(圖2-A,2-B)；擴(kuò)增相應(yīng)fliC序列測(cè)序結(jié)果顯示，大部分高變區(qū)隨機(jī)缺失的區(qū)域?yàn)榉?的整數(shù)倍缺失(圖3)；試驗(yàn)篩選到一株fliC高變區(qū)缺失菌株具有運(yùn)動(dòng)性(圖2-C)，經(jīng)測(cè)序其fliC基因缺失910～927 bp處堿基序列(圖3)。

圖2 部分菌株運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Motility detection of some EcNc strains

圖3 部分EcNc fliC高變區(qū)缺失區(qū)域Fig.3 Hypervariable region deleted area of fliC of some EcNc strains

2.3 重組菌株EcNcfliCF的構(gòu)建

利用 MutExpress TM ⅡFast Mutagenesis Kit，構(gòu)建fliC基因910～927位嵌合F18 FedF基因178～327位堿基序列的重組片段fliCF，將fliCF連接入自殺載體pRE112中轉(zhuǎn)化到EcNc，2次重組后經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示，重組菌EcNcfliCF構(gòu)建正確。

2.4 重組菌株EcNcfliCF表型的檢測(cè)

從圖4可知，EcNcfliCF重組菌株在電鏡下能觀察到鞭毛絲，但在運(yùn)動(dòng)平板上無(wú)運(yùn)動(dòng)性能。

圖4 重組菌株EcNc和EcNcfliCF的表型Fig.4 Phenotypes of EcNc and EcNcfliCF

2.5 IPEC-J2細(xì)胞黏附檢測(cè)

從圖5可知，相對(duì)EcNc，EcNcfliCF對(duì) IPEC-J2細(xì)胞的黏附能力減少約0.28%，差異不顯著(P>0.05)。

圖5 重組菌株對(duì)IPEC-J2的黏附指數(shù)(EcNc的黏附指數(shù)假設(shè)為100%)Fig.5 Bacterial adherence to IPEC-J2 cells (EcNc strain adhesion index is assumed as 100%)

3 討 論

益生菌通過(guò)不同機(jī)制預(yù)防和控制胃腸道致病菌感染，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能和產(chǎn)量，作為抗生素促進(jìn)劑的替代物越來(lái)越受到關(guān)注。自Alfred Nissle發(fā)現(xiàn)攝入特定的大腸桿菌菌株可以治療感染性疾病患者起，EcN菌株作為益生菌被應(yīng)用于防治人類(lèi)疾病。楊穎等[19-22]從豬糞便中分離到EcN，其能持續(xù)在豬體內(nèi)定殖，該菌株可以保護(hù)豬宿主免受產(chǎn)毒素大腸桿菌的侵害，EcN對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用有賴于其F1C菌毛和鞭毛介導(dǎo)的對(duì)有害菌株的黏附抑制[22]。

EcN鞭毛絲含有大量鞭毛蛋白單體，在前期研究中發(fā)現(xiàn)可利用鞭毛蛋白展呈技術(shù)將外源抗原展呈于EcN表面，重組EcN菌株定殖于機(jī)體發(fā)揮益生作用的同時(shí)，還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)外源抗原的體液及黏膜免疫應(yīng)答[23]。但是不同血清型的細(xì)菌，其鞭毛蛋白尤其是高變區(qū)氨基酸差異極大，使用鞭毛蛋白展呈技術(shù)需要確定較好的外源抗原插入位點(diǎn)，進(jìn)而優(yōu)化外源抗原的展呈效果。故本研究基于鞭毛蛋白構(gòu)建重組質(zhì)粒，產(chǎn)生高變區(qū)隨機(jī)缺失的質(zhì)粒庫(kù)，篩選鞭毛蛋白可缺失的區(qū)域(fliC基因缺失910～927 bp處堿基序列)，該區(qū)域缺失后，并不影響菌株鞭毛絲的形成和運(yùn)動(dòng)能力。EcN含有2種隱性質(zhì)粒，分別命名為pMUT1和pMUT2，前期研究中，已構(gòu)建無(wú)質(zhì)粒的EcN變體(EcNc)，其生物學(xué)特征與野生型EcN菌株沒(méi)有區(qū)別，可以更好地用作基因工程活載體菌[24]。

EcNc已被證明可以通過(guò)其鞭毛系統(tǒng)展呈6His標(biāo)簽[16]。EcNc鞭毛蛋白高變區(qū)較長(zhǎng)，位于195～320 aa處。本研究基于篩選到的EcNc鞭毛蛋白可缺失區(qū)域(910～927 bp處堿基序列)，在該缺失區(qū)域處插入F18大腸桿菌黏附素FedF亞單位與仔豬小腸上皮細(xì)胞相互作用的受體結(jié)合域(60～109位氨基酸殘基區(qū)段)，成功將FedF亞單位受體結(jié)合域的50個(gè)氨基酸展呈于EcNc表面。構(gòu)建的重組菌株EcNcfliCF能夠形成鞭毛絲，雖然不具備運(yùn)動(dòng)能力，但不影響其對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附能力；且在EcNc鞭毛蛋白高變區(qū)插入50個(gè)氨基酸，與6His標(biāo)簽的長(zhǎng)度比較有了顯著的容納性，大大提升插入容量。

4 結(jié) 論

研究成功將FedF亞單位受體結(jié)合域的50個(gè)氨基酸展呈于EcNc表面，這為后期進(jìn)一步篩選鞭毛蛋白高變區(qū)其他缺失區(qū)域，和基于已篩選位點(diǎn)插入展呈其他外源抗原，優(yōu)化構(gòu)建遺傳穩(wěn)定、定植力強(qiáng)的功能性益生菌打下基礎(chǔ)。