孫勝君，張昌蓮，趙自云

(1.煙臺市煙臺山醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 煙臺264000;2.山東省榮成市人民醫(yī)院 輸血科，山東 榮成264300;3.青島市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 青島266042)

肺炎克雷伯菌(KP)是醫(yī)院內(nèi)僅次于大腸埃希菌的第二大條件致病菌[1]，可引起肺炎、腦膜炎、敗血癥等疾病。碳青霉烯類藥物由于具有較廣且較強(qiáng)的抗菌活性，已成為治療重癥感染的最后一道防線藥物。但隨著碳青霉烯類藥物在臨床的長期使用，碳青霉烯耐藥腸桿菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)尤其是碳青霉烯耐藥KP(Carbapenem-resistantK.pneumoniae,CRKP)已在全球多個(gè)國家出現(xiàn)[2-3]。在我國，KP對碳青霉烯類藥物的耐藥率約為11%[1]。KP對碳青霉烯類藥物耐藥主要是由產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶引起的。近年來，產(chǎn)NDM型金屬酶的CRKP菌株開始呈現(xiàn)[3]。由于細(xì)菌耐藥具有地域性，不同地域細(xì)菌的耐藥性不同，所攜帶的碳青霉烯耐藥基因可能也不同，不同組織樣本細(xì)菌的耐藥等特性也不盡相同。隨著臨床中CRKP檢出率的升高，了解本地區(qū)CRKP的耐藥譜和耐藥基因型等特性，可指導(dǎo)臨床醫(yī)生正確選擇抗菌藥物減少抗菌藥物的濫用，也可減少多重耐藥CRKP的出現(xiàn)，降低醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的發(fā)病率和死亡率。為了解本地區(qū)不同組織來源CRKP菌株的耐藥情況和流行特征，本研究對臨床分離的CRKP耐藥表型進(jìn)行總結(jié)分析，并檢測了菌株的碳青霉烯耐藥機(jī)制和分子分型，為臨床抗感染治療提供流行病學(xué)資料。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2017年5月至2021年4月部分住院患者痰液、尿液和血液感染性標(biāo)本，剔除同一患者的重復(fù)菌株。

1.2 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)

參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行細(xì)菌的分離、培養(yǎng)，菌株鑒定和藥敏試驗(yàn)采用VITEK-2compact全自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行測定，共獲得了55株CRKP。測定了CRKP菌株對18種抗菌藥物的敏感性，其中頭孢哌酮采用紙片法進(jìn)行測定，藥敏結(jié)果按文獻(xiàn)[4]進(jìn)行判讀，替加環(huán)素耐藥折點(diǎn)參照歐洲藥敏試驗(yàn)委員會2017年版標(biāo)準(zhǔn)(http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.3 碳青霉烯耐藥基因檢測

通過水煮法提取CRKP菌株的DNA,保存于-20℃?zhèn)溆茫鶕?jù)碳青霉烯酶及金屬酶相關(guān)基因(blaKPC-2，blaIMP，blaSPM，blaAIM，blaVIM，blaOXA，blaGIM，blaBIC，blaSIM，blaNDM和blaDIM)引物序列及PCR反應(yīng)體系對CRKP菌株進(jìn)行PCR檢測，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min,(95℃,30 s+52℃,40 s+72℃,50 s)×35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在100V電壓下用2%瓊脂糖電泳1小時(shí)。經(jīng)電泳鑒定的PCR 產(chǎn)物送至青島派森諾基因科技有限公司測序，測序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行blast序列比對確認(rèn)目的基因。

1.4 CRKP的MLST分析

在55株CRKP菌株中，隨機(jī)挑選27株進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)，分析CRKP菌株的親緣關(guān)系和流行亞型，即對KP的7個(gè)管家基因rpoB，gapA，mdh，pgi，phoE，infB和tonB進(jìn)行PCR檢測[5]。PCR產(chǎn)物送青島派森諾基因科技有限公司測序，7個(gè)管家基因序列分別提交至Institute Pasteur’s MLST數(shù)據(jù)庫 (https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef&page=sequenceQuery)確認(rèn)菌株的MLST亞型。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

使用Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入，采用SPSS 17.0軟件，計(jì)數(shù)資料用(百分率)表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株來源

2017年5月至2021年4月收集的CRKP菌株剔除重復(fù)后共獲得菌株55株，其中來自尿液標(biāo)本14株，占25.5%，痰液標(biāo)本31株，占56.4%，血液標(biāo)本10株，占18.2%。

2.2 CRKP菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

55株CRKP菌株對亞胺培南和美羅培南兩種碳青霉烯類藥物均耐藥。從表1可以看出，CRKP對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢西丁、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟和氨曲南9種β-內(nèi)酰胺類藥物或β-內(nèi)酰胺類-酶抑制劑的耐藥率均達(dá)到98.2%。在氨基糖苷類藥物中，CRKP對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率分別為54.5%和74.5%。在氟喹諾酮類藥物中，CRKP對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率均高于74.5%以上，受試菌株對復(fù)方新諾明的耐藥率也達(dá)到了69.1%。55株CRKP中并未發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素和多黏菌素耐藥的菌株。

分別來自尿液、痰液和血液的CRKP對包括碳青霉烯類藥物在內(nèi)的11種β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率均在96.8%以上，且這11種β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率在三種來源CRKP中并無顯著性差異。此外，三種來源CRKP對氨基糖苷類藥物、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、替加環(huán)素和多黏菌素6種藥物的耐藥率也無顯著性差異。值得注意的是，血液來源CRKP對左氧氟沙星的耐藥率已達(dá)100%，且顯著高于痰液CRKP的耐藥率61.3%(P<0.05)，而與尿液CRKP對左氧氟沙星的耐藥率85.7%并無顯著性差異(表1)。

表1 不同標(biāo)本來源CRKP菌株的耐藥率結(jié)果

在55株CRKP中，有多達(dá)45株(81.8%)表現(xiàn)為多重耐藥，且以β內(nèi)酰胺類-氨基糖苷類-氟喹諾酮類-復(fù)方新諾明四重耐藥(45.5%)和β內(nèi)酰胺類-氨基糖苷類-氟喹諾酮類三重耐藥(27.3%)表型最為流行(表2)。55株CRKP中只有2株菌僅對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥。

表2 CRKP菌株的多重耐藥情況

2.3 碳青霉烯耐藥基因及分子分型

55株CRKP菌株全部攜帶碳青霉烯耐藥基因，其中blaKPC-250株(90.9%)最為流行,5株菌中檢測到blaNDM，并未發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶blaKPC-2和blaNDM的菌株，也并未發(fā)現(xiàn)其他碳青霉烯耐藥基因。blaKPC-2在痰液、尿液和血液CRKP中均是流行基因型，blaNDM只在尿液和痰液CRKP中有檢出且痰液CRKP菌株中blaNDM的流行率達(dá)12.9%(表3)。

表3 不同樣本類型CRKP中碳青霉烯耐藥基因攜帶率

在隨機(jī)挑選的27株CRKP中，有25株已確定MLST型，共獲得10種不同的亞型。在確認(rèn)的10種MLST亞型中，ST11、ST23和ST15型最為流行，檢出率分別為22.2%、22.2%和14.8%。ST1083、ST35、ST17、ST2004和ST432檢出率較低，分別只在一株菌中檢出(表4)。

表4 27株CRKP菌株中各MLST亞型分布

3 討論

目前，細(xì)菌感染的檢測是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中很重要的工作，細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果對指導(dǎo)臨床抗感染治療至關(guān)重要。本文研究了55株CRKP的藥敏及耐藥特征，該55株CRKP菌株對包括碳青霉烯類和頭孢菌素類藥物在內(nèi)β-內(nèi)酰胺類藥物均耐藥，這對全部β-內(nèi)酰胺類藥物在臨床中的應(yīng)用構(gòu)成了極大的威脅。菌株對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥率均高于70%以上，這嚴(yán)重影響了氟喹諾酮類藥物在CRKP感染中的治療作用，菌株對氟喹諾酮類藥物的高耐藥率可能與該類藥物在臨床中的長期使用引起喹諾酮耐藥決定區(qū)的突變有關(guān)[6]。本研究中CRKP菌株對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率分別高于54.5%和74.5%，這可能與菌株產(chǎn)生鈍化酶有關(guān)。多黏菌素和替加環(huán)素是治療革蘭陰性菌引起感染的最后防線藥物[7]，本研究中CRKP菌株對多黏菌素和替加環(huán)素均100%敏感，因此，在治療CRKP引起的感染中可選用這兩種藥物進(jìn)行治療。

本研究在55株CRKP菌株中全部檢測到碳青霉烯耐藥基因，其中KPC-2型和NDM型酶是本地區(qū)CRKP的主要碳青霉烯酶，這與我國其他地區(qū)腸桿菌對碳青霉烯耐藥的研究結(jié)果類似[3]。但這一結(jié)果與歐洲國家CRE中碳青霉烯酶的流行情況不同，在歐洲國家中只有71%的CRE菌株攜帶碳青霉烯酶[8]。本研究中CRKP的MLST型呈現(xiàn)多樣性，但以ST11型和ST23型為CRKP的主要亞型，ST11型CRKP也是目前全球包括我國在內(nèi)的主要流行亞型[3]，但ST23型在我國有增多的趨勢，也成為某些地區(qū)CRKP的主要亞型[3]。

綜上所述，臨床標(biāo)本中分離的CRKP耐藥嚴(yán)重，常表現(xiàn)為多重耐藥，其對碳青霉烯耐藥主要是由KPC-2酶引起的。但近年來NDM型酶也逐漸增多，同時(shí)，CRKP的MLST型呈現(xiàn)多樣性。因此，我們要密切關(guān)注KP的耐藥表型和基因型的變化，多為臨床抗感染提供有價(jià)值的信息，共同應(yīng)對細(xì)菌性感染性疾病的挑戰(zhàn)。