張婷,王國強(qiáng)

(1.中國刑事警察學(xué)院 刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院,沈陽 110035;2.江蘇連云港市公安局刑警支隊,連云港 222000)

氟乙酸鹽是一類劇毒含氟殺鼠劑,屬于A 級有機(jī)劇毒物質(zhì),低濃度水平即可引起人畜中毒死亡,人口服致死量為0.7～5 mg·kg－1。我國已禁止生產(chǎn)氟乙酸鹽,并且出臺了嚴(yán)格的管理措施,但由于其制備簡單、價格低廉、滅鼠效果明顯,該類鼠藥還可能會在非正規(guī)市場上或者以流動人員兜售等形式出現(xiàn),由此造成人、畜一次中毒和二次中毒事件時有發(fā)生,因此有必要開發(fā)一種快速、靈敏地測定生物檢材中氟乙酸鹽含量的方法。

氟乙酸鹽中毒生物檢材的測定方法主要有氣相色譜法[1-2]、氣相色譜-質(zhì)譜法[3-4]、離子色譜法[5]、離子色譜-質(zhì)譜法[6]、液相色譜法[7-8]、液相色譜-質(zhì)譜法[9-12]、核磁共振法[13]。而非衍生化法的前處理方法只適用離子色譜法、離子色譜-質(zhì)譜法、液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法分析,盡管操作過程簡單,但氟乙酸根的相對分子質(zhì)量小,中毒檢材中含量低,且容易與生物檢材中內(nèi)源性組分質(zhì)量數(shù)混淆,進(jìn)而產(chǎn)生分析干擾。因此,衍生化處理后進(jìn)行分析可保證結(jié)果的準(zhǔn)確度。以往生物檢材前處理先進(jìn)行極性溶劑液液萃取(LLE)、離子型固相萃取(SPE)等提取凈化預(yù)處理,再開始衍生化操作,但是由于氟乙酸鹽水溶性強(qiáng),提取和凈化過程物質(zhì)損失較大,基質(zhì)干擾嚴(yán)重,前處理并衍生化操作后的靈敏度不高。衍生化反應(yīng)試劑有很多,可分為酰胺類衍生化試劑和酯類衍生化試劑。其中2,4-二氯苯胺法、N,N-二乙基對苯二胺法、四丁基溴化胺催化的α-溴苯乙酮法、硫酸催化乙醇酯化法、五氟芐基溴法等均可以進(jìn)行氟乙酸鹽衍生化操作,鹵代烷烴五氟芐基溴試劑是最為常用的衍生化試劑,使用該試劑操作簡便、靈敏度較高,國內(nèi)公安部門常采用[14]。鑒于此,本工作用乙腈沉淀蛋白,以Qu ECh ERS 進(jìn)一步去除雜質(zhì),采用衍生化-在線凝膠色譜(GPC)凈化-氣相色譜-質(zhì)譜法測定血液檢材中氟乙酸鹽的含量,以期為相關(guān)案件中氟乙酸鹽含量的準(zhǔn)確測定提供方法參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

2010ULTRA 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;LC-20AD型在線凝膠色譜凈化系統(tǒng);LP微型旋渦混勻器;2-16KL型高速離心機(jī)。

氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.0 g·L－1。

含10%(體積分?jǐn)?shù),下同)五氟芐基溴的乙腈溶液;丙酮、乙腈、環(huán)己烷均為色譜純;鹽酸、氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉均為分析純;試驗用水為二次雙蒸水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 在線GPC條件

Shodex CLNpak EV-200凝膠色譜柱(10 cm×0.25 mm,0.25μm);柱溫40 ℃;檢測波長210 nm;流動相為體積比7∶3的丙酮-環(huán)己烷混合溶液;流量0.1 mL·min－1;進(jìn)樣體積20μL;樣品采集時間4.06～6.06 min。

1.2.2 色譜條件

DB-35ms色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);載氣為高純氦氣,純度99.999%。大體積程序升溫汽化進(jìn)樣口(PTV),進(jìn)樣口升溫程序:初始溫度120 ℃,保持5.0 min;以速率100 ℃·min－1升溫至250 ℃,保持31.7 min。恒壓模式;不分流進(jìn)樣。柱升溫程序:初始溫度82 ℃,保持5.0 min;以速率8 ℃·min－1升溫至310 ℃,保持11.8 min。

1.2.3 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子(EI)源,電子能量70 eV;離子源溫度200 ℃,接口溫度250 ℃;掃描時間10.0～40.0 min;掃描范圍 質(zhì)荷比(m/z)45～450;溶劑延遲時間9.5 min。

1.3 試驗方法

取1 mL血樣,按乙腈-血液體積比1∶1的比例加入1 mL 乙腈,混勻后渦旋3 min,以轉(zhuǎn)速9 000 r·min－1離心5 min。分取上清液1.5 mL,加入6 mol·m L－1鹽酸溶液100μL,調(diào)節(jié)溶液酸度至p H＜2,加入氯化鈉0.3 g,使溶液過飽和,渦旋3 min,以轉(zhuǎn)速9 000 r·min－1離心5 min。分取上清液1.0 mL,加入0.1 g碳酸鈉、0.2 g無水硫酸鈉和含10%五氟芐基溴的乙腈溶液50μL,于65℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)液過0.25μm 濾膜,分取20μL 濾液,按照1.2節(jié)儀器工作條件測定。隨同制備空白樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的選擇

血液樣品基體復(fù)雜,不僅含有蛋白質(zhì)、脂肪、水、色素等雜質(zhì),還含有與氟乙酸鹽極性相近的物質(zhì)。為了提高樣品提取和富集效果,使測定結(jié)果更準(zhǔn)確,試驗依次采用乙腈沉淀蛋白,QuECh ERS脫水、去脂,在線GPC凈化去除血液提取液中與待測物極性相近的成分。

2.1.1 蛋白沉淀法

常用的蛋白沉淀法有酸沉淀法和有機(jī)溶劑沉淀法。由于氟乙酸鈉在酸性條件下不穩(wěn)定,試驗采用乙腈沉淀、高速離心分離的方法去除蛋白質(zhì),并考察了乙腈-血液體積比分別為1∶2,1∶1,2∶1,3∶1時對50μg·L－1加標(biāo)血液樣品蛋白沉淀效果的影響。結(jié)果顯示:乙腈-血液體積比為1∶2時,上清液渾濁,沉淀不完全;乙腈-血液體積比為1∶1和2∶1時,上清液澄清,表明沉淀較為完全,但乙腈-血液體積比2∶1時,溶液體積增大,檢測靈敏度下降;體積比為3∶1時,溶液出現(xiàn)分層現(xiàn)象,回收率不佳。因此,試驗選擇加入與血液等體積的乙腈沉淀蛋白。

2.1.2 QuEChERS

Qu ECh ERS為食品檢測領(lǐng)域脫水、去脂的常用方法[15-16],試驗選擇在去除蛋白后的樣品溶液中加入碳酸鈉、無水硫酸鈉和氯化鈉,用于吸收水分和形成鹽析作用,使氟乙酸衍生化產(chǎn)物盡可能地溶解在有機(jī)溶劑中,進(jìn)而提高氟乙酸鹽的回收率。

2.1.3 在線GPC凈化

利用空間排阻原理,GPC 可分離體積大小不同的分子[17],試驗采用在線GPC 去除血液提取液中與待測物極性相近的成分,但是凈化效果受進(jìn)樣體積和采樣時間影響較大。因此,試驗考察了空白血液提取液進(jìn)樣體積分別為10,20,50μL 時對GPC色譜響應(yīng)的影響,結(jié)果見圖1。

由圖1可知:當(dāng)進(jìn)樣體積為10μL 時,GPC 色譜響應(yīng)靈敏度較低,不利于樣品采集;當(dāng)進(jìn)樣體積為20μL,響應(yīng)靈敏度較好,雜質(zhì)出峰更徹底;當(dāng)進(jìn)樣體積為50μL時,色譜峰出現(xiàn)出峰遲滯現(xiàn)象,推測與色譜柱容量過載有關(guān)。因此,試驗選擇的進(jìn)樣體積為20μL。

圖1 不同進(jìn)樣體積下空白樣品溶液的GPC色譜圖Fig.1 GPC chromatograms of the blank sample solution with different inject volumes

按照1.2.1節(jié)在線GPC條件分析空白樣品溶液和空白加標(biāo)樣品溶液(加標(biāo)量50μg·L－1),色譜圖見圖2。

結(jié)果顯示:GPC色譜圖按照出峰時間共有3段色譜峰。其中,2.41～3.80 min出峰的組分為血液基體,成分復(fù)雜,含有蛋白質(zhì)、脂肪、色素等大分子雜質(zhì);3.80～4.16 min和4.16～5.74 min內(nèi)出峰的組分為含有氟乙酸衍生化產(chǎn)物的待測溶液。但從圖2(曲線1)中發(fā)現(xiàn),空白樣品溶液的GPC 色譜圖也在此處有色譜峰,說明還有相對分子質(zhì)量相似的小分子干擾物在這兩個時間段內(nèi)出現(xiàn)。因此,擴(kuò)展并細(xì)化采樣節(jié)點(diǎn),3.05～5.05 min,3.74～5.04 min,4.06～6.06 min等3 個采樣時間段以及未經(jīng)GPC凈化所得空白樣品溶液的總離子流色譜圖見圖3。

圖2 空白樣品溶液和空白加標(biāo)樣品溶液的GPC色譜圖Fig.2 GPC chromatograms of the blank sample solution and the blank spiked sample solution

由圖3可知,未經(jīng)GPC 凈化的血液雜質(zhì)最多。經(jīng)GPC凈化后分別于3個時間段取樣,其中3.05～5.05 min涵蓋了血液基質(zhì)大部分雜質(zhì),色譜峰雜質(zhì)并未減少;3.74～5.04 min明顯看到的雜質(zhì)峰減少;4.06～6.06 min的雜質(zhì)最少。由此分析可知,血液中大分子雜質(zhì)主要集中在3.74 min之前出峰。結(jié)合圖2中氟乙酸衍生化產(chǎn)物的GPC出峰時間,確定最終的GPC取樣時間為4.06～6.06 min。

圖3 不同GPC采樣時間段以及未經(jīng)GPC凈化所得空白樣品溶液的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatograms of the blank sample solutions with different GPC sampling time intervals and without GPC purification

2.2 色譜行為

樣品溶液經(jīng)在線GPC 凈化后,無需濃縮,直接通過大體積PTV 進(jìn)樣分析。PTV 的進(jìn)樣體積可達(dá)到20μL,并能在程序升溫條件下不分流進(jìn)樣,檢出限會顯著降低,適合分析沸點(diǎn)范圍寬及熱不穩(wěn)定樣品。在優(yōu)化的試驗條件下,空白樣品溶液以及空白加標(biāo)樣品溶液(加標(biāo)量50μg·L－1)的總離子流色譜圖見圖4。

圖4 空白樣品溶液和空白加標(biāo)樣品溶液的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatograms of the blank sample solution and the blank spiked sample solution

2.3 工作曲線、檢出限和測定下限

在空白樣品中添加氟乙酸鈉,配制成10,20,40,80,160,320μg·L－1的加標(biāo)樣品溶液系列,按照試驗方法測定。以氟乙酸鈉的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線,所得工作曲線的線性范圍為10～320μg·L－1,線性回歸方程為y＝1.236x＋2.307,相關(guān)系數(shù)為0.997 9。

按照試驗方法分析加標(biāo)樣品溶液(加標(biāo)量10μg·L－1),以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),所得結(jié)果為2.9μg·L－1。

2.4 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白樣品進(jìn)行3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗,每個濃度水平分別于1 d內(nèi)連續(xù)測定5次和連續(xù)5 d測定,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗結(jié)果(n=5)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n=5)

由表1 可知,氟乙酸鈉的回收率為71.4%～80.5%,測定值的日內(nèi)RSD 為5.1%～6.7%,日間RSD 為5.3%～7.7%,方法的準(zhǔn)確度和精密度符合毒物分析要求[18]。

2.5 樣品分析

從疑似中毒并搶救后死亡的死者身上取血樣,按照試驗方法分析。結(jié)果表明,血液檢材中檢出氟乙酸鹽,檢出量為0.61 mg·L－1,這與已經(jīng)報道的案件中死者膽汁中氟乙酸鈉質(zhì)量濃度為0.2 mg·L－1[19],以及家兔口服2 mg·kg－1氟乙酸鈉引起死亡時血液濃度為0.67 mg·L－1相一致,推測死者的致死原因為氟乙酸類鼠藥中毒,說明該方法能滿足毒物快速檢測的要求。

本工作采用衍生化-在線GPC 凈化-氣相色譜-質(zhì)譜法測定血液中氟乙酸鹽的含量,該方法快速、高效,可用于低含量氟乙酸鹽中毒血液的定性和定量檢驗。