張云峰，董林沛，趙 森，孫 龍，常 靖，任昕昕，王愛華

（1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.浙江警察學(xué)院，浙江 杭州 310053；3.北京清譜科技有限公司，北京 100084）

強極性農(nóng)藥（如百草枯、草甘膦等農(nóng)藥）由于性能高效、價格低廉，曾在全球范圍內(nèi)廣泛使用，其引發(fā)的投毒、誤服、自殺等中毒（案）事件時有發(fā)生［1］。強極性農(nóng)藥特別是百草枯等對人和動物具有極高的毒性，會對人體造成不可逆的嚴(yán)重?fù)p害，目前尚無特效解毒劑，中毒致死率非常高［2－3］。目前大部分強極性農(nóng)藥和類似的致毒強極性物質(zhì)已被國家管控或停止銷售，但仍有不法分子違規(guī)生產(chǎn)和銷售禁用物質(zhì)，導(dǎo)致社會上頻繁出現(xiàn)百草枯、草甘膦等強極性物質(zhì)中毒事件［3－4］，強極性藥物如氯化琥珀膽堿則時常在致死案件中出現(xiàn)［5－6］。及時發(fā)現(xiàn)中毒物質(zhì)可為中毒者救治方案的制定提供幫助，這對檢驗中毒人員體內(nèi)毒物的儀器和方法提出了很高的時效性要求。

目前檢測百草枯、敵草快、草甘膦、草銨膦、氯化琥珀膽堿幾種強極性物質(zhì)的主要方法為液相色譜法（LC）和氣相色譜法（GC）［7－12］。由于這幾種物質(zhì)極易溶于水，揮發(fā)性差，分子量小，且在氣相會形成不同極性的離子，故同時檢測的難度相比于其他物質(zhì)有所增加［13］。色譜法需配合復(fù)雜的前處理，且分離時間較長，影響中毒人員的即時診斷與救治［14－16］。針對中毒人員體內(nèi)毒物的分析，需要更加快速的檢測手段，同時要保證準(zhǔn)確性，避免錯誤結(jié)果所帶來的誤診和錯誤治療［17］。

自2004年Cooks等開發(fā)出能夠原位電離的解吸附電噴霧電離源（DESI）以來［18］，原位電離技術(shù)取得了快速發(fā)展，各種原位電離技術(shù)被開發(fā)出來并應(yīng)用于不同領(lǐng)域［19－21］。原位電離方法是指無需樣品前處理，直接對樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測的方法［22］，極大提高了檢測的便捷性和時效性。紙噴霧技術(shù)作為原位電離的一個熱門方向，因成本低廉、操作簡單、分析時間短，在醫(yī)藥、食品、環(huán)境等領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用［23－25］。但是在制作紙噴霧的紙基時，紙基尖端很容易被損毀，進(jìn)而影響噴霧的穩(wěn)定性。微管紙噴霧（PCS）技術(shù)將微管和紙基結(jié)合，在電場作用下溶劑溶解分析物后從紙基流經(jīng)微管形成噴霧，極大提高了噴霧穩(wěn)定性，解決了紙噴霧生產(chǎn)和使用中的技術(shù)問題，顯著提高了紙噴霧性能［26］，成為較早實現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用的紙噴霧技術(shù)之一［27］。

目前微管紙噴霧多用于一般極性物質(zhì)的檢測，如含吡唑的多種抗菌劑［28］和芬太尼［29］等毒品，很少有針對強極性目標(biāo)物檢測的應(yīng)用案例。本文建立了微管紙噴霧技術(shù)串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀快速篩查血液中敵草快、百草枯、草甘膦、草銨膦和氯化琥珀膽堿5種強極性毒物的方法。該方法操作簡便，快捷高效，可在1 min內(nèi)得到結(jié)果，顯著提高了檢測的時效性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

8040三重四極桿質(zhì)譜儀（日本島津公司）；MS Mate質(zhì)譜儀原位電離離子源、PCS原位電離試劑盒（北京清譜科技有限公司）。

百草枯標(biāo)準(zhǔn)品、草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；敵草快標(biāo)準(zhǔn)品、氯化琥珀膽堿二水合物標(biāo)準(zhǔn)品（上海安譜科技有限公司）；草銨膦標(biāo)準(zhǔn)品（壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（LC－MS級，美國Thermo Fisher Scientific公司）；實驗用水為二次蒸餾水；空白全血樣品為兔血樣品（4℃保存），實際樣品由首都醫(yī)科大學(xué)復(fù)興醫(yī)院提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取一定量標(biāo)準(zhǔn)品，用水配制成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4℃保存；使用甲醇逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至適宜濃度，得到工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；配制全血樣品時，根據(jù)實際濃度需要，向空白全血中加入一定量的工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 質(zhì)譜條件與上樣條件

離子源：MS Mate質(zhì)譜儀原位電離離子源（與PCS原位電離試劑盒搭配使用）；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；質(zhì)譜極性：正負(fù)模式同時掃描；噴霧電壓：4.5 kV（正模式），－4.0 kV（負(fù)模式）；離子傳輸管溫度：250℃；加熱模塊溫度：250℃。

上樣條件：取100μL血液樣品，向其中加入9倍體積（900μL）的甲醇溶液，用手劇烈搖動5 s混勻，靜置30 s，取100μL上清液至PCS檢測盒后端，直接在質(zhì)譜上檢測。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化使用目標(biāo)物的甲醇工作溶液，在正負(fù)模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜圖掃描，同時優(yōu)化噴霧電壓、離子傳輸管溫度、加熱模塊溫度等質(zhì)譜前端條件，使MS全掃模式中目標(biāo)物離子強度最優(yōu)，從而確定質(zhì)譜極性和質(zhì)譜前端條件。然后根據(jù)目標(biāo)物的性質(zhì)，確定前體離子質(zhì)荷比m/z，采集其串聯(lián)質(zhì)譜譜圖（MS/MS）。調(diào)節(jié)碰撞能量，使目標(biāo)化合物的產(chǎn)物離子信號最高，選擇信號強度最高的兩個離子作為產(chǎn)物離子，其中強度最高的為定量離子，強度次高的為定性離子。

1.4.2 PCS上樣方式優(yōu)化取質(zhì)量濃度為5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水溶液或血液加標(biāo)樣品，分別考察以下5種上樣方式對檢測信號的影響：（1）直接上樣100μL樣品；（2）點樣10μL后烘干用100μL甲醇洗脫；（3）點樣10μL后烘干用100μL乙腈洗脫；（4）水－甲醇（1∶9，體積比）提取后上樣100μL；（5）水－乙腈（1∶9，體積比）提取后上樣100μL。

1.4.3 檢出限及線性測定按照“1.3”上樣條件，制備空白血液基質(zhì)提取液。加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，使基質(zhì)體積分?jǐn)?shù)為95%，配制成不同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。測試不同濃度基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中5種化合物的信號強度，繪制不同化合物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取空白全血，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液配制不同濃度的加標(biāo)樣品，標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積分?jǐn)?shù)不超過全血樣品體積的5%。使用“1.3”上樣條件，測定不同濃度下5種化合物的信號強度，以3倍信噪比對應(yīng)的濃度為檢出限。

1.4.4 回收率及穩(wěn)定性測定取空白全血，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液配制不同濃度的加標(biāo)樣品，標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積分?jǐn)?shù)不超過全血樣品體積的5%。配制1倍檢出限濃度，2倍檢出限濃度和10倍檢出限濃度共3個濃度水平的加標(biāo)樣品，每個濃度水平制備6個平行樣品進(jìn)行測試，計算方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

為了達(dá)到最優(yōu)檢測效果，采用“1.4.1”方法，以不含基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作溶液對每種物質(zhì)的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，包括質(zhì)譜前端條件、極性、MRM檢測離子對、碰撞能量等。優(yōu)化后的質(zhì)譜前端條件見“1.3”，各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件見表1。

表1 5種極性毒物的化學(xué)式和質(zhì)譜條件Table 1 Chemical information and MS parameters of the five polar poisons

2.2 上樣方式優(yōu)化

由于微管紙噴霧的上樣方式（即不同的目標(biāo)物提取方式）會對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大影響，因此本文對上樣方式進(jìn)行了優(yōu)化。一般微管紙噴霧有3種主要的上樣方式：直接上樣法（圖1A）、點樣洗脫法（圖1B）和提取上樣法（圖1C）。直接上樣法是將液體樣品直接上樣（100μL）至微管紙噴霧檢測盒并進(jìn)行檢測；點樣洗脫法是在微管紙噴霧檢測盒上先點樣10μL，烘干，再加入100μL洗脫溶劑將目標(biāo)物洗脫；提取上樣法先對樣品進(jìn)行簡單提取，再取提取液100μL上樣至微管紙噴霧檢測盒并進(jìn)行檢測。

圖1 不同上樣方式示意圖Fig.1 Workflows of different injection methods

首先，使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的水溶液進(jìn)行上樣方式優(yōu)化。結(jié)果表明，采用100μL直接上樣方式時，很難檢測到目標(biāo)物信號，這可能是由于水的粘度大、沸點高，不易揮發(fā)，形成噴霧液滴后溶劑難去除，無法生成離子［30］。使用點樣10μL烘干后溶劑洗脫的方式上樣時，無論選擇甲醇還是乙腈作為洗脫溶劑，得到的草銨膦和草甘膦信號都很低。使用乙腈提取后直接上樣，雖然敵草快、百草枯和氯化琥珀膽堿的信號較好，但是草銨膦的信號非常低。而使用甲醇提取后上樣，能兼顧所有目標(biāo)物的信號強度。因此，對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的水溶液而言，使用甲醇提取可獲得最好的檢測效果。使用全血樣品時，“1.4.2”中的5種上樣方式獲得了類似的結(jié)果，即使用甲醇提取可獲得最好的測試結(jié)果。

以甲醇為提取液，使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的水溶液優(yōu)化不同提取比例（樣品∶提取液，1∶1、1∶4、1∶9）下各化合物的信號響應(yīng)，每個提取比例檢測3次，取其平均值。結(jié)果顯示，敵草快、百草枯和氯化琥珀膽堿在提取比例1∶1時可以得到較高的信號，隨著提取比例的增加，信號降低；草甘膦在1∶4時得到最高信號，草銨膦在1∶9時得到最高信號。為兼顧所有化合物，使用提取比例1∶9對樣品進(jìn)行提取。并使用全血樣品驗證優(yōu)化結(jié)果，確定血液基質(zhì)中樣品和提取液比例為1∶9時所有化合物均可得到較好的信號強度。

綜上所述，考慮到所有目標(biāo)物的信號差異，最終選擇使用樣品∶甲醇為1∶9進(jìn)行提取，再取100μL提取液上樣的方式進(jìn)行檢測。

2.3 檢出限及線性范圍

PCS已經(jīng)在不同體系下驗證了其可定量性［26，28］，本文評估了其對強極性物質(zhì)的定量性能。使用本文所建立的方法，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，目標(biāo)化合物離子質(zhì)譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，5種化合物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)均大于0.985。對不同質(zhì)量濃度的血液加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測，以3倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限（LOD），全血中5種毒物快速篩查方法的檢出限分別為敵草快0.05 mg/L、百草枯0.5 mg/L、草甘膦25 mg/L、草銨膦25 mg/L、氯化琥珀膽堿0.05 mg/L。5種化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)與檢出限見表2，其中線性范圍為實際上機濃度?？瞻兹c檢出限濃度下加標(biāo)全血樣品的質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 空白（左）與加標(biāo)全血樣品（右）的MRM質(zhì)譜圖Fig.2 The MRM mass spectra of blank（left）and spiked whole blood（right）

表2 5種化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)與檢出限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients（r2）and LODs for the 5 compounds

在急性中毒事件中，中毒人員血液中的毒物含量通常較高［3，8，31］，本方法的檢出限能夠滿足急性中毒者血液中毒物的檢測要求。整個檢測過程可在1 min之內(nèi)完成，極大提高了檢測的時效性。

2.4 加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在常規(guī)質(zhì)譜分析中使用內(nèi)標(biāo)可以提高方法的穩(wěn)定性和回收率，但是內(nèi)標(biāo)價格昂貴，且使用內(nèi)標(biāo)操作繁瑣，不適用于毒物的快速篩查，因此本文使用外標(biāo)法評估方法的加標(biāo)回收率與穩(wěn)定性。對樣品進(jìn)行1倍、2倍和10倍檢出限濃度的加標(biāo)回收實驗，每個濃度設(shè)置6個平行樣品，得到回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3。結(jié)果表明，本方法的回收率為62%～117%，RSD不大于40%，在未使用內(nèi)標(biāo)的情況下，依然可以滿足快速篩查的需求。

表3 5種農(nóng)藥在3個加標(biāo)水平下的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of the 5 pesticides at 3 spiked levels（n=6）

2.5 實際樣品測定

采用本方法對百草枯、敵草快中毒病人的全血樣品進(jìn)行檢測。其中百草枯中毒者全血樣品中百草枯含量為6.14 mg/L，RSD為17%；敵草快中毒者全血樣品中敵草快含量為5.48 mg/L，RSD為9.3%；2份樣本中無其他物質(zhì)檢出。本方法可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行強極性毒物的快速篩查。

3 結(jié) 論

本文建立了PCS－Mate－MS/MS同時檢測水基溶液和全血樣品中敵草快、百草枯、草甘膦、草銨膦和氯化琥珀膽堿5種毒物的方法。該方法簡單、快速、高效，與常規(guī)檢測方法相比，樣品處理大大簡化，可在1 min內(nèi)獲得結(jié)果，分析時間極大縮短，能夠用于血液樣品的快速篩查，顯著提高了檢測時效性，具有廣泛的應(yīng)用前景。