王偉杰, 陳保國(guó), 張遠(yuǎn)航, 馬 平, 馮萬(wàn)軍
(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山西 太谷 030801)
種子活力是種子具有的潛在萌發(fā)及耐貯藏的能力。高活力種子發(fā)芽迅速、出苗整齊、成苗率高,即使在高溫、干旱等逆境條件下也可以保證苗全、苗壯和作物的田間密度[1]。目前,玉米單粒播種技術(shù)已經(jīng)普及,高活力的種子是保證出苗率的基礎(chǔ),有助于發(fā)揮玉米的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)與產(chǎn)量潛力[2]。因此,種子活力是玉米生產(chǎn)過(guò)程中重要指標(biāo)之一。迄今,已有多種有關(guān)種子活力檢測(cè)的方法,歸納起來(lái)可大致分為直接法和間接法兩類(lèi)[3]。
種子成熟度是影響種子活力的重要因素[4]。研究發(fā)現(xiàn),不同玉米品種授粉后35~49 d間收獲的玉米種子干物質(zhì)不再增加,基本達(dá)到生理成熟,發(fā)芽率均在90%以上。另有報(bào)道指出,玉米種子活力形成于種子生長(zhǎng)發(fā)育的早期,如對(duì)授粉后15 d的玉米種子胚進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),60%以上的種胚已具備發(fā)芽能力[5],但種子活力形成的關(guān)鍵時(shí)期應(yīng)在種子的脫水階段[6]。種子活力的形成與糖類(lèi)、蛋白質(zhì)和脂肪等化學(xué)組分的代謝密切相關(guān)。在種子萌發(fā)過(guò)程中,這些貯藏物質(zhì)被降解為小分子物質(zhì)以滿(mǎn)足種子萌發(fā)過(guò)程中對(duì)物質(zhì)和能量的需求,同時(shí)起到維持滲透平衡的作用[7-8]。
植物內(nèi)源激素是調(diào)控種子休眠與萌發(fā)的重要因子。脫落酸(ABA)是種子休眠的主要誘導(dǎo)物和保護(hù)物[9],過(guò)度積累會(huì)導(dǎo)致種子高度休眠[10];而赤霉素(GA3)能夠打破種子因ABA 含量過(guò)高引起的休眠[11];細(xì)胞分裂素(CTK)在種子萌發(fā)中與脫落酸具有拮抗作用,CTK 可以逆轉(zhuǎn)ABA 對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用[12],也可以與GA3互作誘導(dǎo)α-淀粉酶表達(dá)從而促進(jìn)種子萌發(fā)[13];生長(zhǎng)素(IAA)正向調(diào)控ABA和負(fù)向調(diào)控GA3的生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[14-15],從而抑制種子萌發(fā)。
目前,有關(guān)糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、氮素在不同成熟度的玉米種子中如何積累,以及各種激素含量在不同成熟度種子的萌發(fā)過(guò)程中發(fā)揮何種作用尚不清楚。因此,本研究在測(cè)定玉米自交系JNY 6 F不同成熟度種子中的可溶性糖、總氮含量的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步利用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)分析不同成熟度玉米種子活力差異以及萌動(dòng)種子胚中的激素含量等生理特性變化,以期明確玉米種子生理特性與活力之間的關(guān)系,旨在為種子活力形成的生理機(jī)制研究提供依據(jù)。
以自主選育玉米自交系JNY 6 F為試驗(yàn)材料,于2020年4月底在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站種植,種植行距0.5 m,密度4 500株/667 m2。在玉米吐絲前,選長(zhǎng)勢(shì)一致的植株將雌穗套袋,隨后所有雌穗在同一天完成授粉。自授粉后20 d開(kāi)始,每5 d 選取授粉充分的果穗。為了排除營(yíng)養(yǎng)分配差異,手動(dòng)剝離各果穗中部籽粒100粒。以3個(gè)果穗的籽?;旌献鳛?次重復(fù),共3次重復(fù)用于生物量測(cè)定;另外5個(gè)果穗的籽?;旌献鳛?次重復(fù),共3次重復(fù),經(jīng)自然晾曬干燥后用于后續(xù)種子活力分析。
收獲的新鮮種子稱(chēng)重后,置于烘箱在120 ℃下滅活30 min,80 ℃下烘干至重量恒定,根據(jù)公式計(jì)算種子水分含量和含水率。
含水量(mg)=(鮮重-干重)/種子數(shù)目;
含水率(%)=[(鮮重-干重)/鮮重]×100%。
從自然干燥的不同成熟度種子中,每重復(fù)取50粒,共3次重復(fù),洗凈后加入去離子水250 mL,浸泡24 h后用DDSJ-308 A型電導(dǎo)儀測(cè)定材料浸泡液電導(dǎo)率[16]。將自然干燥后的干種子磨碎,每重復(fù)取0.5 g,共3次重復(fù),用80%乙醇對(duì)可溶性糖進(jìn)行提取,采用經(jīng)典蒽酮比色法對(duì)可溶性總糖測(cè)定[17],采用3,5-二硝基水楊酸法進(jìn)行可溶性還原糖測(cè)定[17];采用H2SO4-H2O2靛酚藍(lán)比色法測(cè)定N素含量[18]。計(jì)算蛋白質(zhì)含量。
蛋白質(zhì)含量=全N含量×F,式中,F(xiàn)為蛋白系數(shù)。
參照國(guó)家種子檢驗(yàn)規(guī)程,從自然干燥的種子中取出100粒,用卷紙法置于光照培養(yǎng)箱,每日光照12 h/黑暗12 h處理,恒溫 25 ℃條件下發(fā)芽,3次重復(fù),每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽情況,第3天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì),第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率,第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率后在各重復(fù)中選取具有代表性的10株正常幼苗,分別測(cè)其幼苗鮮重和干重,并計(jì)算各萌發(fā)指標(biāo)及活力指數(shù)。
發(fā)芽勢(shì)(%)=(第3天發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽試驗(yàn)樣品粒數(shù))×100%;
發(fā)芽率(%)=(第7天發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽試驗(yàn)樣品粒數(shù))×100%;
發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt),Gt為發(fā)芽試驗(yàn)終期內(nèi)每日發(fā)芽數(shù),Dt為發(fā)芽日數(shù);
活力指數(shù)(VI)=GI×S,S為正常幼苗的單株干重。
使用上海酶聯(lián)公司生產(chǎn)的試劑盒(ml 147100、ml 020295、ml 062451和ml 064270),參照說(shuō)明,對(duì)不同成熟度玉米種子吸脹12 h后的種子胚中的IAA、CTK、GA3和ABA等4種激素分別進(jìn)行檢測(cè),3次重復(fù)。
注:圖A為不同成熟度玉米種子的外觀形態(tài);圖B為不同成熟度玉米種子的干重、鮮重變化;圖C為不同成熟度玉米種子的含水量及含水率變化;圖上不同小寫(xiě)字母表示差異顯著p<0.05。圖1 不同成熟度玉米種子性狀變化Fig.1 Traits changes of maize seeds with different maturity degree
采用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù);用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,LSD(Least-Significant Difference)最小顯著性差異法在0.05和0.01概率水平確定各平均值間的差異顯著性,分析結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;用R語(yǔ)言中的cor、cor.mtest和corrplot函數(shù)分別對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、顯著性檢驗(yàn)和繪圖。
在授粉后35 d,JNY 6 F種子基部出現(xiàn)黑色層(圖1 A),此時(shí)種子達(dá)到生理成熟,種子鮮重也達(dá)到最大值,為351.29 mg,但是此后干物質(zhì)仍在積累,在最后一次收獲時(shí)干重為230.20 mg(圖1 B)。另外,在授粉后20~35 d,是干物質(zhì)積累的快速時(shí)期,單個(gè)種子的干重從82.07 mg增加至202.96 mg,共提高了147%,平均每天增加8.06 mg(圖1 B)。待種子生理成熟后,生物量雖仍在積累,但增長(zhǎng)速率較緩慢,45 d相比于35 d僅增加了27.24 mg,平均每天增加2.72 mg(圖1 B)。與之對(duì)應(yīng),在授粉后20~35 d,單個(gè)種子絕對(duì)含水量緩慢降低,從162.91 mg降至148.33 mg,降幅在9%,而授粉后35~45 d,單個(gè)種子絕對(duì)含水量急劇減少,最終含水量降低了64%,種子含水率從70%左右降至20%左右(圖1 C)。
在玉米自交系JNY 6 F不同成熟度收獲后經(jīng)自然干燥的種子中,可溶性總糖含量呈先快速增長(zhǎng)后緩慢降低的變化趨勢(shì),而可溶性還原糖和總蛋白質(zhì)含量則呈先快速生長(zhǎng)后趨于穩(wěn)定的變化(表1)。由表1可見(jiàn),授粉后20~35 d的種子收獲后經(jīng)自然干燥處理,其體內(nèi)的可溶性總糖和可溶性還原糖的含量分別從4.24 mg和1.65 mg增至9.13 mg和4.60 mg,分別提高了150%和179%,平均每天積累量為0.33 mg和0.20 mg,但在授粉后45 d的種子收獲后經(jīng)自然干燥處理,其體內(nèi)的可溶性總糖和可溶性還原糖的含量則分別降低了9%和提高了7%,平均每天積累量分別為-0.08 mg和0.03 mg。與之不同,單粒種子的總蛋白含量是在授粉后20~30 d的干種子中快速增長(zhǎng)變化,從8.40 mg增加至20.33 mg,增加了142%,平均每天增加1.19 mg,而在授粉后30~45 d的干種子中,單粒種子中的總蛋白含量?jī)H增加了19%,平均每天積累量?jī)H為0.26 mg。
表1 不同成熟度干燥種子中生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 1 Measurement results of physiological indexes in dried seeds of different maturity degree
發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)是反映種子活力的重要指標(biāo)。發(fā)芽率可以反映種子的萌發(fā)能力,發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽指數(shù)可以反映出種子的發(fā)芽快慢,活力指數(shù)不僅可以反映發(fā)芽快慢而且還可以反映幼苗長(zhǎng)勢(shì)。通過(guò)發(fā)芽試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),玉米自交系JNY 6 F授粉后20 d的種子已具備發(fā)芽能力,發(fā)芽率在44%左右,但是其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均最低,分別在36%、37和0.6左右,而授粉后25 d的種子發(fā)芽率已在90%以上,發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)也提高了2倍或2倍以上(表2),說(shuō)明授粉后20~25 d可能是種子活力形成的關(guān)鍵時(shí)期。此后,不同成熟度干燥種子的發(fā)芽率基本維持在98%~100%之間,但發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)以授粉后35 d的干燥種子為最大,分別在93.33%和107.73,而活力指數(shù)則以授粉后45 d的干燥種子為最大,為4.01(表2)。
表2 不同成熟度干燥玉米種子活力指標(biāo)及電導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Statistical results of seed vigor index and electrical conductivity of dried maize with different maturity degree
種子浸泡液的電導(dǎo)率是檢測(cè)種子活力的有效指標(biāo),電導(dǎo)率可以反映種子萌發(fā)初期細(xì)胞膜重建和損傷修復(fù)能力,因此電導(dǎo)率與活力指數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[19]。通過(guò)對(duì)不同成熟度干燥玉米種子的電導(dǎo)率測(cè)定發(fā)現(xiàn),隨著收獲時(shí)間的推移,電導(dǎo)率呈逐漸下降的變化趨勢(shì),在授粉后20~45 d間電導(dǎo)率從88 μS/(cm·g)降低至27 μS/(cm·g),降低了69.3%(表2),這與前人研究結(jié)果吻合,說(shuō)明越晚收獲的種子經(jīng)干燥后,其細(xì)胞完整性越高,破損率越低。
植物的內(nèi)源激素對(duì)種子萌發(fā)具有重要影響。測(cè)定結(jié)果顯示,在吸脹12 h 的單個(gè)種子胚中,GA3、ABA、CTK和IAA等4 種內(nèi)源激素含量基本呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律,均在授粉后35 d 達(dá)到最大值,分別達(dá)8.93、18.3、15.72 ng和1.14 ng,相比于授粉后20 d的種子胚,分別提高了206%、174%、232%和141%。但此后收獲的單個(gè)玉米種子的萌動(dòng)胚中,在授粉后35~45 d間,除GA3含量小幅降低外(6%),而ABA、CTK和IAA的含量均有大幅度降低,分別降低了48%、39%和46%。
相關(guān)性分析結(jié)果顯示,不同成熟度干燥種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等4個(gè)種子活力指標(biāo)均與電導(dǎo)率呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,再次印證電導(dǎo)率可以作為檢測(cè)種子活力的有效指標(biāo)。另外,發(fā)芽勢(shì)與種子干重和單個(gè)胚的GA3、單個(gè)胚的CTK、可溶性總糖含量、可溶性還原糖和總蛋白質(zhì)含量均顯著或極顯著相關(guān),發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)與除總蛋白質(zhì)含量外的其余5個(gè)性狀呈顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系,而活力指數(shù)則與除單個(gè)胚的CTK含量外的其余5個(gè)性狀顯著或極顯著相關(guān)(圖2)。據(jù)此推測(cè),種子中積累的干物質(zhì)、GA3、可溶性糖、可溶性還原糖等物質(zhì)均具有促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成的作用,而積累的蛋白質(zhì)僅在種子萌發(fā)后幼苗建成的過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用,而CTK僅在種子萌發(fā)過(guò)程中起正向作用。
表3 不同成熟度干燥種子吸脹12 h后單個(gè)種子胚內(nèi)源激素含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of endogenous hormone content in single embryo after 12 h of imbibition of dried seeds with different maturity degree
注:“*”和“**”分別表示p<0.05和p<0.01。圖2 不同成熟度干燥玉米種子活力指標(biāo)與各個(gè)生理性狀的相關(guān)性Fig.2 Correlation between seed vigor index and physiological characteristics of dried maize with different maturity degree
霜凍會(huì)造成玉米種子活力大大降低,因此在確保種子活力的前提下提前采收,有助于減少霜凍對(duì)種子活力造成的影響。顧日良等[2]采用不同發(fā)芽方法對(duì)授粉后35~62 d的京科968雜交種種子活力分析發(fā)現(xiàn),隨著收獲期的推遲,種子活力不斷上升,在授粉后59 d收獲的種子活力最高。邢妍妍等[5]研究表明,玉米種子活力形成于脫水階段,授粉后15 d的種子經(jīng)過(guò)干燥即具有萌發(fā)能力,發(fā)芽率在5%左右。但不同基因型玉米種子活力的最大值與種子生理狀態(tài)的關(guān)系并無(wú)明確關(guān)系,一般是雜交玉米種子的活力在生理成熟之前最高,而玉米自交系種子活力多在生理成熟之后達(dá)到最大值[20]。在本研究中,玉米自交系JNY 6 F授粉后20 d的種子,經(jīng)自然干燥后,44%已具備發(fā)芽能力,這與前人關(guān)于種子活力形成于種子生長(zhǎng)發(fā)育早期的結(jié)論相吻合。另外,發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)以授粉后35 d的種子為最大,此時(shí)種子基部出現(xiàn)黑色層,干物質(zhì)積累也基本停滯,因此基本生理成熟,而活力指數(shù)以授粉后45 d的種子為最高,這些研究結(jié)果基本與前人研究結(jié)果相符。
種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)需要大量的能量和營(yíng)養(yǎng)。在種子萌發(fā)過(guò)程中,種子體內(nèi)貯藏的干物質(zhì)被降解為小分子物質(zhì)以維持體內(nèi)滲透平衡以及提供幼苗形態(tài)建成所需的物質(zhì)和能量[21]??扇苄蕴蔷哂斜Wo(hù)膜透性的作用[22],其中單糖(Monosaccharides)和棉子糖(Raffinose)與種子活力密切相關(guān),在加速老化處理后,兩種可溶性糖含量顯著降低,而種子活力也隨之下降[23]??扇苄蕴鞘莾?yōu)先被代謝的糖類(lèi),可為種子萌動(dòng)初期提供能力和代謝產(chǎn)物。因此,可溶性糖含量高的種子會(huì)受到更為良好的保護(hù),而且在萌動(dòng)初期有更為充足的能量來(lái)源。本研究發(fā)現(xiàn),JNY 6 F不同成熟度種子經(jīng)自然干燥后,其體內(nèi)的可溶性總糖含量以授粉后35 d的種子為最高,而可溶性還原糖積累量在此后仍在緩慢增加,相關(guān)性分析結(jié)果顯示,兩類(lèi)糖的含量均與發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等4個(gè)種子活力指標(biāo)顯著或極顯著相關(guān),這與前人研究結(jié)果相吻合。蛋白質(zhì)是有機(jī)體的重要組成物質(zhì)。蛋白質(zhì)的損傷與修復(fù)過(guò)程對(duì)種子活力和壽命有重要影響[24]。研究發(fā)現(xiàn),籽粒中的蛋白質(zhì)含量與植株干重極顯著正相關(guān),可以作為檢測(cè)種子活力的有效指標(biāo)[25]。在本研究中,不同成熟度干燥種子的發(fā)芽勢(shì)和活力指數(shù)與體內(nèi)總蛋白含量顯著或極顯著相關(guān),而發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)則與之無(wú)明顯相關(guān)性,說(shuō)明蛋白質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)后幼苗的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用,即促進(jìn)幼苗生物量的積累,而與萌發(fā)快慢無(wú)關(guān),這與前人提出的玉米籽粒中的蛋白質(zhì)含量與植株干重極顯著正相關(guān)的結(jié)論相印證。
研究表明,ABA的積累會(huì)造成種子休眠[10],而GA3可以打破ABA積累造成的種子休眠[11]。另外,IAA可以通過(guò)調(diào)控ABA與GA3的合成通路來(lái)抑制種子萌發(fā)[14-15],而CTK與GA3相似,與ABA具有拮抗作用,并且可以促進(jìn)GA3誘導(dǎo)水解酶的產(chǎn)生[12],從而促進(jìn)種子萌發(fā)。然而,也有報(bào)道指出,一些激素在種子萌發(fā)過(guò)程中存在劑量效應(yīng),如低濃度IAA對(duì)種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用,高濃度IAA具有抑制作用[26-28];低濃度CTK對(duì)種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用,高濃度CTK具有抑制作用[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn),雖然授粉后35 d收獲的種子吸脹12 h后的單個(gè)種胚內(nèi)的ABA、GA3、CTK和IAA含量均達(dá)到最大值,但相關(guān)性分析結(jié)果顯示,僅GA3含量與發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等4項(xiàng)種子活力指標(biāo)極顯著正相關(guān),CTK含量除活力指數(shù)外的3個(gè)種子活力指標(biāo)顯著正相關(guān),而ABA含量和IAA含量與4個(gè)種子活力指標(biāo)存在正相關(guān)關(guān)系但未達(dá)到顯著水平。據(jù)此推測(cè),GA3與種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均有關(guān)系,CTK則主要在種子萌發(fā)過(guò)程中發(fā)揮作用,而ABA和IAA在種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中也有一定作用,但這些作用的發(fā)揮可能是各種激素間相互作用的結(jié)果,并且還可能存在劑量效應(yīng),有待進(jìn)一步研究。