吳婉婷 ，劉 括，左陸雅 ，梁 騰

（1.大連海洋大學，遼寧 大連 116023；2.大連上品堂海洋生物有限公司，遼寧 大連 116000）

菲律賓蛤仔（Ruditapes Philippines，以下簡稱為蛤仔）是我國四大養(yǎng)殖貝類之一，為世界性養(yǎng)殖貝類[1]，市場潛力巨大。

蛤仔為濾食性貝類，對適口性食物無選擇性。影響貝類生長的主要營養(yǎng)物質(zhì)是不飽和脂肪酸，它直接制約貝類的變態(tài)率、幼蟲的生長率及無灰分干重指標，特別是甾醇的種類和含量對海洋貝類的生長發(fā)育有著直接的影響。不飽和脂肪酸對貝類的攝食效率、消化率有明顯的促進作用，尤其是在促進貝類幼蟲和稚貝時期生長的效果明顯快于成貝[2]。

具備生物活性的不飽和脂肪酸越來越成為現(xiàn)階段水產(chǎn)動物研究的熱點，它具有多種生物功能：能夠使水產(chǎn)養(yǎng)殖的動物自身免疫力得到增強，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的抗逆性，減少其死亡率，改善水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生長狀況以及其對飼料的利用效率，促進營養(yǎng)物質(zhì)代謝，并且可以對免疫細胞及免疫因子的信號傳導、基因表達、消除自由基、促補體作用以及促進細胞膜流動、激活細胞膜上酶產(chǎn)生生理學作用。不飽和脂肪酸還是一種免疫增強劑，它的促進生長作用與免疫調(diào)節(jié)作用緊密聯(lián)系在一起[3]。不飽和脂肪酸通過改善機體的原有防御體系，減少機體的免疫反應產(chǎn)物對攝食和生長的抑制，降低免疫激活水平，促進動物的生長，即不飽和脂肪酸是動物非特異性免疫反應得到提升后，以實現(xiàn)削弱特異免疫反應的免疫能力，從而去減少細胞免疫因子的產(chǎn)生來達到促進養(yǎng)殖貝類生長的目的。

不飽和脂肪酸中的EPA/DHA是維持機體生活的重要營養(yǎng)物質(zhì)。蛤仔的EPA/DHA一方面是其維持自身生命活動的主要營養(yǎng)來源，另一方面為人類提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，通過饑餓及不同餌料對蛤仔EPA/DHA含量影響，旨在闡述蛤仔EPA/DHA的合成能力，為蛤仔的健康養(yǎng)殖業(yè)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取遼寧大連莊河海區(qū)殼型完整、無損傷的蛤仔作為實驗材料。實驗材料運回實驗室后，充氣換水暫養(yǎng)3 d。隨機測量40個蛤仔的表型性狀。統(tǒng)計分析得到殼長、殼高、殼寬及鮮重分別為37.15±4.93 cm，24.04±2.07 cm，15.23±0.90 cm，8.58±1.78 g。

1.2 實驗方法

將選取的100個健康、活力良好的蛤仔放入40 L塑料水槽內(nèi)充氣培養(yǎng)。實驗設(shè)置饑餓組（1）金藻投喂組（2）鹽藻投喂組（3）金藻和鹽藻投喂組日投餌量為50萬cells/mL。每天投餌2次，全量換水1次，換水時挑除死貝，洗凈水槽。本實驗共設(shè)置3個重復組。實驗的周期為7 d。

1.2.1 氣象色譜法測定EPA/DHA含量

采用氣象色譜法測定不同實驗組蛤仔的EPA/DHA。

1.2.2 蛤仔脂肪提取

解剖蛤仔，取1～5 g的軟體部（脂肪含量約為100～200 mg）轉(zhuǎn)移至燒瓶中，在燒瓶中加入100 mg的焦性食子酸（十一碳酸和甘油三脂內(nèi)標溶液）和沸石。加入2 mL的乙醇（95%）混合均勻。加入10 mL的鹽酸后混合均勻[4]。再把燒瓶轉(zhuǎn)移到70～80°C的水浴。水解40 min，每10 min振蕩燒瓶，在混合水解溶液完成以后，移開燒瓶，冷卻至室溫，加入10 mL的乙醇（95%）混合均勻[5]。

在脂肪的水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移后，用50 mL乙醚沖洗燒瓶，在分液漏斗中倒入乙醚石油醚混合洗滌液，蓋緊瓶塞子搖晃5 min，靜放10 min，醚層提取收集250 mL加入三角瓶按照上面的步驟。再反復提取1次，在瓶中加入乙醚和石油醚混合洗滌液進行洗滌收集250 mL三角瓶中，揮發(fā)溶劑，脂肪殘留提取物。

在250 mL三角瓶提取8 mL 2%的氫氧化鈉溶液，把回流冷凝器連接上，連接后在80℃水浴中回流，回流到油滴消失為止。在15%頂三氟化硼甲醇溶液7 mL回流冷凝器80℃水浴2 min?；亓骼淠饔萌ルx子水沖洗。加熱停止，取出瓶子后迅速冷卻降至室溫，精確取10～30 mL的正庚烷，振蕩2 min，加入飽和NaCl溶液，分層，從上層正庚烷萃取液取出5 mL，轉(zhuǎn)移到30 mL小試管中，加入3～5 g無水NaSO4震動1 min，靜放5 min吸取上層溶液為樣品瓶[6]。

在樣品脂肪提取中應注意在第一次檢測時，組分不確定的樣品中不要加入內(nèi)標物。在內(nèi)標物C11的峰位置處觀察是否出現(xiàn)干擾峰，如果存在干擾峰，加內(nèi)標檢時測的時候?qū)?nèi)標物C11的峰進行必要校正[7]。

1.2.3 EPA/DHA含量測定

色譜測定的參考條件見表1。

表1 色譜測定的參考條件

1.2.4 色譜測定

在氣相色譜儀中注入l0 μL脂肪酸甲酯標準液和各組別脂肪酸甲酯標準溶液，測定這些色譜條件下的標準溶液反應（峰值高度或面積），及各脂肪酸甲酯色譜相對保留時間，計算出響應因子。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用R軟件作圖，并進行單因素方差分析及t-test檢驗，差異顯著性設(shè)置為P＜0.05。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同實驗組的EPA含量

不同實驗組的EPA含量比較結(jié)果如圖1、圖2所示。結(jié)果表明，饑餓組、金藻投喂組及鹽藻投喂組的蛤仔EPA含量差異顯著（P＜0.05）。各實驗組EPA含量由多到少為饑餓組（1）＞金藻投喂組（2）＞鹽藻投喂組（3）。

圖1 不同實驗組EPA含量比較

圖2 不同實驗組EPA含量方差分析

2.2 不同實驗組的DHA含量比較

不同實驗組的DHA含量比較結(jié)果如圖3、圖4所示。結(jié)果表明，各實驗組DHA含量由多到少為饑餓組（1）＞金藻投喂組（2）＞鹽藻投喂組（3）。饑餓組與金藻投喂組DHA含量差異不顯著（P＞0.05）。饑餓組和鹽藻投喂組的DHA含量差異顯著（P＜0.05）。

圖3 不同實驗組DHA含量比較

圖4 不同實驗組DHA含量方差分析

3 討論

本實驗以蛤仔為材料，測定分析饑餓處理、投喂金藻、投喂鹽藻，實驗組的蛤仔EPA/DHA含量，結(jié)果表明，饑餓組、金藻投喂組及鹽藻投喂組的蛤仔EPA含量差異顯著（P＜0.05）。以往研究報道表明，投喂處在浮游幼蟲階段的貝類，金藻投喂的效果比硅藻投喂的效果更好。金藻對稚貝的變態(tài)發(fā)育有明顯作用。原因可能是由于處于不同生長階段的貝類所需要的營養(yǎng)有所不同，所以不同生長階段的貝類對餌料的需要就會存在不同。王慶志等[8]選取了健康的大連魁蚶稚貝，在溫度23.5～24.0℃和鹽度29.5～30.0環(huán)境條件下，用小球藻，牟氏角毛藻，等邊金藻，新月菱形藻這4種單細胞藻類單獨投喂和組合投喂魁蚶的稚貝，并觀察24 h以后單獨投喂和組合投喂兩種方式對魁蚶稚貝存活生長的影響。結(jié)果表明，單獨投喂時，等邊金藻組喂養(yǎng)的稚貝生長最快，小球藻組投喂的稚貝生長最慢。然而組合投喂組（其他3種單細胞藻與等邊金藻混合（1∶1））中，稚貝的殼長和特定生長率都高于其他組的稚貝[3]。其中與小球藻組合投喂的效果最好。李文波等[9]在2012年進行了不同的餌料對西施舌稚貝的生長和消化酶的活性影響的研究，得出結(jié)果餌料是幼蟲變態(tài)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是幼蟲培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。隨著西雅舌人工育苗的規(guī)模化生產(chǎn)，單細胞藻餌料的日常供應成為一種挑戰(zhàn)。在2011年，馬斌等[10]通過比較8種常見的餌料微藻單獨和組合投喂對縊蟶稚貝的生長影響，篩選出了適合縊蟶稚貝的餌料最優(yōu)的組合，結(jié)果表明，單獨投喂時金藻跟角毛藻最佳，在混合投喂時，存在一些單獨投喂效果不理想的微藻品種，這些微藻品種就可以在優(yōu)質(zhì)餌料不足的時候作為補充。

饑餓組與金藻投喂組DHA含量差異不顯著（P＞0.05）；饑餓組和喂養(yǎng)有顯著性差異的DHA含量（P＜0.05）；投喂金藻組與鹽藻組 DHA含量差異顯著（P＜0.05）。研究表明，金藻中sfa，mufa，pufa含量都高于杜氏鹽藻[11]。在本實驗中金藻組蛤仔的EPA/DHA含量高于鹽藻組蛤仔EPA/DHA含量。說明蛤仔可以在體內(nèi)自身合成EPA和DHA[12]。

本研究表明短時間饑餓可以提高蛤仔體內(nèi)的DHA含量，不同餌料對蛤仔EPA和DHA的合成有顯著影響。在自然界中，海洋微藻是能合成EPA和DHA的少數(shù)生物之一。它們具有巨大的開發(fā)利用潛力。微藻脂肪酸的組成與其種類和品種有關(guān)系，同時也受環(huán)境因素影響。溫度、營養(yǎng)素、生長周期、光照等等都可以導致EPA和DHA的含量變化，從而影響了微藻脂肪酸的組成。

4 結(jié)論

（1）本實驗以蛤仔為材料，通過饑餓處理、投喂金藻、鹽藻，測定不同實驗組的蛤仔EPA含量。結(jié)果表明，饑餓組、投喂金藻組及投喂鹽藻組的蛤仔EPA含量差異顯著（P＜0.05）。

（2）饑餓組與金藻喂養(yǎng)組DHA含量差異不顯著（P＞0.05）；饑餓組和投喂杜氏鹽藻含量有顯著性差異（P＜0.05）；金藻投喂組與鹽藻投喂組 DHA含量差異顯著（P＜0.05）。研究表明，金藻中EPA和DHA含量都高于鹽藻。說明蛤仔可以在體內(nèi)自身合成EPA和DHA。

（3）本研究表明短時間饑餓可以提高蛤仔體內(nèi)的DHA含量，不同餌料對蛤仔EPA和DHA的合成有顯著影響。金藻中含有的EPA/DHA前體較多，蛤仔可能具有合成EPA/DHA含量的效果。在自然界中，海洋微藻是能合成EPA和DHA的少數(shù)生物之一。