祁克明，李 葉，林可欣，張家源，盧 偉，魏藝聰

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 ，350122）

根據(jù)報道，抑郁癥是導(dǎo)致殘疾的三大原因之一，目前全球有超過2.4億人患有抑郁癥［1］。抑郁癥的癥狀包括情緒和認(rèn)知障礙，如情緒低落易怒、缺乏快感、疲倦、失眠或嗜睡、反應(yīng)遲鈍、食欲不振等［2］。抑郁癥的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，主要與神經(jīng)營養(yǎng)因子、下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitaryadrenal，HPA）軸、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)可塑性、炎癥反應(yīng)等有關(guān)［3-4］。雖然已有多種抗抑郁藥如氟西?。╢luoxetine，F(xiàn)LU）、氯胺酮等應(yīng)用于抑郁癥患者的治療中，但僅對30%～40%的患者有效［5］，因此抗抑郁新藥的研發(fā)十分必要。迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）是一種天然多酚化合物，主要存在于草珊瑚（又名腫節(jié)風(fēng)）、薄荷、迷迭香、丹參、鼠尾草、麻黃、紫蘇等藥用植物中［6］，并且與異嗪皮啶共同作為中藥腫節(jié)風(fēng)的質(zhì)量控制成分被收錄入《中華人民共和國藥典》2020版［7］。研究表明，RA具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗抑郁、抗焦慮、抗腫瘤、抗菌、保肝等藥理作用［8］。大量研究表明，RA能夠通過調(diào)節(jié)單胺能神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、齒狀回新生細(xì)胞數(shù)量和炎癥反應(yīng)等機(jī)制發(fā)揮抗抑郁作用［9］。氟西汀（fluoxetine，F(xiàn)LU）是一種廣泛應(yīng)用于臨床的抗抑郁藥物，主要通過提高大腦內(nèi)5-羥色胺（serotonin，5-HT）、BDNF，增強(qiáng)神經(jīng)可塑性、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生來發(fā)揮抗抑郁作用［10］。氟西汀還具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等藥理作用，可以提高腦內(nèi)胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor Alpha，TNFα）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等促炎因子發(fā)揮抗抑郁作用［11］。但目前尚無關(guān)于RA與FLU聯(lián)合用藥治療抑郁癥的相關(guān)研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種包括系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析、連通性、冗余和多效性的藥物設(shè)計方法，為新藥的發(fā)現(xiàn)和闡明化合物對疾病的作用機(jī)制研究提供依據(jù)，同時為提高藥物臨床療效和了解毒副作用提供重要依據(jù)［12］。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法預(yù)測RA治療抑郁癥的潛在途徑和可能的機(jī)制，并且以經(jīng)典抗抑郁藥FLU作為對照，對比分析二者存在的異同點(diǎn)，從而為RA與FLU治療抑郁癥聯(lián)合用藥的研究提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 化合物信息的獲取 將rosmarinic acid和fluoxetine輸入化合物數(shù)據(jù)庫Pubchem中進(jìn)行檢索，獲得RA和FLU的SMILES式、二維結(jié)構(gòu)。

1.2 RA、FLU相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 將化合物名稱輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP），檢索得到潛在靶點(diǎn)。將化合物三維結(jié)構(gòu)文件上傳至Pharmmapper數(shù)據(jù)庫，選擇“靶點(diǎn)（targets）”，類型為“僅針對人類蛋白質(zhì)（human protein targets only）”，從結(jié)果中篩選出適配度（fit score）＞3分的靶點(diǎn)。將化合物三維結(jié)構(gòu)文件上傳至SwissTargetPrediction和Stitch數(shù)據(jù)庫，選擇“物種（species）”為“人類（HOMOsapiens）”，獲得潛在靶點(diǎn)，并從SwissTarget-Prediction結(jié)果中篩選出可能性（probability）＞0的靶點(diǎn)。將以上4個數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)合并去重，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫將獲得的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為人類基因標(biāo)準(zhǔn)名。

1.3 抑郁癥靶點(diǎn)的獲取 將“depression”“depressive disorder”“major depressive disorder”作 為 抑 郁癥關(guān)鍵詞，分別從治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（therapeutic target database，TTD）、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）、GeneCards數(shù)據(jù)庫和基因疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫（a database of genedisease associations，DisGeNet）獲得疾病靶點(diǎn)。篩選GeneCards數(shù)據(jù)庫中相關(guān)性得分（relevance score）＞10的靶點(diǎn)，TTD數(shù)據(jù)庫結(jié)果中Disease為Depression或Major depressive disorder的靶點(diǎn)，以及DisGeNet數(shù)據(jù)庫評分（score gda）＞0.2的靶點(diǎn)。將以上4個數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)合并去重，轉(zhuǎn)換為人類基因標(biāo)準(zhǔn)名。

1.4 迷迭香酸和氟西汀治療抑郁癥靶點(diǎn)整合 篩選出RA與抑郁癥的交集靶點(diǎn)作為RA治療抑郁癥的候選靶點(diǎn)，F(xiàn)LU與抑郁癥的交集靶點(diǎn)作為FLU治療抑郁癥的候選靶點(diǎn)，并篩選出二者共同的候選靶點(diǎn)。

1.5 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interactio，PPI）的構(gòu)建及分析 將“1.4”得到的RA與抑郁癥和FLU與抑郁癥的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入在線分析工具STRING數(shù)據(jù)庫中，選擇物種為“HOMO sapiens”構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)。將獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中進(jìn)行可視化處理，利用Network Analyzer功能計算節(jié)點(diǎn)度值（degeree），度值越大，則顏色越深，說明與該靶點(diǎn)相連的靶點(diǎn)越多，其相關(guān)度越大。此外，使用Cytoscape 3.8.2軟件的MCODE算法對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，提取核心基因模塊。

1.6 分子對接驗(yàn)證 選擇RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。將RA的二維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Chem3D 19.0.0.22優(yōu)化力學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)出為pdb格式。從PDB數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白分子的3D結(jié)構(gòu)，采用Py-MOL 2.5.2對蛋白質(zhì)去水，去配體，導(dǎo)出為pdb格式。利用AutoDockTools對蛋白質(zhì)和RA加氫，轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，進(jìn)行分子對接。結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol時具有良好的對接活性，結(jié)合能≤-7 kcal/mol時具有較強(qiáng)的對接活性。

1.7 生物學(xué)過程及通路分析 運(yùn)用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）對PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)進(jìn)行基因功能（gene ontology，GO）注釋和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，了解RA和FLU對治療抑郁癥可能的生物功能和信號途徑。

2 結(jié)果

2.1 RA和FLU治療抑郁癥靶點(diǎn)篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫得到RA的潛在靶點(diǎn)18個，F(xiàn)LU潛在靶點(diǎn)0個；從Pharmmapper數(shù)據(jù)庫篩選得到RA潛在靶點(diǎn)114個，F(xiàn)LU潛在靶點(diǎn)42個；從Stitch數(shù)據(jù)庫得到RA靶點(diǎn)2個，F(xiàn)LU靶點(diǎn)10個；從SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫得到RA靶點(diǎn)62個，F(xiàn)LU靶點(diǎn)42個。將獲得的疾病靶點(diǎn)整合去重，共得到RA潛在靶點(diǎn)179個，F(xiàn)LU潛在靶點(diǎn)87個。從TTD數(shù)據(jù)庫獲得抑郁癥潛在靶點(diǎn)32個，OMIM數(shù)據(jù)庫獲得靶點(diǎn)271個，GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到靶點(diǎn)1 506個，DisGeNet數(shù)據(jù)庫得到靶點(diǎn)577個，整合后共得到抑郁癥潛在靶點(diǎn)1 753個。分別對RA和FLU治療抑郁癥的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選后，共得到63個RA作用于抑郁癥的候選靶點(diǎn)，45個FLU作用于抑郁癥的候選靶點(diǎn)，其中包含7個RA和FLU共同作用于抑郁癥的候選靶點(diǎn)。

2.2 基于PPI互作網(wǎng)絡(luò)的分析和預(yù)測 使用Cytoscape 3.8.2軟件分別建立RA與抑郁癥63個交集靶點(diǎn)、FLU與抑郁癥45個交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，并依據(jù)度值對蛋白互作進(jìn)行可視化處理。結(jié)果表明，RA與抑郁癥的PPI網(wǎng)絡(luò)圖共包含了60個靶點(diǎn)和479條邊，見圖1A，度值排名前15的靶點(diǎn)為AKT1、MAPK1、CASP3、MMP9、IGF1、MAPK8、SRC、PTGS2、EGFR、CCL2、ESR1、MMP2、AR、JAK2、ERBB2。FLU與抑郁癥的PPI網(wǎng)絡(luò)圖共包含了45個靶點(diǎn)和220條邊，見圖1B，度值排名前15的靶點(diǎn)為BDNF、SLC6A4、OPRM1、MAOA、DRD2、CYP2D6、HTR1A、DRD4、SLC6A3、DRD3、SLC6A2、OPRK1、ADRA2A、IGF1、ACHE、CASR、HTR2A。將排名前15的靶點(diǎn)基因作為核心（HUB）靶點(diǎn)基因，二者度值排名前15的靶點(diǎn)均包含IGF1。使用Cytoscape 3.8.2軟件的MCODE算法對RA和FLU的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，RA共得到2個核心基因模塊，模塊1由24個節(jié)點(diǎn)和220條邊組成，得分為19.13分，模塊2由4個節(jié)點(diǎn)和5條邊組成，得分為3.333分。FLU共得到4個核心基因模塊，模塊1由15個節(jié)點(diǎn)和91條邊組成，得分為13.143分，模塊2～4均由3個節(jié)點(diǎn)和3條邊組成，得分均為3分，見圖2。

圖1 迷迭香酸（A）和氟西?。˙）與抑郁癥交集靶點(diǎn)蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 迷迭香酸（A）與氟西?。˙）PPI網(wǎng)絡(luò)的MCODE分析圖

2.3 化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白分子對接 利用AutoDockTools計算RA與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白之間的最低結(jié)合能。結(jié)果顯示RA與15個關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能均＜-5.0 kcal/mol，說明RA與其治療的靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合能力，并且與MMP2、MMP9、MAPK8、JAK2、EGFR、CASP3、AR、AKT1之間具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，見表1。

表1 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白與RA分子對接結(jié)果

2.4 基于GO功能注釋的分析和預(yù)測 通過DAVID在線平臺對兩種化合物治療抑郁癥的潛在靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能注釋（P＜0.05）。得到了RA相關(guān)條目一共1 342個，其中生物過程（biological process，BP）1 188個，細(xì)胞成分（cellular components，CC）46個，分子功能（molecular function，MF）108個；FLU相關(guān)條目共961個，BP、CC、MF分別為853、27、81個。根據(jù)P值對所得條目由小到大進(jìn)行排序，篩選出每一類中前15位，并對前10位進(jìn)行可視化處理，見圖3。結(jié)果表明，RA可能主要通過調(diào)節(jié)代謝過程的調(diào)控、對刺激的反應(yīng)、信號傳導(dǎo)的調(diào)控、生化活性的調(diào)節(jié)等生物過程發(fā)揮作用。此外，在排位前15的條目中，RA和FLU都與代謝過程的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)、對有機(jī)物的反應(yīng)、大分子代謝過程的正調(diào)控、細(xì)胞通訊調(diào)節(jié)、信號調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝過程的正調(diào)控、細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、神經(jīng)元投射、受體結(jié)合、酶結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合等有關(guān)。

圖3 迷迭香酸（A）和氟西汀（B）抗抑郁的GO富集分析

2.5 基于KEGG富集分析的分析和預(yù)測 為了探究RA用于治療抑郁癥潛在的信號通路，我們使用DAVID在線工具對兩種化合物治療抑郁癥的潛在靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGGPathway富集分析（P＜0.05），得到RA潛在作用通路72條，F(xiàn)LU潛在作用通路22條。兩個化合物交集通路共11條，主要包括5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、Rap1信號通路（Rap1 signaling pathway）、ErbB信號通路（ErbB signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路（neurotrophin signaling pathway）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、間隙連接（gap junction）等通路。

此外，篩選RA和FLU富集得到的信號通路中包含靶點(diǎn)基因數(shù)最多的20條通路，并進(jìn)行可視化處理（圖4）。結(jié)果表明，腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、趨化因子信號通路（chemokine signaling pathway）等是RA獨(dú)有的治療抑郁癥的潛在信號通路。神經(jīng)活性配體受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、鈣信號通路（calcium signaling pathway）、多巴胺能突觸（dopaminergic synapse）、cAMP信號通路（cAMPsignaling pathway）、花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism）、炎癥介質(zhì)對TRP通道的調(diào)節(jié)（inflammatory mediator regulation of TRPchannels）等通路是FLU獨(dú)有的治療抑郁癥的潛在信號通路。

圖4 迷迭香酸（A）和氟西?。˙）抗抑郁的KEGG富集分析

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為抑郁癥屬于“郁證”范疇，多由情志不暢、氣機(jī)郁滯所致［13］，對于郁證的治療大多以疏肝理氣、調(diào)節(jié)脾胃、養(yǎng)血安神等為主［14］。RA是金粟蘭科植物草珊瑚［Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai］的指標(biāo)性成分，而草珊瑚歸心經(jīng)、肝經(jīng)，具有祛風(fēng)通絡(luò)、活血涼血的功效［7］，說明草珊瑚有可能通過疏肝理氣作用發(fā)揮抗抑郁作用。現(xiàn)代藥理研究也表明其具有抗炎、抗壓的作用［15］。而RA作為草珊瑚的有效成分，已被證明具有抗抑郁作用［16-17］，但其抗抑郁作用的許多關(guān)鍵機(jī)制還尚未明確。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法來探究RA和FLU抗抑郁作用的可能機(jī)制，為后續(xù)新藥研發(fā)以及聯(lián)合用藥治療抑郁癥提供依據(jù)。

通過在線網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分別檢索了RA和FLU的潛在作用靶點(diǎn)和抑郁癥的作用靶點(diǎn)，結(jié)果表明，RA與抑郁癥的交集靶點(diǎn)比FLU多18個。對二者與抑郁癥的交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)二者度值排名前15的交集靶點(diǎn)僅有IGF1一個靶點(diǎn)，說明RA與FLU可能共同作用于IGF1而發(fā)揮抗抑郁作用，且通過作用于不同的基因靶點(diǎn)而發(fā)揮抗抑郁作用，提示二者的抗抑郁作用機(jī)制可能存在較大差異。MCODE聚類分析進(jìn)一步證明RA和FLU的抗抑郁作用于IGF1密切相關(guān)。通過GO功能注釋分析，我們發(fā)現(xiàn)RA和FLU治療抑郁癥過程都是多個生物過程、分子功能和細(xì)胞成分共同參與的結(jié)果，涉及到酶結(jié)合、蛋白受體結(jié)合、離子結(jié)合、多種代謝過程調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)等分子功能，是一個多途徑協(xié)同調(diào)節(jié)的過程。KEGG分析結(jié)果也表明RA和FLU均可以通過5-羥色胺能突觸、ErbB信號通路、PI3K-Akt信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、HIF-1信號通路等信號途徑發(fā)揮抗抑郁作用，說明RA與FLU可能作用于同一信號通路的不同靶點(diǎn)發(fā)揮作用。此外，在GO富集分析和KEGG富集分析預(yù)測的GO terms和信號通路中，RA得到的GO terms和潛在信號通路數(shù)量遠(yuǎn)大于FLU，均說明RA的抗抑郁機(jī)制比FLU更加廣泛。

在RA的HUB基因中，RA已經(jīng)被證明可以調(diào)節(jié)腦缺血大鼠AKT、CASP3的水平發(fā)揮抗炎、神經(jīng)保護(hù)等作用［18］，以RA為主要成分的薄荷可以通過作用于MAPK1、MAPK8、PTGS2在束縛大鼠模型中發(fā)揮抗應(yīng)激作用，并且與RA含量成正比［19］，說明RA可能作用于這些靶點(diǎn)發(fā)揮抗抑郁作用。雖然目前沒有關(guān)于RA在神經(jīng)退行性疾病中與MMP9、MMP2、EGFR、CCL2、JAK2，但研究表明，這些靶點(diǎn)都參與了炎癥的發(fā)病機(jī)制，RA可以作用于MMP9、MMP2、EGFR而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力［20-21］。此外，目前沒有關(guān)于RA與SRC、IGF1、ESR1、AR、ERBB2的相關(guān)報道，而SRC與抑郁癥大鼠紋狀體神經(jīng)元有著密切關(guān)系［22］，ERBB2也與嚙齒類動物紋狀體神經(jīng)元興奮有關(guān)［23］。抑郁癥患者的IGF1水平高于健康人群，而IGF1又可以作用于大腦的IGF1受體發(fā)揮抗抑郁作用［24-25］。分子對接結(jié)果也驗(yàn)證了RA與其關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白具有良好的結(jié)合能力，并且與MMP2、MMP9、MAPK8、JAK2、EGFR、CASP3、AR、AKT1之間具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。與此一致，KEGG富集分析結(jié)果也表明RA可以通過腫瘤壞死因子信號通路、MAPK信號通路、雌激素信號通路、趨化因子信號通路等發(fā)揮抗抑郁作用。

FLU的HUB基因中，BDNF、CYP2D6、SLC6A4、MAOA與FLU的抗抑郁治療反應(yīng)相關(guān)，可以參與到突觸可塑性調(diào)節(jié)、藥物分布、中樞5-HT和去甲腎上腺素的代謝和調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞等生物學(xué)過程［26］。AChE、HTR1A、HTR2A、ADRA2A、SLC6A2、SLC6A3單胺能神經(jīng)傳遞相關(guān)，HTR1A、AChE、ADRA2A在抑郁動物模型FLU藥物反應(yīng)有關(guān)，SLC6A2、SLC6A3是FLU治療抑郁的作用靶點(diǎn)［27-31］，HTR2A與FLU的治療反應(yīng)無關(guān)。HTR1B啟動子區(qū)域的甲基化水平與FLU的臨床效果呈負(fù)相關(guān)［32］。FLU可以改善抑郁小鼠脊髓的IGF1表達(dá)水平［33］，還可以調(diào)節(jié)抑郁大鼠CASR表達(dá)水平，改善突觸可塑性［34］。FLU還可以作用于大鼠伏隔核的DRD2、DRD3發(fā)揮抗抑郁作用［35］。DRD4的多態(tài)性與抑郁癥相關(guān)［36］，OPRK1、OPRM1與嚙齒類動物的社交行為相關(guān)［37］，目前沒有FLU作用于這兩個靶點(diǎn)的報道。KEGG富集分析結(jié)果也表明FLU可以神經(jīng)活性配體受體相互作用、鈣信號通路、多巴胺能突觸、cAMP信號通路等發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上所述，RA的HUB基因主要通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗抑郁作用，而FLU的HUB基因主要通過調(diào)節(jié)單胺能神經(jīng)傳遞和突觸可塑性發(fā)揮抗抑郁作用。此外，已有研究表明RA可以作用于BDNF調(diào)節(jié)抑郁大鼠神經(jīng)可塑性［38］，也可以調(diào)節(jié)大鼠多巴胺能神經(jīng)傳遞發(fā)揮抗神經(jīng)毒性作用［39］，進(jìn)一步說明RA的抗抑郁機(jī)制比FLU更加廣泛。提示RA可能與FLU通過聯(lián)合用藥發(fā)揮更好的抗抑郁作用。