肖 雪，溫 暖，段 輝

（西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，化學(xué)基礎(chǔ)國家民委重點實驗室，四川 成都 610041）

脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)是生物體正常運作和發(fā)育必不可少的遺傳物質(zhì)，大多數(shù)生物都是以其作為遺傳信息的載體[1].對生物樣品中特定序列DNA 的檢測可廣泛地應(yīng)用于基因序列分析、腫瘤的早期診斷以及遺傳性疾病篩查等領(lǐng)域[2-3]. 因此，發(fā)展快速、簡便、靈敏的DNA 檢測方法有著十分重要的意義. 近年來，定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)法、DNA 微陣列法、表面等離子體共振法、電化學(xué)法、熒光法等已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于檢測DNA 特定序列[4-7]. 其中，熒光法因其具有選擇性好、分析速度快、成本低等優(yōu)點，受到廣泛關(guān)注[8-9].

作為石墨烯的衍生物，氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)，具有良好的水分散性、生物相容性、電子和熱性能[10-11].GO 對吸附在其表面的熒光基團(tuán)的熒光具有強(qiáng)烈的猝滅作用，因此，可作為多種熒光體系的猝滅劑[12-13].此外，基于GO 對單鏈DNA(single stranded DNA，ssDNA)的結(jié)合力強(qiáng)于雙鏈 DNA(double stranded DNA，dsDNA)的特點，能實現(xiàn)對核酸單雙鏈特異性識別[14-15].基于此，GO 已經(jīng)廣泛地用于構(gòu)建熒光生物傳感器實現(xiàn)對DNA、RNA、蛋白質(zhì)和金屬離子的分析檢測[16-19].Yang 等首次設(shè)計了基于GO 的熒光生物傳感器用于ssDNA 的靈敏檢測，該方法中羧基熒光素(carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)修飾的 ssDNA 作為熒光探針吸附在GO 表面，熒光被猝滅，當(dāng)加入靶物后，探針與靶物形成雙鏈并從GO 表面釋放，熒光恢復(fù)，通過加入靶物前后熒光信號差實現(xiàn)ssDNA 的靈敏檢測[20].在該方法中熒光探針鏈與GO 直接相連，作用力較強(qiáng)，加入靶物后探針不易從GO 脫離，檢測靈敏度受到限制.因此，Ihara 等設(shè)計了一種基于鏈置換的熒光檢測法，該方法以GO 為熒光猝滅劑，熒光探針鏈通過一條捕獲DNA 與GO 間接相連，加入靶物后通過競爭反應(yīng)，探針鏈更易從GO 上釋放，檢測靈敏度提高[21].但該方法增加了捕獲DNA，檢測前需要和探針鏈進(jìn)行雜交反應(yīng)，增加了檢測時間和成本. 本課題以熒光染料FAM 標(biāo)記的ssDNA 為探針分子，以GO為熒光猝滅劑，構(gòu)建了一種用于快速檢測ssDNA 的新型熒光生物傳感器. 傳統(tǒng)的熒光法中，熒光染料修飾的DNA 探針通過π-π堆積和靜電相互作用與GO 直接相連，當(dāng)加入靶物后，由于探針和GO 之間強(qiáng)的相互作用使得探針不易從GO 上釋放，從而限制了檢測靈敏度[21-22].為了進(jìn)一步提高檢測靈敏度，本方法以發(fā)卡狀的DNA 作為熒光探針，構(gòu)建一種新型熒光檢測平臺實現(xiàn)對ssDNA 的靈敏檢測.

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

試劑:單層GO 購買于南京先豐納米材料科技有限公司，DNA(表1)購買于生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑購買于成都市科龍化工試劑廠.

表1 實驗中所用 DNA 序列Table 1 The list of oligonucleotide sequences

儀器:Dual-FL 熒光光譜儀(HORIBA 公司)，AR224CN 電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)，TG-16 臺式高速離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司)，KQ5200E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司).

1.2 實驗方法

反應(yīng)過程:將probe DNA，磷酸緩沖液(pH 7.0，濃度 50 nM 的磷酸緩沖液，含1 M NaCl、20 mM MgCl2)和超純水，漩渦混勻.將混合溶液在95 ℃孵育5 min 后，室溫冷卻30 min.隨后加入一定濃度的GO 溶液，室溫孵育30 min.最后，加入待檢測靶物DNA(target DNA)并用超純水定容至400 μL，37 ℃孵育30 min.

熒光測定:在熒光光譜儀上測定反應(yīng)后溶液熒光強(qiáng)度.

激發(fā)波長:480 nm，發(fā)射波長:521 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理及可行性分析

該方法的檢測原理示意圖見圖1，F(xiàn)AM 標(biāo)記的probe DNA 作為熒光探針，呈現(xiàn)發(fā)卡狀，其修飾有熒光染料的單鏈部分通過π-π電子堆積作用吸附在GO表面，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用，熒光被猝滅，相比于傳統(tǒng)的方法，探針保留一部分未與GO 直接相連，因此整個探針在GO 上呈“半站立”狀態(tài)，從而提高探針從GO 上釋放的能力. 當(dāng)加入 target DNA 后，由于probe DNA 和 target DNA 雜交形成雙鏈從而使得probe DNA 從GO 上面脫落，熒光恢復(fù).通過測定加入target DNA 前后傳感系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度變化可以實現(xiàn)定量檢測target DNA.

為驗證該設(shè)計方法的可行性，加入target DNA 前后傳感系統(tǒng)熒光強(qiáng)度變化被測定. 如圖2 所示，當(dāng)probe DNA 單獨存在時，系統(tǒng)發(fā)射出很強(qiáng)的熒光信號.加入GO 后由于探針吸附在GO 表面發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，系統(tǒng)熒光信號隨之下降. 在向混合液中加入 target DNA 后，probe DNA 和 target DNA 雜交形成雙鏈，并從 GO 上面脫離，可檢測到傳感系統(tǒng)熒光信號增強(qiáng).

圖2 加入GO 和target DNA 前后熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra in the absence and presence of target DNA with/without subsequent incubation with GO

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

為了實現(xiàn)實驗條件的最優(yōu)化，在固定probe DNA濃度為50 nM、target DNA 濃度為5 nM 的條件下，GO濃度、GO 吸附 probe DNA 反應(yīng)溫度、target DNA 與probe DNA 雜交反應(yīng)溫度及時間對體系熒光強(qiáng)度變化的影響被考察.

2.2.1 GO 濃度的優(yōu)化

首先探究了該方法中GO 濃度對檢測信號的影響.在未加入target DNA 時，隨著GO 濃度的增大，吸附在GO 上的probe DNA 隨之增多，系統(tǒng)熒光強(qiáng)度不斷下降，如圖3(a)所示. 當(dāng)加入 target DNA 后，probe DNA 與target DNA 雜交形成雙鏈，從GO 上面脫落，系統(tǒng)熒光信號明顯上升，如圖3(b)所示. 從圖3(c)中能看出系統(tǒng)的熒光差值先上升后下降，在GO 濃度為50 μg/mL 時系統(tǒng)熒光信號差達(dá)到最大值，因此，選擇50 μg/mL 的GO 濃度作為最佳的GO 濃度用于后續(xù)實驗.

圖3 不同GO 濃度下加入 target DNA 前后熒光強(qiáng)度變化對比圖(a) GO 吸附probe DNA 的熒光強(qiáng)度隨GO 濃度的變化.(b) target DNA 脫吸附probe DNA 的熒光強(qiáng)度隨GO 濃度的變化(c) GO 吸附probe DNA 和target DNA 脫吸附probe DNA 的熒光強(qiáng)度及它們的熒光強(qiáng)度差隨GO 濃度的變化Fig.3 Fluorescence intensity before and after the addition oftarget DNA with different concentrations of GO.(a) Fluorescence spectra of the probe with GO.(b) Fluorescence spectra of the probe-target DNA duplex with GO.(c) Fluorescence intensity changes of the probe and the probe-target DNA duplex as a function of GO concentration

2.2.2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

在本熒光傳感系統(tǒng)中，溫度可能影響GO 吸附探針DNA 和雙鏈雜交的能力，當(dāng)升高反應(yīng)溫度時，可以促進(jìn)target DNA 與probe DNA 雜交后的脫吸附反應(yīng)，但溫度若高于雙鏈的解鏈溫度，則會導(dǎo)致反應(yīng)效率下降，因此，為了達(dá)到最佳檢測性能，實驗反應(yīng)溫度被優(yōu)化.從圖4 可以看出，GO 和 probe DNA 反應(yīng)溫度在37 ℃時，熒光信號強(qiáng)度差較大.因此，選擇37 ℃作為GO 吸附probe DNA 的最佳溫度用于后續(xù)實驗. 圖5為不同脫吸附溫度下系統(tǒng)的熒光信號圖，通過對比可以看出，系統(tǒng)在37 ℃時，熒光信號變化大.因此，選擇37 ℃作為target DNA 脫吸附probe DNA 的最佳溫度用于后續(xù)實驗.

圖4 probe DNA 和GO 不同吸附溫度下加入target DNA 前后熒光強(qiáng)度變化對比圖Fig.4 Fluorescence intensity response at different incubation temperature of the complex of probe DNA on GO

圖5 不同吸附溫度下加入target DNA前后熒光強(qiáng)度變化對比圖Fig.5 Fluorescence intensity response of probe DNA-GO with target DNA at different temperature

2.2.3 反應(yīng)時間的優(yōu)化

此外，加入target DNA 后，熒光恢復(fù)過程所需的最佳反應(yīng)時間被考察. 如圖6 所示，系統(tǒng)熒光強(qiáng)度差值在30 min 時達(dá)到最大，而后趨于穩(wěn)定. 因此，選擇30 min 作為 target DNA 脫吸附 probe DNA 反應(yīng)時間作為最佳反應(yīng)時間用于后續(xù)實驗.

圖6 不同反應(yīng)時間下加入target DNA 前后傳感系統(tǒng)熒光信號變化對比圖Fig.6 Fluorescence intensity response of probe DNA-GO with target DNA at different reaction time

2.3 ssDNA 的檢測

在以上優(yōu)化好的最佳實驗條件下，加入不同濃度target DNA 后系統(tǒng)熒光強(qiáng)度的變化被測定，以評估該檢測方法是否可用于定量檢測ssDNA. 如圖7 所示，熒光強(qiáng)度比 F/F0(F0和F 分別表示加入 target DNA前后傳感系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度)與target DNA 濃度的對數(shù)值在20 ～1 000 pM 的范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系.線性方程為y = 0.421 6 x+0.466 3(y 指熒光強(qiáng)度比值，x 指 target DNA 濃度的對數(shù))，即 F/F0=0.421 6 lgc+0.466 3，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6.此外，基于F/F0=a+b x(首先計算空白對照的熒光強(qiáng)度平均值，再計算出測得值與平均值的比值，然后再計算比值的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ， 然后將3σ 代入方程中的F/F0，計算出 x 值)可估算出該方法的最低檢測限為0.11 pM.與已發(fā)展的各類ssDNA 檢測方法相比，具有較低的檢測限和較寬的檢測范圍(表2).

表2 檢測限比較Table 2 Comparison of detection limits

圖7 F/F0與target DNA 濃度的對數(shù)的線性關(guān)系Fig.7 The linear relationship betweenF/F0 and the lg of the target DNA concentration

2.4 方法的選擇性

為了考察本方法的選擇性，在相同實驗條件下，考察了加入相同濃度的target，mis-3、mis-5 后熒光信號變化.實驗結(jié)果(圖8)表明，只有當(dāng)target 存在時，熒光強(qiáng)度差值較高，與mis-3、mis-5 產(chǎn)生的信號有較明顯的差別，證明了本方法具有較好的選擇性.

圖8 方法的選擇性Fig.8 Specificity of the target DNA assay over mismatched

3 總結(jié)

本文以GO 為熒光猝滅基底，以修飾了熒光染料的發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA 為熒光探針，建立了一種新型ssDNA 熒光檢測法.該方法線性范圍為20 ～1 000 pM，檢出限達(dá)到0.11 pM，是一種靈敏度高、操作簡單易行，具有潛在的應(yīng)用性的熒光生物分子檢測法. 此外，通過改變熒光探針的序列，還可實現(xiàn)蛋白質(zhì)、金屬離子等的靈敏檢測，因此，本文建立了一種具有通用性的熒光生物傳感器，在生物分子分析和疾病早期診斷領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用前景.