王麗麗，徐東亮，王詩涵

(1. 廣州新華學(xué)院 藥學(xué)院，廣東 廣州 510520；2. 吉林大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

0 引言

巴戟天(MorindaofficinalisHow.)為茜草科巴戟屬植物[1]，來源于熱帶和亞熱帶地區(qū),干燥根具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、驅(qū)風(fēng)濕、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老之功效，是我國(guó)著名的“四大南藥”之一[2-3]。巴戟天可做藥用，也是一種常見的保健食品原料。

研究表明，巴戟天含有蒽醌類、環(huán)烯醚萜類、糖類、氨基酸、有機(jī)酸類及微量元素等成分，其中蒽醌類成分具有抗骨質(zhì)疏松、抗衰老的作用[4]。1-甲氧基-2-羥基蒽醌能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，且抑制率可達(dá)44.63%[5]，1,3-二羥基-2-甲氧基蒽醌對(duì)單純皰疹病毒有一定的抑制作用[6]。

多指標(biāo)定量測(cè)定已成為中藥質(zhì)量控制的發(fā)展趨勢(shì)，傳統(tǒng)的多指標(biāo)定量測(cè)定存在著對(duì)照品消耗量大等缺陷。一測(cè)多評(píng)法(quantitative analysis of multi-components via single marker,QAMS)是通過一個(gè)指標(biāo)性成分的測(cè)定來實(shí)現(xiàn)多個(gè)指標(biāo)性成分的同時(shí)測(cè)定，該方法已被用于中藥化學(xué)成分的含量測(cè)定[7-9]，但目前尚無采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定巴戟天蒽醌類成分的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探索對(duì)巴戟天藥材中1,3-二羥基-2-羥甲基蒽醌、1-甲氧基-2-羥基蒽醌、甲基異茜草素-1-甲醚、1,3,6-三羥基-2-甲氧基蒽醌、2-甲基蒽醌等5種蒽醌類成分的同步測(cè)定，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器和試藥

Agilent1260高效液相色譜儀；Waters Alliance E2695高效液相色譜儀；LC-10ATVP型島津液相色譜儀；色譜柱：Venusil MP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Sartorious型十萬分之一天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；WP-UP-Ⅲ-10超純水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限)。

對(duì)照品均采購于成都明睿科技有限公司，1,3-二羥基-2-羥甲基蒽醌(批號(hào)：478-08-0)；1-甲氧基-2-羥基蒽醌(批號(hào)：6170-06-5)；甲基異茜草素-1-甲醚(批號(hào)：7460-43-7)；1,3,6-三羥基-2-甲氧基蒽醌(批號(hào)：87686-86-0)；2-甲基蒽醌(批號(hào)：84-54-8)。11批巴戟天藥材收集于廣西、廣東、福建、海南等地，經(jīng)吉林大學(xué)王廣樹教授鑒定，為茜草科植物巴戟天( Morinda officinalis How.) 的干燥根，具體產(chǎn)地見表1。液相用甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司)；定容甲醇為分析純(北京化工廠)，水為超純水(自制)。

2 方法

2.1 色譜條件

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀；色譜柱：Venusil MP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～40 min，38%A；40～50 min，38%A→55%A；50～70 min，55%A→60%A)；流速：0.8 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：266 nm。

表1 11批巴戟天藥材來源Fig. 1 11 batches of M. officinalis How. source

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取1,3-二羥基-2-羥甲基蒽醌、1-甲氧基-2-羥基蒽醌、甲基異茜草素-1-甲醚、1,3,6-三羥基-2-甲氧基蒽醌和2-甲基蒽醌對(duì)照品適量，制成濃度分別為3.206 5、0.423 5、0.304 0、0.374 5、0.143 0 g/L的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5 mL，置2.5 mL量瓶中制成一系列濃度的混合對(duì)照品溶液，避光低溫保存。

2.3 供試品溶液的制備

稱取巴戟天藥材粉末約3 g，置圓底燒瓶中，加氯仿80 mL，回流提取兩次，每次2 h，濾液蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，過濾，得到供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性

混合對(duì)照品溶液與供試品溶液中各目標(biāo)成分峰與峰的分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)以所測(cè)目標(biāo)成分計(jì)均大于8 000。詳見圖1、圖2。

3.2 線性關(guān)系

定容、進(jìn)樣分析，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X，mg/L)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸計(jì)算，得到各對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及線性范圍，結(jié)果見表2。

注：1為1,3-二羥基-2-羥甲基蒽醌；2為1-甲氧基-2-羥基蒽醌；3為甲基異茜草素-1-甲醚；4為1,3,6-三羥基-2-甲氧基蒽醌；5為2-甲基蒽醌。

注：1為1,3-二羥基-2-羥甲基蒽醌；2為1-甲氧基-2-羥基蒽醌；3為甲基異茜草素-1-甲醚；4為1,3,6-三羥基-2-甲氧基蒽醌；5為2-甲基蒽醌。

表2 5種蒽醌類成分的線性關(guān)系考察Fig. 2 Investigation on the linear relationship of five anthraquinones

3.3 精密度

5種目標(biāo)成分峰面積RSD值分別為0.27%、0.36%、0.37%、0.46%、0.60%。

3.4 穩(wěn)定性

5種目標(biāo)成分峰面積RSD值分別為0.22%、0.36%、0.71%、0.33%、0.35%。

3.5 重復(fù)性

5種目標(biāo)成分峰面積RSD值分別為1.19%、1.61%、1.90%、1.37%、1.52%，平均含量分別為0.219 9、0.078 3、0.023 2、0.001 5、0.003 2 mg/g。

3.6 加樣回收率

5種目標(biāo)成分的平均回收率分別為100.33%、100.17%、99.04%、98.44%、102.22%，RSD值分別為0.37%、1.15%、0.84%、1.58%、1.88%。

3.7 相對(duì)校正因子

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=ax+b，可以得出x=(y-b)/a=y/a-b/a，當(dāng)a/b>100時(shí)，b/a值可忽略，此時(shí)x=y/a[10]。相對(duì)校正因子用二者斜率a之比計(jì)算，計(jì)算公式為：fk/s=ak/as。其中as為內(nèi)參物斜率；ak為其他目標(biāo)成分斜率。

本實(shí)驗(yàn)以1-甲氧-2-羥基蒽醌(Ⅱ)為內(nèi)參物(1.000)，計(jì)算1,3-二羥基-2-羥甲基蒽醌(Ⅰ)、甲基異茜草素-1-甲醚(Ⅲ)、1,3,6三羥基-2-甲氧基蒽醌(Ⅳ)和2-甲基蒽醌(Ⅴ)的相對(duì)校正因子分別為0.0626、1.4614、1.2765、1.1582。

3.7.1 不同儀器及色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

本實(shí)驗(yàn)考察了Agilent 1260、Waters E2695、LC-10ATVP色譜儀和兩種不同色譜柱Agilent TC-C18和Venusil MP C18對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果顯示目標(biāo)成分相對(duì)校正因子RSD均小于2.00%，結(jié)果如表3所示。

表3 不同儀器和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Fig. 3 Effect of different instruments and columns on relative correction factors

3.7.2 不同技術(shù)人員對(duì)相對(duì)校正因子的影響

本實(shí)驗(yàn)考察了3名不同技術(shù)人員對(duì)目標(biāo)成分相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果顯示，各目標(biāo)成分相對(duì)校正因子的RSD值均小于2.00%。

3.7.3 待測(cè)成分色譜峰的定位

本實(shí)驗(yàn)考察了目標(biāo)成分在3個(gè)不同色譜儀、2個(gè)不同色譜柱上的相對(duì)保留時(shí)間(t)，作為色譜峰定位參數(shù)。結(jié)果表明，各目標(biāo)成分相對(duì)保留時(shí)間變化較小，RSD值均小于2.00%，結(jié)果如表4所示。

3.8 11批樣品含量測(cè)定結(jié)果

每批藥材制備2份平行供試品溶液，分別采用外標(biāo)法(external standard method，ESM)和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算各目標(biāo)成分的含量，結(jié)果顯示各目標(biāo)成分含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于2.11%，結(jié)果如表5所示。

表4 不同儀器和色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響Fig. 4 Effects of different instruments and columns on relative retention time

表5 不同產(chǎn)地巴戟天5種蒽醌類成分測(cè)定結(jié)果Fig. 5 Determination of five anthraquinones in M. officinalis How. in different areas

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)法，首次實(shí)現(xiàn)了巴戟天藥材中5種蒽醌類成分的同步測(cè)定。此方法的建立，為巴戟天藥材蒽醌類成分的含量測(cè)定節(jié)約了成本。不同產(chǎn)地的巴戟天中蒽醌類成分的含量差異較大，其原因可能與采摘時(shí)間及不同產(chǎn)地有關(guān)。

本研究為巴戟天的功效物質(zhì)基礎(chǔ)和開發(fā)利用提供了科學(xué)的理論依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)其主要化合物的生物活性進(jìn)行深入研究，可以為巴戟天作為藥品或者保健品的開發(fā)提供必要的基礎(chǔ)。