黃淑萍，王曉曼，許智恒，張中帥

(信陽師范學(xué)院 地理科學(xué)學(xué)院/河南省水土環(huán)境污染協(xié)同防治重點實驗室，河南 信陽 464000)

0 引言

由于工農(nóng)業(yè)快速發(fā)展和人類活動加劇，大氣CO2濃度以每年0.45%的速率快速增加，據(jù)IPCC(2014)評估報告[1]，目前大氣中CO2濃度約為385 μmol/mol，專家預(yù)測到2050年將上升到550 μmol/mol，21世紀末CO2濃度將達到700 μmol/mol。賈夏等[2]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度大氣CO2不僅影響土壤微生物功能及群落多樣性變化，還可以影響土壤酶活性，高濃度大氣CO2通過提高光合同化率而增加植物莖和根系生物量，改變植物根系分泌量，從而影響土壤理化性質(zhì)和有機質(zhì)含量，由此提高土壤肥力，為土壤微生物提供適宜的生長環(huán)境。與此同時，土壤重金屬污染是另一個備受關(guān)注的環(huán)境問題，隨著礦物燃料燃燒、污水灌溉和農(nóng)藥化肥的廣泛使用，使得大量重金屬輸入到土壤生態(tài)系統(tǒng)中，土壤重金屬污染狀況日益加劇。其中鉛(Pb)是環(huán)境中普遍存在且毒性很強的重金屬污染物，嚴重威脅植物際土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全性和穩(wěn)定性，STEFANOWICZ等[3]研究發(fā)現(xiàn)，土壤Pb污染條件下土壤微生物及酶活性可能受到重要影響，會直接關(guān)系到植物根際土壤礦質(zhì)和有機質(zhì)元素的轉(zhuǎn)化，影響根系對營養(yǎng)元素的吸收和利用，最終改變植物的營養(yǎng)狀況及品質(zhì)。高濃度大氣CO2通過提高植物凈初級生產(chǎn)力，導(dǎo)致有機化合物大量流入根際土壤，影響土壤中重金屬生物利用度，從而影響微生物和植物對重金屬的吸收利用。為此，在高濃度大氣CO2和土壤重金屬污染并存的情況下，對植物根際微環(huán)境的響應(yīng)研究已成為近年來科研工作者關(guān)注的焦點。

根際微環(huán)境是在植物根系分泌和吸收兩個動態(tài)過程作用下形成的，植物根系通過脫落物或產(chǎn)生分泌物為根際區(qū)土壤微生物提供有效碳源，微生物通過分解有機物質(zhì)又可為植物提供營養(yǎng)，從而致使根際土壤與根外土壤的理化性質(zhì)和生物學(xué)性征存在很大差異，呈現(xiàn)出一定的根際效應(yīng)。目前已有大量關(guān)于植物根際微環(huán)境方面的研究報道，但這些研究多聚焦于單獨高濃度大氣CO2或單獨土壤重金屬污染條件下植物根際與非根際土壤有機質(zhì)、微生物特征及土壤酶活性等方面[2-3]，由于現(xiàn)階段全球高濃度大氣CO2與土壤重金屬污染問題是同時存在的，二者聯(lián)合效應(yīng)對植物根際微域的影響研究仍然缺乏，尤其是聯(lián)合效應(yīng)下植物根際微域中有機化合物和微生物特性之間的相關(guān)性關(guān)系仍有待研究。

鑒于此，本研究采用CO2開頂箱控制系統(tǒng)(Open top chambers，簡稱為OTCs)，對盆栽刺槐1年生幼苗進行高濃度大氣CO2與土壤Pb污染聯(lián)合處理試驗，旨在探討刺槐根際土壤生化特性變化及其相關(guān)性對兩者環(huán)境因子聯(lián)合作用的響應(yīng)規(guī)律，為研究全球氣候變化背景下重金屬污染土壤生態(tài)系統(tǒng)的響應(yīng)及反饋狀況提供理論數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用刺槐種子購于西北農(nóng)林科技大學(xué)。供試土壤來源于陜西關(guān)中(34°16′N，108°54′E)地區(qū)，土壤類型為淋溶土棕壤。采用多點混合采樣法采集0～20 cm層土壤，去除石子等較大雜物后過5 mm 篩并充分混勻，土壤基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤理化性質(zhì)Tab. 1 The physical and chemical properties of the tested soils

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用裂區(qū)設(shè)計，主區(qū)因素：CO2濃度；副區(qū)因素：Pb，考慮交互作用。試驗共設(shè)3對OTCs氣室，其中3個為高濃度大氣CO2處理氣室，并在每個氣室中嵌套2組Pb污染處理。依據(jù)“IPCC(2014)評估報告”[1]，在OTCs氣室中由自動控制系統(tǒng)將高濃度大氣CO2保持在700 ± 30 μmol/mol，對照CO2濃度約為385 ± 30 μmol/mol。各氣室之間距離較遠，彼此間小氣候差異可忽略不計。在氣室中隨機排列重金屬處理盆栽，根據(jù)國家《土壤環(huán)境質(zhì)量標準》(GB 15618-1995)設(shè)置添加0 mg/kg和500 mg/kg 兩種Pb濃度，最終形成15.6 mg/kg和515.6 mg/kg 兩個Pb水平，分別記為Pb0和Pb500。本試驗同一Pb水平設(shè)置9個重復(fù)，每個OTCs氣室中(共6個)，放置Pb0、Pb500處理盆栽各3盆，因此，試驗盆栽共計36盆。采用向土壤中添加外源污染物的方式，向土壤中加入Pb(NO3)2溶液以實現(xiàn)Pb污染，在添加外源污染物質(zhì)前測定土壤含水量以準確得出重金屬添加量，同時保證各處理盆栽土壤含水量相同，污染土壤平衡一個月后裝盆，每盆裝入25 kg土壤。于2015年5月1日播種刺槐種子，待出苗10 d后，根據(jù)生長狀況，每盆選留40棵大小均勻且健壯的幼苗用作實驗。每個盆中都裝有土壤濕度傳感器以進行土壤水分測定，設(shè)置為每小時讀數(shù)一次，在整個試驗期間根據(jù)土壤平均含水量采用自來水進行澆灌，確保土壤水分含量約為田間最大持水量的60%。盆栽中的雜草及幼苗落葉均被人工清理干凈。本試驗4個處理分別為：1)ACO2：對照組(385 μmol/mol + Pb0)；2)ECO2：高濃度大氣CO2處理(700 μmol/mol + Pb0)；3)Pb：Pb污染處理(385 μmol/mol + Pb500)；4)ECO2+ Pb：高濃度大氣CO2+ Pb污染處理(700 μmol/mol + Pb500)。

1.3 樣品采集及測定方法

1.3.1 土壤取樣方法

2016年5月(從播種開始試驗處理滿一年)開始采樣，每個盆栽土壤樣品即為1份土樣，故同一Pb水平的土壤樣品共計9份。每個盆栽布設(shè)3個取樣點，即每個盆栽挖取3棵刺槐幼苗，采用抖落法獲取根際土壤，再將3份根際土壤混合成1份，作為此盆栽的土壤樣品。將挖取的整株植株抖掉根系外圍土，剩余的即為根際土樣，用毛刷刷下根表土，然后用鑷子將細根及其他雜物移除，將土壤混勻分裝好過2 mm篩，在4 ℃環(huán)境下保存并盡快地完成土壤理化指標和微生物特性的測定分析。

1.3.2 測定指標及方法

土壤pH值采用酸度計電位法測定，總有機碳(TOC)采用重鉻酸鉀外加熱法測定，可溶性有機碳(DOC)采用TOC-Analyzer分析儀測定，總糖采用3,5-二硝基水楊酸法測定，酚酸采用福林酚比色法測定，氨基酸采用茚三酮比色法測定，有機酸采用FeCl3分光光度法測定。上述具體測試方法及步驟詳見《土壤分析技術(shù)指南》[4]。土壤細菌、真菌、放線菌數(shù)量采用CFU菌落計數(shù)法[5]測定，微生物量碳(MBC)采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法[6]測定，總微生物活性(FDA)采用熒光素雙醋酸酯法[7]測定。土壤脲酶采用苯酚鈉比色法[8]、脫氫酶采用三苯基四氮唑氯化物(TTC)比色法[9]、轉(zhuǎn)化酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法[10]、β-葡萄糖苷酶采用以對-硝苯-β-葡萄糖苷為底物進行酶解，并于400～420 nm直接測定底物水解釋放的配基對-硝基苯酚的方法[11]、L-天門冬酰胺酶采用奈氏試劑比色法[12]測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2016進行數(shù)據(jù)處理，圖表數(shù)據(jù)為平均值和標準誤差(SE)，運用SPSS 19.0進行差異顯著性分析(Tukey法，P<0.05)和相關(guān)性分析。采用Sigmaplot 12.5進行繪圖，采用R軟件進行冗余分析(RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高濃度大氣CO2與Pb污染下土壤pH值及有機化合物變化

高濃度大氣CO2和Pb污染對刺槐根際土壤有機化合物的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 高濃度大氣CO2和Pb污染對刺槐根際土壤有機化合物的影響Fig. 1 Effects of elevated CO2 and Pb contamination on organic compounds in rhizosphere soils of Robinia Pseudoacacia L.

由圖1可見，與對照大氣CO2濃度(ACO2)相比，高濃度大氣CO2(ECO2)使刺槐根際土壤TOC、DOC、MBC、總糖、酚酸、氨基酸和有機酸含量分別升高了9.39%、27.80%、4.57%、11.29%、17.36%、8.45%和6.22%。Pb污染使刺槐根際土壤TOC、總糖、氨基酸和有機酸含量分別增加了6.09%、12.13%、6.02%和13.51%，而使DOC、MBC和酚酸含量分別降低了26.30%、30.78%和7.57%。與單獨Pb污染相比，ECO2+ Pb污染下土壤DOC、MBC、總糖、酚酸、氨基酸和有機酸含量分別提高了21.07%、23.61%、13.37%、15.03%、10.11%和7.14%，而TOC含量變化不顯著。不同處理條件下刺槐根際土壤pH值無明顯變化。

2.2 高濃度大氣CO2與Pb污染下土壤微生物數(shù)量及活性變化

高濃度大氣CO2提高了刺槐根際土壤微生物數(shù)量及活性(圖2)。與對照組ACO2相比，ECO2處理下細菌、真菌、放線菌和微生物活性(FDA)分別提高了3.29%、3.76%、7.22%和9.54%。Pb污染下細菌和真菌數(shù)量較對照組ACO2下降了4.06%和4.53%，放線菌和FDA下降趨勢較大，分別為12.86%和10.89%。與單獨Pb污染相比，ECO2+ Pb污染下細菌、真菌、放線菌和FDA分別提高了1.29%、15.18%、4.65%和6.12%。由圖2可知，高濃度大氣CO2和Pb污染對土壤微生物特征呈相反效應(yīng)，而在兩環(huán)境因子聯(lián)合作用下，刺槐根際土壤微生物數(shù)量及活性整體呈上升趨勢，表明高濃度大氣CO2提高了Pb污染土壤中微生物數(shù)量及活性。

圖2 高濃度大氣CO2和Pb污染對刺槐根際土壤微生物數(shù)量的影響Fig. 2 Effects of elevated CO2 and Pb contamination on microbial populations in rhizosphere soils of Robinia Pseudoacacia L.

2.3 CO2濃度升高與Pb污染下土壤酶活性變化

高濃度大氣CO2下刺槐根際土壤酶活性呈不同的響應(yīng)特征(圖3)，ECO2處理下土壤脲酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)化酶、β-葡萄糖苷酶活性較ACO2處理分別增加了3.31%、8.47%、6.73%和5.71%，而L-天門冬酰胺酶活性下降了11.62%。與ACO2相比，Pb污染使土壤脲酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)化酶、β-葡萄糖苷酶活性分別降低了26.97%、12.94%、4.74%和16.98%，而使土壤L-天門冬酰胺酶活性升高了20.43%。ECO2+ Pb污染與單獨Pb污染相比，土壤脲酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)化酶、β-葡萄糖苷酶活性分別提高了8.06%、13.58%、6.59%和7.85%，L-天門冬酰胺酶下降了14.56%，高濃度大氣CO2與Pb污染對土壤酶活性表現(xiàn)出相反的效應(yīng)，整體上除L-天門冬酰胺酶外，整體上兩環(huán)境因子聯(lián)合作用提高了刺槐根際土壤酶活性。

圖3 高濃度大氣CO2和Pb污染對刺槐根際土壤酶活性的影響Fig. 3 Effects of elevated CO2 and Pb contamination on enzyme activities in rhizosphere soils of Robinia Pseudoacacia L.

2.4 高濃度大氣CO2與Pb污染下土壤有機化合物和微生物特性的動態(tài)關(guān)聯(lián)

以土壤微生物特性為響應(yīng)變量，土壤有機化合物為解釋變量，對高濃度大氣CO2和Pb污染條件下的根際土壤微生物特性進行冗余分析，得到排序圖4。如圖4所示，4種實驗處理條件明顯分開，A處理(對照)分布于上方中間位置，P處理(重金屬)主要位于左上方，E處理(高CO2)主要分布在右側(cè)位置，EP處理(高CO2+ Pb)分布在右下方，說明高濃度大氣CO2與Pb污染使土壤有機化合物和微生物特性分布產(chǎn)生明顯差異。RDA前兩軸分別解釋了微生物特性的65.83%和22.45%。圖4藍線代表土壤有機化合物，線段越長代表影響越顯著，紅線代表土壤微生物及酶活性，可見總糖、酚酸、MBC、 pH 值為根際土壤微生物特性的主要影響因子，而氨基酸、DOC、TOC對土壤微生物的影響較??；解釋變量與響應(yīng)變量之間夾角越接近0°代表正相關(guān)性越顯著，夾角越接近180°代表負相關(guān)越顯著。由圖4可以看出，總糖、酚酸、MBC與細菌、放線菌、脲酶、轉(zhuǎn)化酶、β-葡萄糖苷酶呈正相關(guān)關(guān)系，與L-天門冬酰胺酶呈負相關(guān)關(guān)系，土壤pH值與真菌、FDA呈正相關(guān)關(guān)系，該結(jié)果與相關(guān)分析(表2)的結(jié)果一致。

圖4 土壤性狀與土壤微生物特征的冗余分析(RDA)Fig. 4 Redundancy analysis (RDA) of relationship between soils indexes with soil enzyme activities

表2 土壤有機化合物與土壤微生物特征之間的相關(guān)性Tab. 2 Correlations analysis of soil organic compounds with soil microbial characteristic

3 討論

3.1 高濃度大氣CO2對Pb污染土壤有機化合物的影響

土壤有機化合物主要來源于植物枯枝落葉分解產(chǎn)物、根系脫落物以及植物根系分泌物等，由于試驗期間隨時清理盆栽中的雜草和植物落葉，因此本研究中刺槐根際土壤有機化合物變化主要與根系脫落物和根系分泌物等有關(guān)。高濃度大氣CO2條件下刺槐根際土壤TOC、DOC、MBC、總糖、酚酸、氨基酸和有機酸含量升高，這表明高濃度大氣CO2對根際土壤有機化合物含量增加有促進效果，主要是與高濃度大氣CO2可促進植物生長、光合作用及根系生物量有關(guān)[13]，同時隨著植物生長，更多的植物根系殘體經(jīng)微生物分解也會改變土壤有機化合物含量。Pb污染處理下根際土壤TOC、總糖、氨基酸和有機酸含量增加，而DOC、MBC和酚酸含量降低，表明根際土壤有機化合物對Pb污染呈不同的響應(yīng)特征。本研究中Pb污染可能通過影響刺槐生長及根系狀況，從而改變根系分泌特征，引起根際土壤有機化合物含量升高或降低。與單獨Pb污染相比，高濃度大氣CO2與Pb聯(lián)合作用下土壤DOC、MBC、總糖、酚酸、氨基酸和有機酸含量顯著提高，而土壤中TOC含量無明顯變化，表明高濃度大氣CO2促進了Pb污染土壤有機化合物含量增加。

3.2 高濃度大氣CO2對Pb污染土壤微生物特性的影響

土壤微生物通過參與植物枯枝落葉以及動植物殘體分解，對陸地生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)元素的化學(xué)轉(zhuǎn)化、物質(zhì)循環(huán)等活動具有重要作用。土壤中CO2濃度約為大氣CO2濃度的10～50倍，因此，升高的大氣CO2主要通過影響植物從而間接作用于土壤微生物特性。XIAO等[14]研究表明，土壤細菌和真菌數(shù)量隨大氣CO2的升高而增加，HUANG等[5]通過8 a高原草原研究發(fā)現(xiàn)，高濃度大氣CO2條件下土壤微生物量C、N以及微生物活性增加，分析表明微生物活性變化與土壤含水量差異無關(guān)，主要與根系分泌物增多導(dǎo)致的土壤C輸入增加有關(guān)。與對照CO2相比，高濃度大氣CO2下細菌、真菌、放線菌和FDA分別提高了3.29%、3.76%、7.22%和9.54%，表明高濃度大氣CO2提高了刺槐根際土壤微生物數(shù)量及活性。因此，高濃度大氣CO2通過提高土壤總糖、氨基酸和有機酸含量(圖1)，為微生物生命活動提供了更多的有機底物，從而促進了土壤微生物生長。微生物是土壤酶的主要來源，高濃度大氣CO2提高了刺槐根際土壤脲酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)化酶、β-葡萄糖苷酶活性(圖3)，這主要與高濃度大氣CO2條件下增加的土壤微生物數(shù)量和活性有關(guān)(圖2)。本研究還發(fā)現(xiàn)高濃度大氣CO2條件下L-天門冬酰胺酶活性有所降低，而XUE等[15]研究表明高濃度大氣CO2提高了白羊草根系土壤蔗糖酶及脲酶活性，但是脫氫酶活性未見顯著的變化，這表明土壤酶對高濃度大氣CO2的響應(yīng)差異可能與植物種類有很大關(guān)系。

Pb污染下放線菌和FDA下降，而細菌和真菌數(shù)量較對照組ACO2略有下降，且處理間差異不顯著，JIA等[2]研究表明，Pb污染改變了植物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，PAN等[16]研究棕壤微生物區(qū)系發(fā)現(xiàn)，Cd、Pb污染下土壤真菌數(shù)量無明顯變化，而細菌、放線菌數(shù)量變化趨勢較大，這與本研究結(jié)果有所差異，表明土壤微生物因重金屬種類差異而表現(xiàn)出不同的響應(yīng)特征。本研究發(fā)現(xiàn)Pb污染下土壤微生物數(shù)量及活性降低，這可能是由于土壤微生物通過帶電荷的細胞表面吸附重金屬離子或?qū)⑵涓患诩毎麅?nèi)部，而重金屬與細胞內(nèi)生物大分子比如酶活性中心的結(jié)合會導(dǎo)致微生物死亡[17]。Pb污染抑制微生物數(shù)量及活性，降低微生物產(chǎn)酶速率及分泌程度，從而間接引起刺槐幼苗根際土壤酶活性降低(圖3)。另外，重金屬可通過與酶分子活性部位-巰基和含咪唑的配體結(jié)合形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，從而直接造成酶分子失活以降低土壤酶活性[18]。高濃度大氣CO2和Pb污染對土壤微生物數(shù)量分別表現(xiàn)出促進和抑制效應(yīng)，ECO2+ Pb聯(lián)合作用下細菌、真菌、放線菌和FDA分別提高了1.29%、15.18%、4.65%和6.12%(圖2)。整體上除L-天門冬酰胺酶外，兩因子聯(lián)合作用提高了根際土壤酶活性，表明高濃度大氣CO2緩解了Pb污染對土壤微生物數(shù)量及活性的抑制效應(yīng)，從而提高了Pb污染土壤中酶活性。

3.3 高濃度大氣CO2與Pb污染下土壤有機化合物和微生物特性的動態(tài)關(guān)聯(lián)

微生物作為陸地生態(tài)系統(tǒng)中最重要的生命組分之一，對土壤形成、有機質(zhì)分解、土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)等過程具有重要影響，是生物地球化學(xué)循環(huán)最核心的環(huán)節(jié)。外界環(huán)境引起的土壤微生態(tài)環(huán)境變化對微生物的生長繁殖具有重要作用，本研究通過對土壤有機化合物與微生物特征進行冗余分析，發(fā)現(xiàn)高濃度大氣CO2、Pb污染會引起土壤有機化合物、微生物數(shù)量及活性、土壤酶活性等產(chǎn)生分布差異。本研究中總糖、酚酸、MBC和pH為影響土壤微生物特征的主要環(huán)境因子，夏建文等[19]發(fā)現(xiàn)土壤酶活性與土壤TN和MBC的變化趨勢基本一致，TN和MBC是土壤胞外酶活性的關(guān)鍵決定因子。土壤微生物特征與有機化合物之間存在典型相關(guān)關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)總糖、酚酸、MBC與細菌、放線菌、脲酶、轉(zhuǎn)化酶和β-葡萄糖苷酶呈正相關(guān)，與L-天門冬酰胺酶呈負相關(guān)，表明土壤有機化合物和微生物特征之間存在顯著的相關(guān)關(guān)系。植物在生長過程中有高達30%以上的光合產(chǎn)物以有機碳的形式進入到根際土壤，這些有機物質(zhì)為土壤微生物提供豐富的碳源，促進根際微生物的生長。作為土壤酶的主要來源，土壤微生物變化能夠引起酶活性的改變，微生物與土壤酶活性之間存在直接相關(guān)關(guān)系。另外，真菌、脫氫酶、FDA與土壤有機化合物之間的相關(guān)性不顯著，表明不同種類土壤微生物與土壤有機化合物之間的關(guān)系有所差異。

4 結(jié)論

通過高濃度大氣CO2對鉛污染刺槐幼苗根際土壤有機化合物和微生物特性的影響研究，得到如下主要結(jié)論：

(1)高濃度大氣CO2使刺槐根際土壤有機化合物、微生物和酶活性顯著增加，而土壤pH值變化不顯著。

(2)單獨Pb污染提高了土壤TOC、總糖、氨基酸、有機酸含量及L-天門冬酰胺酶活性，降低了DOC、MBC和酚酸含量，對微生物數(shù)量及土壤酶呈抑制效應(yīng)。

(3)高濃度大氣CO2提高了Pb污染土壤有機化合物含量和土壤微生物特性表現(xiàn)為促進效應(yīng)，總糖、酚酸、MBC和pH是土壤微生物特性的主要影響因子，并與微生物特性相關(guān)性顯著。綜上結(jié)果表明高，濃度大氣CO2通過提高土壤有機化合物含量來減緩Pb污染對刺槐幼苗根際微生物的脅迫效應(yīng)。

由于幼苗在生理或根系分泌物方面差別于成株，本研究所用材料為1年生幼苗，因此，分析結(jié)果限于表明樹木早期階段根際微環(huán)境對高濃度大氣CO2和Pb污染的響應(yīng)過程；另外，由于長期高濃度大氣CO2和Pb污染可能使植物和微生物產(chǎn)生一定的適應(yīng)性，從而影響植物根系分泌過程和微生物活動，因此有必要開展長期試驗研究，以便科學(xué)揭示植物根際過程對全球氣候變化聯(lián)合土壤重金屬污染問題的響應(yīng)和反饋機制。