宋新強, 任雨軒,代二琴，張 玉, 何歡歡, 范金克, 趙麗君, 彭 濤, 王 磊

(1.信陽師范學院 a.生命科學學院; b.醫(yī)學院,河南 信陽 464000;2. 河南中醫(yī)藥大學 第二臨床醫(yī)學院，河南 鄭州 450003)

0 引言

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種免疫相關(guān)的疾病，通常會導致持續(xù)的關(guān)節(jié)破壞、預(yù)期壽命縮短、工作能力下降、殘疾，甚至會導致死亡率增高[1]。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)是RA病理的主要細胞類型之一[2]。在RA研究過程中，F(xiàn)LS隨著形態(tài)變化而失去接觸抑制，表達高水平的生物標志物，如c-fos、Jun-B、egr-1和基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloprotease, MMP)-3，并分泌幾種炎癥細胞因子，如IL-6、IL-8、IL-1、TNF-α和MCP-1[3-7]。FLS是如何被激活來驅(qū)動類風濕性關(guān)節(jié)炎尚不清楚，表觀遺傳學可能會發(fā)揮作用[8]。

從雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)中提取的雷公藤紅素(Celastrol,CEL)在中國已廣泛用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性疾病[9-13]。雖然雷公藤紅素的臨床療效已被廣泛報道，但其作用機制尚不清楚。體外研究表明，高劑量的雷公藤紅素可以誘導細胞凋亡，并抑制FLS的生長和侵襲[14]。然而，全面篩選鑒定FLS蛋白和受雷公藤紅素影響的過程需要更深入的研究。

轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的高通量分析可以篩選被特效藥物改變的基因表達[15-16]。轉(zhuǎn)錄組分析并不包含轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯效率或轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)換率，所有這些都會影響編碼蛋白的活性[17-18]。因此，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的分析可能會更有效地識別藥物所誘導的變化。在本研究中，通過采用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析CEL處理后滑膜細胞RNA和蛋白的表達差異，探討雷公藤紅素對RA患者FLS的影響。

1 方法

1.1 細胞培養(yǎng)

類風濕性關(guān)節(jié)炎患者FLS和滑膜細胞生長培養(yǎng)基購自細胞應(yīng)用公司(Santiago, California, USA)。在37 ℃、5%CO2的條件下，在含有100 mg/L鏈霉素和100 U/mL青霉素的滑膜細胞生長介質(zhì)中培養(yǎng)FLS。在對數(shù)生長期，將FLS接種到直徑10 cm的培養(yǎng)基中(細胞濃度為1×106個 /盤)。用抗FLS標記蛋白(vimentin)的抗體(1∶50)鑒定細胞類型。用IX2-ILL100熒光顯微鏡進行分析。

1.2 RNA提取

將雷公藤紅素溶解在DMSO中制成100 mmol/L的原液，稀釋至所需濃度，使DMSO在培養(yǎng)基中的最終比例為1%(V/V)。人類FLS進行DMSO培養(yǎng)處理作為對照，使其最終比例也為1%(V/V)。將FLS接種在培養(yǎng)基中，然后加入5 μmol/L雷公藤紅素培養(yǎng) 24 h。用TRIzol(Invitrogen)從FLS中分離出總RNA。RNA樣本用RNase-free DNase set消化去除基因組DNA，并用RNeasy試劑盒(Qiagen)進一步純化。使用RNA6000納米芯片和安捷倫2100生物分析儀評估RNA樣本的完整性。將完整性大于7的RNA樣本進一步用于基因序列和實時PCR(見下文)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組學

使用SOAPnuke軟件(http://www.seq500.com/uploadfile/SOAPnuke.zip)對RNA-Seq原始讀數(shù)進行質(zhì)量控制和清理，以刪除低質(zhì)量、受污染的和帶有接頭的讀長。最終得到的讀長與人類基因組數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/)一致，并使用HISAT2與人類基因匹配。之后計算每個基因?qū)?yīng)的讀取數(shù)，使用“每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段”(FPKM)方法來實現(xiàn)RSEM算法(https://deweylab.github.io/RSEM/)中的數(shù)據(jù)規(guī)范化以及在每個樣本中篩選低表達基因(FPKM<1)。NOIseq用于計算每個基因的log2FC和概率值，并采用以下標準：log2FC>1或<1，概率>0.8。使用Mapman軟件進行PageMan分析，我們認為如果P<0.01，則富集項顯著。

1.4 蛋白質(zhì)組學

1.4.1 非標記定量蛋白質(zhì)組學(Label-free)樣品制備

將細胞沉淀物懸于200 μL裂解緩沖液(質(zhì)量濃度4% SDS, 100 mmol/L DTT, 150 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)中，置于冰上。用勻漿器(Fastprep-24，MP Biomedical，California，美國)攪動破碎細胞，并煮沸5 min。進一步超聲處理樣品，再煮沸5 min。14 000 r/min離心15 min以去除未溶解的細胞碎片。收集上清液并用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Bio-Rad，美國)定量。

1.4.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)法

將每個肽樣品在Empore SPE C18膜片上脫鹽，然后通過真空離心濃縮，并在40 μL 0.1%(V/V)三氟乙酸中復(fù)原。將肽(5 μg)上樣到緩沖液A(2%乙腈和0.1%甲酸)中的反相C18柱(Thermo Scientific Easy Column)上，120 min內(nèi)用IntelliFlow技術(shù)在Easy nanoLC系統(tǒng)(Proxeon Biosystems，現(xiàn)更名為Thermo Fisher Scientific)上以250 nL/min的流速用緩沖液B(80%乙腈和0.1%甲酸)的線性梯度進行分離。液相色譜系統(tǒng)連接到Q萃取電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)。對每個樣品進行三次質(zhì)譜實驗。

1.4.3 序列數(shù)據(jù)庫檢索與分析

使用可免費獲得的MaxQuant軟件1.3.0.5(www.maxquant.live)對數(shù)據(jù)庫uniprot_human_152544_20160420.fasta(總條目152 544，下載于2019年12月20日)進行了質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析。根據(jù)Max-Quant軟件中的默認算法執(zhí)行共片段化。根據(jù)歸一化光譜蛋白(LFQ)強度計算蛋白豐度。蛋白質(zhì)組學結(jié)果已保存在PRIDE信息庫的ProteomeXchange Consortium中，數(shù)據(jù)集標識符為PXD006350。

1.5 Cel與預(yù)測靶蛋白對接模擬

從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(http://www.pdb.org/pdb/home/home.do)中下載預(yù)測靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，使用YASARA對選定的目標蛋白與Cel進行對接模擬。將氫原子添加到蛋白質(zhì)受體上后，使用CHARMM力場進行對接模擬。把側(cè)鏈至少部分落在以配體Cel為中心，直徑為1.2 nm的球體內(nèi)的殘基定義為Cel的結(jié)合位點。其他參數(shù)使用默認值，并對每個配體執(zhí)行遺傳算法。

1.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢查目的基因mRNA表達

按照RNAiso Plus試劑說明提取各組FLS RNA，采用NanoDrop2000 紫外分光光度計檢測RNA 的純度及濃度。按照TaKaRa中PrimeScript RT Master MiX操作說明進行cDNA的合成，根據(jù)SYBR Green Master(羅氏) 試劑盒說明書檢測COMP、MMP1、LAMC1、ANXA6、THBS1和SERPINE2 mRNA水平，以β-actin作為內(nèi)參。擴增體系包括：上游引物(10 μmol/L)0.5 μL、下游引物(10 μmol/L)0.5 μL、cDNA 2.5 μL、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 5 μL、RNase Free dH2O 1.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火10 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)45 次，實驗重復(fù)3 次。引物由上海生工生物有限公司合成，使用的具體引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列Fig. 1 qRT-PCR primer sequences

1.7 Western blot

CEL處理滑膜成纖維細胞(FLS)進行總蛋白提取，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品(20 mg)，在100 ℃條件下變性5 min。然后使用SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在4 ℃條件下加入相應(yīng)一抗并孵育過夜，清洗，然后在4 ℃下加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。Syngene成像系統(tǒng)軟件統(tǒng)計灰度值。

2 結(jié)果

2.1 FLS活性鑒定

RA患者滑膜成纖維細胞(FLS)培養(yǎng)，加入抗DAPI抗體后，看到細胞核顯示藍色熒光(圖1)。波形蛋白是成纖維細胞特有的骨架蛋白，加入抗波形蛋白抗體后，細胞骨架部分發(fā)出紅色熒光(圖1-A3)，證明此細胞為FLS。DMSO處理組作為對照組(Ctrl組)，5 μmol/L CEL處理組為實驗組(Cel組)，結(jié)果如圖1-B,發(fā)現(xiàn)Ctrl組細胞呈多呈梭形，細胞核位于細胞中央核仁清晰；Cel組存活細胞數(shù)量明顯減少，形狀不規(guī)則，體積變小，核質(zhì)濃縮。

注： (A)免疫熒光染色法鑒定FLS: (1)不加抗體，(2) 加抗DAPI抗體，(3) 加抗波形蛋白抗體，(4) 加抗DAPI抗體和抗波形蛋白抗體. 放大率：200×;(B)用DMSO(Ctrl)或5 μmol/L CEL 處理24 h的FLS。放大率: 10×

2.2 Cel處理后的轉(zhuǎn)錄組分析

轉(zhuǎn)錄組測序鑒定得到7 803個差異表達基因，4 479個上調(diào)，3 324個下調(diào)。通過GO功能分析，富集到17 354個條目，按照P<0.05 的閾值過濾，顯著富集到1 056個子條目，富集到生物過程(biological processes，BP)的條目是107條，主要集中在氧化應(yīng)激反應(yīng)、對氧氣壓力的反應(yīng)等，特別是與氧氣壓力和應(yīng)激相關(guān)的基因HIF-1α 和 HIF-3α顯著表達；富集到分子功能(Molecular function，MF)的條目有871條，主要參與的MF為細胞外基質(zhì)組成、伴侶蛋白的結(jié)合等；富集到細胞組分(Cell component，CC)的條目是78條，主要定位于細胞器、細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)(見圖2)。KEGG富集得到信號通路335條，按照P<0.05 的閾值過濾，其中顯著富集通路18條，包括MAPK信號通路、Rap1信號通路、ECM受體間互作P53信號通路PI3K-Akt信號通路等。

注：(A)差異基因表達火山圖；(B)差異基因GO功能富集分析;(C)差異基因KEGG 通路富集分析

2.3 Cel處理后的蛋白質(zhì)組分析

通過蛋白質(zhì)組分析獲得3 372個蛋白質(zhì)， 按照P<0.05 的閾值和差異倍數(shù)(Fold Change, FC)> 2進行過濾，差異表達蛋白質(zhì)294個，106個蛋白質(zhì)上調(diào)表達，188個蛋白質(zhì)下調(diào)表達。對差異蛋白進行GO富集分析，顯示蛋白共參與了8 080條生物過程或途徑，其中574條的P值小于0.05，467個與BP相關(guān)、40個與CC相關(guān)、67個與MF相關(guān)。如圖3所示，靶點主要涉及細胞外結(jié)構(gòu)組織、細胞外基質(zhì)的組織、對壓力的反應(yīng)等生物過程；靶點主要集中于細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、糖胺聚糖結(jié)合、生長因子活性等分子功能；靶點主要涉及細胞外基質(zhì)和富含膠原細胞外基質(zhì)等細胞組分。KEGG分析共獲得18條通路(P<0.05)，如圖3所示。主要通路有ECM受體相互作用、細胞因子-細胞因子受體相互作用、P53信號通路等。

注：(A)差異蛋白聚類分析；(B)差異蛋白GO功能富集分析；(C)差異蛋白KEGG 通路富集分析圖3 Cel處理后的蛋白質(zhì)組分析Fig. 3 Proteomic analysis after treatment with Cel

2.4 轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析

總體比較轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的表達量以及比較差異表達的基因和蛋白水平，顯示弱相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.206 7和r=0.250 7。 如圖4所示，加入CEL后，在轉(zhuǎn)錄組水平和蛋白質(zhì)組水平，有36個基因上調(diào)表達和15個基因下調(diào)表達。 27個基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)表達但翻譯水平上調(diào)表達；2個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)表達但翻譯水平下調(diào)表達。

2.5 候選基因和蛋白驗證

轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學分析表明，Cel對FLS細胞外基質(zhì)中涉及的幾種蛋白質(zhì)起作用。因此，通過分子對接模擬了Cel與幾種晶體結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)的潛在相互作用模式(圖5)。模擬結(jié)果顯示，藥物與靶蛋白作用的主要形式有氫鍵和疏水相互作用。例如，Cel與MMP1的ASP-279、LYS-298、LYS-276等氨基酸殘基形成氫鍵；Cel除了與ANXA6的LYS-224形成氫鍵，還與GLU-643之間具有疏水作用。

挑選6個基因進行qRT-PCR驗證，LMAC1和MMP1表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相反，COMP、ANXA6、THBS1、SERPINE5等4個基因表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。采用Western blot方法驗證蛋白質(zhì)組結(jié)果，Annexin A6表達量與Ctrl組相比顯著上調(diào)，與蛋白質(zhì)組學結(jié)果一致。

注：(A)所有基因和蛋白的關(guān)聯(lián)分析；(B)差異表達基因和蛋白的關(guān)聯(lián)分析；(C)差異表達基因和蛋白的聚類分析

注：(A)Cel與潛在的作用靶點蛋白分子模擬對接；(B)熒光定量PCR驗證；(C)Western blot驗證

圖5A顯示Cel與FLS細胞外基質(zhì)潛在6種靶蛋白的分子對接模式圖。模型展示了0.4 nm以內(nèi)的相互作用力及其鍵長、活性位點的關(guān)鍵氨基酸殘基，紅色虛線表示氫鍵。6種靶蛋白分別是軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP，PDB ID: 3FBY)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1，PDB ID: 1SU3)、膜聯(lián)蛋白A6(ANXA6，PDB ID: 1M9I)、血小板反應(yīng)蛋白1(THBSP 1，PDB ID: 2OUH)、絲氨酸蛋白酶抑制劑E2(SERPINE2，PDB ID: 4DY0)、層粘連蛋白亞基γ-1(LAMC1，PDB ID: 5XAU)。

3 討論

類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者的滑液和血清中炎癥標志物(例如CRP、IL-6和TNF-α)高表達，并且這些標志物在血液中的水平與疾病嚴重程度相關(guān)。在RA中，炎癥的原發(fā)部位是滑膜組織，細胞因子可能從該滑膜組織釋放到血液循環(huán)中。這些細胞因子幾乎參與了類風濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)發(fā)炎和破壞的所有方面[19-20]。

許多研究已經(jīng)部分揭示了雷公藤紅素抗炎作用的機制。 LI等[21]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素抑制缺氧誘導的FLS遷移，抑制缺氧誘導的CXCR4在RA-FLS的mRNA和蛋白水平上的表達。XU等[22]結(jié)果顯示雷公藤紅素通過誘導DNA損傷、細胞周期阻滯和凋亡來抑制RA-FLS增殖。其他研究者發(fā)現(xiàn)[14]，在雷公藤紅素處理后，幾種趨化因子基因的表達發(fā)生了顯著變化。雷公藤紅素對FLS影響的轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學研究表明，該藥物通過影響氧化應(yīng)激反應(yīng)、氧氣壓力反應(yīng)小分子代謝調(diào)節(jié)等發(fā)揮抗炎作用，這與之前的研究結(jié)果一致[21]。本實驗結(jié)果還表明，雷公藤紅素可直接干擾細胞外基質(zhì)，抑制FLS增殖和存活。

在FLS中表達的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組之間只有弱的相關(guān)性。這與肺腺癌和胚胎干細胞中的轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學研究一致[23-24]。這也部分反映了影響蛋白質(zhì)組的翻譯調(diào)控和翻譯后過程[25]。

在關(guān)節(jié)炎部位，缺氧是微環(huán)境的一個顯著特征，這是通過炎癥浸潤的免疫細胞消耗氧氣增加，以及由于血管功能障礙而破壞血液供應(yīng)而產(chǎn)生的[26]。缺氧觸發(fā)了幾種導致RA病理的信號通路，缺氧激活的主要信號通路涉及缺氧誘導因子(HIFs)，其在RA的滑膜中高表達。 HIFs 誘導炎癥、血管生成、細胞遷移和軟骨破壞，并抑制滑膜細胞和炎性細胞的凋亡。HIF的表達與炎癥細胞因子一樣，可以通過氧依賴和非氧依賴兩個途徑觸發(fā)，使疾病加重[27-30]。實際上，HIF-1α陽性細胞的數(shù)量與炎癥內(nèi)皮細胞浸潤的程度、滑膜炎的嚴重程度直接相關(guān)[31-32]?；钚匝?ROS)的過量產(chǎn)生會導致蛋白多糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素和膠原蛋白的分解[33]，從而破壞關(guān)節(jié)。

4 結(jié)論

雷公藤紅素可以降低HIF的表達，殺死FLS，減輕RA中的炎癥反應(yīng)，雷公藤紅素可能靶向細胞外基質(zhì)中的幾種蛋白質(zhì)。通過組學的聯(lián)合分析，提示雷公藤紅素可通過影響類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)展的多條信號通路來減輕炎癥發(fā)生，為理解RA的發(fā)病機制和CEL治療RA提供理論支持。