李 捷，劉 浩，韓建勛，侯衛(wèi)靜，孫兆增，富 玉，楊柏崇，施祖灝

（1.譜尼測試集團(tuán)股份有限公司，北京 100095；2.譜尼測試集團(tuán)北京檢驗(yàn)認(rèn)證科學(xué)研究院有限公司，北京 100095；3.譜尼測試集團(tuán)江蘇有限公司，江蘇蘇州 215002）

2019年12 月以來，由新型冠狀病毒（SARSCoV-2）導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎（簡稱新冠肺炎）疫情在我國武漢暴發(fā)，并迅速擴(kuò)散到全國乃至全球多個國家。新冠肺炎傳染性強(qiáng)、傳播速度快，尋求快速、高效的檢測方法，仍是全球關(guān)注的重點(diǎn)[1-4]。

量子點(diǎn)是一種新型的納米熒光材料，經(jīng)過特定的表面處理后具有良好的生物相容性和獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)[5]。由于其優(yōu)良的光譜特征和光化學(xué)穩(wěn)定性，如發(fā)射光譜窄、激發(fā)光譜寬、發(fā)光效率高、發(fā)光顏色可調(diào)等特征，適用于熒光物質(zhì)的標(biāo)記。目前，在細(xì)胞示蹤、生物分子檢測方面、食品檢測等方面具有重要的應(yīng)用價值[6]。

針對病毒，目前主要方法為檢測病毒本身（病毒RNA 或抗原）或檢測人類對感染的免疫反應(yīng)（抗體或其他生物標(biāo)記物）[7]?？乖瓩z測實(shí)現(xiàn)了病毒的快速、廉價、及時檢出，在可用性和易用性上更優(yōu)，適用于實(shí)驗(yàn)室外的放大試驗(yàn)，在流感病毒、合胞病毒、副流感病毒等呼吸道病毒的檢測中都有應(yīng)用[8-9]。因此，本研究采用量子點(diǎn)免疫熒光技術(shù)研制SARSCoV-2的抗原檢測試劑盒，通過分析試劑盒的精密度、準(zhǔn)確度、最低檢出限等性能，為SARS-CoV-2的快速準(zhǔn)確檢測提供新的方法手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京索萊寶科技有限公司；重組質(zhì)粒PVAX1-2019-nCoV-S1 購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；S1蛋白的兩株單克隆抗體來源于南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司；羊抗鼠IgG 購自洛陽佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心；S1抗原1#、S1抗原2#分別購自北京兩家生物公司；樣本稀釋液由磷酸緩沖液、Triton X-100和牛血清清蛋白配制而成，所用試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水溶性羧基CdSe/ZnS 量子點(diǎn)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC]、2-嗎啉乙磺酸（MES）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；封閉液中的三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽[Tris(hydroxymethyl)aminomethane acetate salt]購自北京索萊寶科技有限公司；試劑樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙、PVC 底板購自北京昊佳生物工程技術(shù)有限公司；熒光定量分析儀購自南京微測生物科技有限公司；凝膠電泳系統(tǒng)購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 SARS-CoV-2S1蛋白的表達(dá)與純化：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，陽性表達(dá)菌體接種于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)液中進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為37℃，時間為3h，離心收集菌體[10]。超聲后收集上清，利用層析柱進(jìn)行純化，得到純化的S1蛋白；取未純化的S1蛋白和純化后的S1蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，觀察蛋白的純化結(jié)果。

1.2.2 SARS-CoV-2 抗原檢測試劑盒的制備及檢測：①包被抗體：用磷酸緩沖液稀釋S1蛋白的單克隆抗體和抗兔IgG 抗體至1.0 mg/ml，在硝酸纖維素膜上對應(yīng)的檢測線和質(zhì)控線進(jìn)行包被，完成后37℃烘干3h。②標(biāo)記抗體：將微球溶于2-嗎啉乙磺酸，加入適量的N-羥基硫代琥珀酰亞胺（sulfo-NHS）和碳化二亞胺（EDC）進(jìn)行活化，離心去除上清后，使用硼酸緩沖液溶解微球?；罨蟮奈⑶蚣尤隨1蛋白的單克隆抗體進(jìn)行孵化，孵化完成后封閉、離心，沉淀使用Tris 緩沖液復(fù)溶，4℃保存?zhèn)溆?。③制備微球結(jié)合墊：將標(biāo)記好的微球按一定比例稀釋后，噴到結(jié)合墊上，37℃烘干3h，即得到含有微球的結(jié)合墊。④制備檢測卡：在底板上依次粘貼上樣品墊、結(jié)合墊、包被膜及吸水紙，組裝成檢測卡，4℃～30℃干燥保存[11]。

試紙條組裝完成后，檢測過程中需要將待檢樣本稀釋10 倍后加入加樣孔，反應(yīng)15 min 后于熒光定量分析儀上檢測質(zhì)控線（C）和檢測線（T）的熒光值，并記錄其T/C 值。

1.2.3 性能驗(yàn)證

1.2.3.1 試劑盒校準(zhǔn)曲線的建立：每批次的檢測試劑盒均需單獨(dú)建立校準(zhǔn)曲線。將S1蛋白配制成0，50，500，2 500，5 000，30 000 pg/ml 6 個濃度，分別進(jìn)行兩次平行測定，測得本驗(yàn)證所用批次校準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的T/C 值的平均值和濃度值建立校準(zhǔn)曲線，并通過四參數(shù)方法進(jìn)行擬合。

1.2.3.2 線性范圍：根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）EP6-A 做線性范圍評價，使用S1蛋白配制濃度為25 000 pg/ml的高濃度樣本(H)，以樣本稀釋液（0 pg/ml）作為低濃度樣本（L），按照H，1H+3L，1H+15L，1H+63L，1H+255L，1H+1 023L比例混合，得到25 000，6 250，1 563，391，98和24 pg/ml 6 個濃度點(diǎn)。分別對6 個濃度點(diǎn)進(jìn)行三次重復(fù)測定，通過校準(zhǔn)曲線計(jì)算得到平均值，將平均值和各點(diǎn)的理論值進(jìn)行線性擬合，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r，應(yīng)不小于0.99。

1.2.3.3 準(zhǔn)確度：對S1蛋白的抗原配制150和2 000 pg/ml 兩個高低濃度的樣本進(jìn)行檢測，每個樣品重復(fù)測定3 次，通過校準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度值，并計(jì)算測試結(jié)果與理論值的相對偏差，相對偏差應(yīng)不超過±15%。相對偏差=(測定值-理論值)/理論值×100%。

1.2.3.4 最低檢出限：根據(jù)CLSI EP17-A2 文件，對最低檢出限（靈敏度）的評價，使用樣本稀釋液作為樣本進(jìn)行檢測，重復(fù)測定20 次，測出T/C 值后求其平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），根據(jù)校準(zhǔn)曲線計(jì)算+2s對應(yīng)的濃度值，即為最低檢出限。

1.2.3.5 精密度：配制1 500和150 pg/ml 高低兩個濃度水平樣本，每天做2 個批次的測試，每個批次重復(fù)測定樣本8 次，共測試5 天。評估結(jié)束時每個濃度的樣本有80 個測試結(jié)果。根據(jù)每個批次的8 次測試結(jié)果計(jì)算批內(nèi)精密度(Sr)。從所有80 個結(jié)果計(jì)算批間精密度(Srr)。批內(nèi)精密度應(yīng)不大于15%，批間精密度應(yīng)不大于20%。精密度用變異系數(shù)（CV）計(jì)算，CV=(s/)×100%。

1.2.3.6 對不同抗原的包容性驗(yàn)證：分別使用不同廠家的S1抗原（1#和2#），驗(yàn)證試劑盒對抗原反應(yīng)的包容性。不同抗原檢測結(jié)果與試劑盒使用抗原的測試結(jié)果進(jìn)行線性擬合，相關(guān)系數(shù)r應(yīng)不小于0.95。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果使用ELISA Calc數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行擬合。

2 結(jié)果

2.1 重組S1蛋白表達(dá)鑒定 見圖1。經(jīng)過SDSPAGE分析，重組S1蛋白的分子量約為78 kDa。

圖1 S1蛋白的SDS-PAGE 電泳結(jié)果

2.2 S1蛋白檢測試劑盒的校準(zhǔn)曲線建立 見圖2。將得到的T/C 值平均值作為Y軸，對應(yīng)的濃度值作為X軸，使用四參數(shù)方法進(jìn)行曲線擬合建立校準(zhǔn)曲線，曲線方程為Y=(37.296+0.014)/[1+(X/55 211.003)-0.902]-0.014，r2為0.9998。

圖2 S1蛋白檢測試劑盒校準(zhǔn)曲線

2.3 線性范圍分析結(jié)果 見表1。測定預(yù)期線性范圍內(nèi)的6 個濃度值（25 000，6 250，1 563，391，98，24 pg/ml）三次，對理論值和測定值進(jìn)行線性擬合，得到線性方程：Y=0.959 8X+16.613，r為0.999，因此試劑盒的線性范圍為24～25 000 pg/ml。

表1 線性范圍分析

2.4 準(zhǔn)確度分析 見表2。采用2.2 中校準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度測定值，以及與理論值的相對偏差絕對值。結(jié)果顯示，所有相對偏差均＜5%，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的15%，說明試劑盒的準(zhǔn)確度較高。

表2 準(zhǔn)確度分析

2.5 最低檢出限 結(jié)果使用樣本稀釋液作為樣本進(jìn)行檢測，重復(fù)測定20 次，計(jì)算得到試劑盒的最低檢出限為16.96 pg/ml。

2.6 精密度分析 見表3。高、低濃度樣本在10個批次中批內(nèi)精密度最大為9.65%，批間精密度為9.24%，均小于15%，說明試劑盒的精密度較高。

表3 精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.7 對不同抗原的包容性驗(yàn)證 為驗(yàn)證試劑盒的檢測結(jié)果是否受抗原表達(dá)系統(tǒng)的影響，使用不同來源的S1抗原(1#)、S1抗原(2#)和提純的S1蛋白進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證試劑盒對抗原的包容性，其中S1抗原(1#)和S1蛋白為原核系統(tǒng)表達(dá)獲得，S1抗原(2#)為真核系統(tǒng)表達(dá)獲得。對三種抗原分別配制0，50，500和5 000 pg/ml 四個濃度進(jìn)行檢測，通過熒光定量分析儀獲得T/C 值，計(jì)算S1抗原(1#)和S1抗原(2#)與提純的S1蛋白T/C 值的相關(guān)性，結(jié)果見表4。

表4 不同來源抗原的包容性

對于不同來源的抗原，結(jié)果顯示S1抗原(1#)和S1抗原(2#)與提純的S1蛋白的相關(guān)性均在0.99 以上，說明試劑盒對不同來源的抗原具有包容性。

3 討論

目前SARS-CoV-2的檢測方法主要為核酸檢測和特異性抗體IgM和IgG的檢測[12]。根據(jù)中國發(fā)布的COVID-19 診療方案和WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)，只要符合臨床表現(xiàn)，即可認(rèn)定為疑似病例，而確診則需要核酸檢測或特異性抗體IgG和IgM 檢測。核酸檢測能夠檢測到處于窗口期的患者，及早發(fā)現(xiàn)感染者，是SARS-CoV-2 檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是對檢測設(shè)備或平臺要求較高，高靈敏度的RT-PCR 儀價格昂貴，對實(shí)驗(yàn)室的潔凈度或操作人員要求也較高，檢測耗時較長，且咽拭子采樣有采集不到的風(fēng)險，易出現(xiàn)假陰性；而相對于核酸檢測，抗體的血清學(xué)檢測的標(biāo)本更易獲得且有質(zhì)量保證，操作簡單快捷，更易于實(shí)驗(yàn)室開展篩查工作，但是檢測窗口期長，是核酸檢測的補(bǔ)充。而抗原檢測是直接檢測樣本中的病毒蛋白，相對抗體檢測窗口期短、檢測方便、快速和低價。國內(nèi)SARS-CoV-2的抗原檢測主要采用膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行定性檢測，結(jié)果靠肉眼判斷，主觀性較大。

本研究通過量子點(diǎn)熒光免疫技術(shù)制備了檢測SARS-CoV-2的試劑盒，可對病毒抗原進(jìn)行定量檢測。結(jié)果顯示，本試劑盒具有較高的靈敏度，最低檢出限可達(dá)16.96 pg/ml；高、低濃度樣本的檢測精密度良好，批內(nèi)精密度和批間精密度均小于15%；準(zhǔn)確度較高，相對偏差均小于5%，符合膠體金免疫層析檢測試劑的國家標(biāo)準(zhǔn)要求（＜ 20%）；在24～25 000 pg/ml 之間有良好的線性；對抗原的包容性良好，能夠在15min 內(nèi)完成對SARS-CoV-2的檢測。因此，本方法適用于醫(yī)院等醫(yī)療機(jī)構(gòu)對SARSCoV-2 進(jìn)行快速檢測，可作為疫情防控的重要輔助檢測手段。本試劑盒用于對SARS-CoV-2 抗原的定量檢測，能夠更加準(zhǔn)確地了解病毒在體內(nèi)的載量，對評價抗病毒治療的療效和判斷預(yù)后具有重要的意義。但是鑒于臨床陽性樣本來源困難，本檢測試劑盒仍存在一定的不足，無法驗(yàn)證試劑盒的診斷靈敏度，仍需進(jìn)一步對試劑盒進(jìn)行臨床應(yīng)用的驗(yàn)證。