李 娜,黃友軍，李志超，魏旺麗，張 林（郴州市第一人民醫(yī)院檢驗科，湖南郴州 423000）

慢性咳嗽變異性哮喘具體發(fā)病機制尚不明確，但認為機制及病理特征與哮喘較為相似，主要為氣道慢性炎癥、氣道高反應性及不可逆氣道重塑3 個基本病理及生理過程[1]。相關研究指出哮喘氣道重塑的發(fā)生是多種細胞及因子共同作用的結果[2-3]。信號轉導子和轉錄激活子-1（signal transducer and activator of transcription-1，STAT1）作為一種重要的信號傳導蛋白，可促進細胞黏附因子表達，導致淋巴細胞聚集，加重炎癥反應[4-5]。干擾素調節(jié)因子-1（recombinant interferon regulatory factor 1，IRF1）作為轉錄因子的重要一員，在機體細胞免疫、細胞因子生產及分化過程中發(fā)揮重要角色，而細胞免疫在哮喘中扮演著重要角色[6-7]。上述機制均提示STAT1和IRF1 可能參與慢性咳嗽變異性哮喘的急性發(fā)作。本研究擬采用蛋白質免疫印跡（Western biot，WB）法檢測STAT1和IRF1水平，分析其與慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年8月～2020年3月郴州市第一人民醫(yī)院收治的慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作患者52 例納入觀察組，其中男性21 例，女性31 例；年齡18～65 歲，平均年齡34.25±10.24歲；慢性咳嗽變異性哮喘病程3～25 個月，平均病程14.59±7.58 個月。另采集同期慢性咳嗽變異性哮喘非急性發(fā)作患者52 例納入對照組。其中男性25 例，女性27 例；年齡18～64 歲，平均年齡34.19±10.21歲；慢性咳嗽變異性哮喘病程3～23 個月，平均病程14.45±7.52 個月。兩組患者性別、年齡、病程比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。入組標準：納入條件：①均符合《咳嗽的診斷與治療指南（2015）》[8]中變異性哮喘相關診斷標準；②急性發(fā)作組急性發(fā)作咳嗽2 個月以上，多呈急性發(fā)作；③病歷資料完整。排除條件：①并發(fā)急慢性咽炎、外感發(fā)熱及肺部感染的患者；②并發(fā)慢性阻塞性肺疾病、肺結核及肺癌等其他肺系疾病的患者；③伴有上氣道咳嗽綜合征、嗜酸性粒細胞增多癥及胃食管反流誘發(fā)的慢性咳嗽的患者；④并發(fā)嚴重心、肝、腎等重要臟器病變或相關疾病患者；⑤入院前4 周內應用過激素及免疫抑制劑等藥物的患者；⑥并發(fā)血液系統(tǒng)疾病的患者。

1.2 儀器與試劑 STAT1，IRF1 單克隆抗體（美國Santan Cruz 公司）；Tanon 4600 上海天能全自動化學發(fā)光圖像分析儀系統(tǒng)（蛋白表達水平實施半定量分析）。

1.3 方法

1.3.1 血清標本采集：抽取患者入院次日清晨空腹靜脈血5ml，置入乙二胺四乙酸抗凝管內，采用Ficoll-Hypaque 密度梯度離心法提取外周血單個核細胞。將分離單個核細胞加入200μl 蛋白裂解液后，置于-70℃冰箱中保存待用。

1.3.2 觀察指標（STAT1和IRF1蛋白檢測 ）：采用蛋白質免疫印跡（Western biot，WB）法檢測STAT1和IRF1蛋白表達（采用STAT1和IRF1 單克隆抗體），檢測過程中嚴格按照試劑盒說明要求進行。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計分析軟件，全部計量資料均經正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；相關性分析采用雙變量Pearson 檢驗，危險因素分析采用Logistic 回歸分析；繪制受試者工作特征曲線（ROC）評估STAT1和IRF1表達在慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作預測中的價值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 STAT1和IRF1蛋白相對表達比較 觀察組STAT1（1.28±0.37），IRF1（1.17±0.35）蛋白相對表達高于對照組（1.05±0.27，0.81±0.25），差異均有統(tǒng)計學意義（t=3.621，6.036，均P＜0.001）。

2.2 STAT1與IRF1蛋白表達的相關性分析 見圖1。經雙變量Pearson 直線相關檢驗，慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作患者STAT1與IRF1蛋白表達呈正相關（r=0.322，P＜0.001）。

圖1 STAT1與IRF1蛋白表達的相關性散點圖

2.3 STAT1，IRF1蛋白表達對慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作的影響分析 見表1。將STAT1，IRF1蛋白分別作為協(xié)變量，慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作作為因變量（0=非急性發(fā)作，1=急性發(fā)作），經Logistic 回歸分析結果顯示，STAT1和IRF1蛋白過表達可能是誘發(fā)慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作的影響因素（OR ＞1，P＜0.001）。

表1 STAT1，IRF1蛋白對慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作的影響分析

2.4 STAT1和IRF1表達在慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作預測中的價值分析 見表2。將慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作為狀態(tài)變量（0=非急性發(fā)作，1=急性發(fā)作），將STAT1和IRF1 作為檢驗變量，繪制ROC 曲線（見圖2），結果顯示，STAT1和IRF1蛋白表達及兩指標聯合評估慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作的AUC 均＞0.85,具有一定預測價值，其中聯合檢測預測價值最高，當達到最佳閾值時，可獲得最佳預測價值。

表2 STAT1，IRF1表達在慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作預測中的價值分析

圖2 STAT1，IRF1表達在慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作預測中的價值ROC 曲線圖

3 討論

目前臨床普遍認為慢性咳嗽變異性哮喘的急性發(fā)作的本質是氣道慢性變應性炎癥，是由多種細胞因子、炎癥細胞及炎癥介質參與的炎性過程，如嗜酸性粒細胞、肥大細胞及淋巴細胞等[9]。隨著現在分子生物學及免疫學的不斷發(fā)展，越來越多的研究指出，免疫功能失衡在哮喘的發(fā)病中起到重要作用。因此在慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作過程中，免疫與炎癥反應均扮演重要角色[10]?？赡芘c氣道長期處于炎癥狀態(tài)、氣道高反應性明顯加重，在一定程度上加重呼吸道癥狀，而機體免疫調節(jié)失衡，促使免疫細胞釋放大量促炎因子，加重氣道炎癥反應，促進慢性咳嗽變異性哮喘患者病情進展，導致急性發(fā)作[11]。STAT1 是信號轉導子和轉錄激活子蛋白家族中的一員，廣泛存在于組織及細胞中，在炎癥性疾病及免疫性疾病中均發(fā)揮重要作用[12]。IRF1 是IRF 家族中的一員，屬于核轉錄因子，在機體細胞免疫及分化的生理及病理過程中扮演重要角色[13]。推測STAT1及IRF1 可能參與慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作過程的炎癥反應及免疫調節(jié)過程。

STAT1 是鏈接多種細胞膜受體與選擇性效應器之間信號傳導的主要蛋白質，細胞因子可通過JAK/STAT 途徑激活STAT 活性，繼而誘導目的基因的表達，而STAT 可被白細胞家族、γ-干擾素、α-干擾素等細胞因子激活[14]。而STAT1的異常激活會促進細胞黏附異常表達，繼而促進機體內淋巴細胞的聚集，加重炎癥反應[15]。此外，STAT1 還可激活一氧化氮，一氧化氮主要在一氧化氮合成酶催化作用下在L-瓜氨酸及L-精氨酸過程中產生，誘導型一氧化氮合成酶由巨噬細胞、內皮細胞及平滑肌細胞產生大量一氧化氮，繼而誘發(fā)一系列病理性損傷[12]。本研究結果顯示，觀察組STAT1蛋白表達高于對照組。提示慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作過程中STAT1蛋白水平升高，可能參與慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作。分析其原因為：支氣管上皮細胞是趨化因子及細胞因子的重要來源，其能夠合成和分泌諸多細胞及生產因子。文獻報道[16]，哮喘患者氣道上皮細胞存在STAT1 異?；罨?，活化時，可介導誘導型一氧化氮合成酶基因于上皮細胞中表達，則相應的一氧化氮水平隨之增加，損傷氣道上皮細胞，參與上皮細胞炎癥反應，增加平滑肌痙攣，誘發(fā)變異性咳嗽哮喘急性發(fā)作風險。

IRF1 是IR 諸多因子中的一種，屬于核轉錄因子，多存在于細胞核內，可經干擾素信號通路參與多種基因表達過程。IRF1 是T 輔助細胞1 型免疫反應的重要作用因子，而T 輔助細胞是T 細胞的一個重要亞群，可分泌多種細胞因子，參與機體的免疫應答，而Th1 細胞主要分泌白細胞介素-2，γ-干擾素及腫瘤壞死因子，因此當機體內IRF1 呈高表達，則促進一系列炎癥因子的釋放，參與機體免疫應答及炎癥反應[17-18]。此外γ-干擾素的釋放，可激活STAT1 信號通路，繼而增加炎癥反應，加重氣道炎癥損傷及高反應性，促進病情進展，增加急性發(fā)作風險[19]。本研究結果顯示，觀察組IRF1蛋白表達高于對照組。提示慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作過程中IRF1蛋白水平升高，可能參與慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作。

本研究結合STAT1和IRF1蛋白表達與慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作的關系，進一步分析兩者之間關系，結果顯示，STAT1與IRF1 之間呈正相關，推測STAT1 之間存在協(xié)同作用，共同參與并推動了慢性咳嗽變異性哮喘的急性發(fā)作。但目前臨床尚無較多詢證理論支持，兩者之間關系仍需進一步增加大量研究樣本加以證實。此外，本研究作回歸分析檢驗各指標與急性發(fā)作的關系，結果顯示STAT1和IRF1蛋白過表達是慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作的影響因素，說明STAT1和IRF1 參與慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作。且進一步經ROC 曲線檢驗結果顯示，STAT1和IRF1蛋白高表達在急性發(fā)作預測中具有一定價值。但本研究尚存在不足，如樣本量較少，且未對患者日常藥物治療情況進行統(tǒng)計分析，在一定程度上影響研究的真實性及可靠性，尚需進一步增加研究樣本量，做進一步研究分析。

綜上所述,慢性咳嗽變異性哮喘急性發(fā)作患者STAT1和IRF1 普遍呈高表達，這種指標水平的過表達可能參與了慢性咳嗽變異性哮喘的急性發(fā)作，臨床可考慮通過檢測慢性咳嗽變異性哮喘患者STAT1和IRF1蛋白表達水平，以預測患者急性發(fā)作風險，為早期防治提供科學依據。