蔡芝玲，莫梓童，鄭詩倩，謝勝軍，藍(lán)詩華，沈志濱, 2, 3*

黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素抑制表皮葡萄球菌及其生物被膜的形成研究

蔡芝玲1，莫梓童1，鄭詩倩1，謝勝軍1，藍(lán)詩華1，沈志濱1, 2, 3*

1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006 3. 廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006

探討黃綿馬酸BB與紅霉素聯(lián)用對表皮葡萄球菌（SE）抑菌活性和生物被膜形成的作用，為黃綿馬酸BB開發(fā)成為一種新型的生物被膜抑制劑提供理論基礎(chǔ)。采用微量稀釋法分別測定黃綿馬酸BB與紅霉素聯(lián)用對11株SE的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），并采用微量棋盤稀釋法測定聯(lián)合用藥的部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）與最低抑膜濃度（minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC）；采用時(shí)間-殺菌曲線法，評價(jià)聯(lián)合用藥對SE的動(dòng)態(tài)殺菌作用；通過二甲氧唑黃 [2.3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[carbonyl(phenylamino)]-2-tetrazolium hydroxide，XTT]比色法、半定量黏附實(shí)驗(yàn)和掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察，評價(jià)聯(lián)合用藥對生物被膜形成各階段的清除作用；采用qRT-PCR技術(shù)檢測生物被膜形成相關(guān)基因表達(dá)的變化，探索聯(lián)合用藥可能的分子機(jī)制。黃綿馬酸BB與紅霉素聯(lián)用的FICI為（0.51±0.00）～（0.75±0.05），表現(xiàn)為相加作用；聯(lián)合用藥對受試菌呈動(dòng)態(tài)抑制和殺滅作用，整體呈相加作用；生物被膜形成的各階段，聯(lián)合用藥組均可顯著抑制受試菌的代謝活性及生物被膜總量的形成，并減少細(xì)菌量及胞外聚合物的形成。聯(lián)合用藥組在耐藥菌株SE04的生物被膜形成的各階段均下調(diào)基因及的表達(dá)，并上調(diào)基因的表達(dá)；對于敏感菌株SE08，在生物被膜形成的各階段均下調(diào)、的表達(dá)，在黏附及聚集期上調(diào)的表達(dá)。黃綿馬酸BB與紅霉素聯(lián)用可以有效抑制SE及其生物被膜的形成，并呈相加作用。抗生物被膜效應(yīng)與抑制細(xì)菌代謝活性、生物被膜總量以及生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。

香鱗毛蕨；黃綿馬酸BB；表皮葡萄球菌；生物被膜；聯(lián)合用藥

皮膚及軟組織感染（skin and soft tissue infections，SSTI）是臨床十分常見的疾病。根據(jù)SSTI的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果可知，SSTI致病菌以葡萄球菌最多[1]，其中表皮葡萄球菌為主要致病菌之一。隨著廣譜抗菌藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，SSTI的耐藥性持續(xù)上升，大大提高了臨床疾病的難愈性和治療成本。而紅霉素（erythromycin）、莫匹羅星等抗生素作為治療皮膚和淺表外傷感染的局部外用抗菌藥物，其耐藥菌株逐漸增加[2]。細(xì)菌耐藥的主要原因之一是病原體能夠形成難以清除的生物被膜，使得藥物不能有效治療其導(dǎo)致的相關(guān)感染[3]。生物被膜大多數(shù)被定義為一種細(xì)胞微生物群落，其嵌在胞外聚合物質(zhì)的基質(zhì)中，具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和特定功能，是微生物適應(yīng)環(huán)境生存的一種生存模式。生物被膜的形成過程可分為4個(gè)階段，主要為初黏附階段、菌落聚集形成階段、生物被膜成熟階段及生物被膜脫落階段。研究發(fā)現(xiàn)，處于生物被膜內(nèi)的細(xì)菌與浮游菌相比，其耐藥性提高10～1000倍[4]。目前，生物被膜抑制劑是目前國外抗生素研究的一個(gè)新方向，抗生素與生物被膜抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，可以減少用藥量，提高臨床治療效果[5]。因此，尋找生物被膜抑制劑作為新藥研發(fā)具有重要意義。

香鱗毛蕨(L.) Schott. 為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物，民間常被用于治療各種皮膚疾病，如牛皮癬、皮炎和皮疹。根據(jù)藥理學(xué)研究，香鱗毛蕨具有抗菌、抗過敏、抗關(guān)節(jié)炎、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性[6]，尤其抗菌活性顯著，且發(fā)揮該作用的主要成分為間苯三酚類化合物。研究顯示，香鱗毛蕨中所含的間苯三酚類化合物黃綿馬酸BB具有良好的抗菌活性[7]。然而，有關(guān)黃綿馬酸BB聯(lián)合抗生素的抗菌活性以及對生物被膜的抑制作用尚未見報(bào)道。本研究通過測定黃綿馬酸BB聯(lián)用抗生素對耐藥和敏感表皮葡萄球菌的抑菌活性及對其生物被膜的抑制作用，為黃綿馬酸BB開發(fā)成為一種新型的抗菌藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥品

黃綿馬酸BB（批號GC-CZ-180906，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自武漢長成化成科技發(fā)展有限公司；紅霉素（批號N0825A）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；頭孢唑啉（批號190501）購自廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司；二甲氧唑黃 [2.3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[carbonyl(phenylamino)]-2-tetrazolium hydroxide，XTT，批號CX30182035] 購自北京酷來搏科技有限公司；Vit.K3（批號C1517035）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CAMHB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號20200513）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號20201117）和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB，批號1090952）均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；iMark酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）；Memmert恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；BKQ-Z301立式壓力蒸汽滅菌鍋（山東博科消毒設(shè)備有限公司）；CHA-S恒溫振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；JSM-7610F Plus場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）。

1.3 菌株

表皮葡萄球菌臨床分離菌株（），共11株（SE01～SE11），由廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司贈(zèng)予；金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株（ATCC@29213）購自廣東省微生物菌種保藏中心。

2 方法

2.1 黃綿馬酸BB與紅霉素的抗菌活性測定

2.1.1 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測定 根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）[8]制定的M07-A9方案進(jìn)行微量稀釋法測定黃綿馬酸BB與紅霉素分別對11株表皮葡萄球菌（SE01～SE11）的MIC值，參考Ko等[9]的方法，將黃綿馬酸BB和紅霉素在96微孔板中進(jìn)行二倍稀釋至終質(zhì)量濃度為5120、2560、1280、640、320、160、80、40、20、10 μg/mL，每孔含100 μL藥液。于各孔中添加100 μL經(jīng)CAMHB培養(yǎng)基稀釋的1×106CFU/mL菌懸液。同時(shí)設(shè)置只含200 μL菌懸液的生長對照組及只含200 μL培養(yǎng)基的空白對照組。于35 ℃恒溫靜置培養(yǎng)18～24 h后，與生長對照組對比，以肉眼觀察無受試細(xì)菌生長的相應(yīng)藥物濃度為MIC。

根據(jù)CLSI制定的M07-A11方案，在進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)時(shí)需對實(shí)驗(yàn)過程及環(huán)境進(jìn)行質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)，以金黃色葡萄球菌（，ATCC@29213）作為質(zhì)控（quality control，QC）菌株，頭孢唑啉為質(zhì)控藥物。平行操作條件下，QC菌株的MIC在0.25～1.00 μg/mL，則認(rèn)定測定結(jié)果有效可信。

2.1.2 聯(lián)合用藥的部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration idex，F(xiàn)ICI）的測定 參考Manalo等[10]的方法并稍作修改，用CAMHB培養(yǎng)基將黃綿馬酸BB和紅霉素分別進(jìn)行梯度濃度稀釋，分別取50 μL藥液接種于96微孔板中，各孔再加入100 μL實(shí)驗(yàn)菌懸液（1.0×106CFU/mL）。最終在96微孔板中，每一行包含梯度濃度遞減的黃綿馬酸BB（4 MIC～1/16 MIC），每一列含有梯度濃度遞減的紅霉素（4 MIC～1/16 MIC），同時(shí)設(shè)置只含菌液的生長對照組及只含培養(yǎng)基的空白對照組。于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18～24 h后，與生長對照孔對比，以肉眼觀察無受試菌生長的相應(yīng)藥物濃度為其MIC值，并根據(jù)MIC值計(jì)算FICI。

結(jié)果評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[11]：以FICI值作為聯(lián)合用藥敏感實(shí)驗(yàn)的判斷依據(jù)，F(xiàn)ICI≤0.5為協(xié)同作用；0.5＜FICI≤1.0為相加作用；1＜FICI≤2為無關(guān)作用；FICI＞2為拮抗作用。

FICI＝MICA藥聯(lián)用/MICA藥單用＋MICB藥聯(lián)用/MICB藥單用

2.2 黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對受試菌株時(shí)間殺菌曲線的測定

參考文獻(xiàn)方法[12]采用活菌計(jì)數(shù)法，黃綿馬酸BB和紅霉素分別稀釋為MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC共4個(gè)濃度，每個(gè)濃度相互聯(lián)合進(jìn)行殺菌曲線的繪制。不同濃度的藥物以及不同組合濃度的藥物加至含1×106CFU/mL菌液濃度的CAMHB培養(yǎng)基中，同時(shí)設(shè)置只含菌液的生長對照組。35 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8、12、24、48 h取出，采用平板稀釋涂布法計(jì)算活菌數(shù)。繪制受試菌的時(shí)間殺菌曲線。

2.3 黃綿馬酸BB和紅霉素抗生物被膜活性的測定

將菌懸液（1×106CFU/mL）接種于96微孔板中，35 ℃下恒溫靜置培養(yǎng)24 h后，除去各孔培養(yǎng)基和浮游菌，使用無菌PBS沖洗孔內(nèi)形成的生物被膜。使用TSB培養(yǎng)基對藥物進(jìn)行梯度稀釋，黃綿馬酸BB單藥組為1280～5 μg/mL，紅霉素單藥組為2560～10 μg/mL，聯(lián)合用藥組按照“2.1.2”項(xiàng)方法進(jìn)行藥物稀釋與組合。各組藥物分別取200 μL加至生物被膜，置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。同時(shí)設(shè)置生長對照組及空白對照組。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以肉眼未見渾濁的最低藥物濃度即為最低抑膜濃度（minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC）[13]。

2.4 黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對受試菌株生物被膜清除作用的測定

根據(jù)“2.3”項(xiàng)測定的MBIC結(jié)果，確定最佳單藥濃度和聯(lián)合用藥濃度。采用XTT比色法、半定量黏附實(shí)驗(yàn)和掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）共同評價(jià)藥物對受試菌株生物被膜的清除作用。

2.4.1 XTT比色法測定黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對受試菌株生物被膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性的影響 含1×106CFU/mL菌液濃度的TSB培養(yǎng)基接種于96微孔板中，在35 ℃下孵育6、24、48 h。于相應(yīng)的時(shí)間段，棄去各孔培養(yǎng)基和浮游菌，進(jìn)行PBS沖洗。SE04菌株加入20 μg/mL黃綿馬酸BB與20 μg/mL紅霉素，SE08菌株加入20 μg/mL黃綿馬酸BB與0.04 μg/mL紅霉素，各200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各孔加100 μL XTT（0.5 mg/mL）/Vit.K3（10 mmol/L）混合液試劑，35 ℃避光孵育2 h后，測定450 nm吸光度（450）值。同時(shí)設(shè)置生長對照組及空白對照組。

2.4.2 半定量黏附實(shí)驗(yàn)測定黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對受試菌株生物被膜總量的影響 按“2.4.1”項(xiàng)方法建立給藥和不給藥的6、24、48 h生物被膜，甲醇固定30 min后棄去，加入0.1%結(jié)晶紫染液，染色15 min后洗去未黏附染料，并采用95%乙醇溶解染料，測定570 nm吸光度（570）值，即為生物被膜總量。

2.4.3 SEM觀察黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對受試菌株生物被膜微觀結(jié)構(gòu)的影響 參考Schneider等[14]的方法，在含14 mm無菌圓玻片的24微孔板上分別構(gòu)建6、24、48 h的生物被膜，并按照“2.4.1”項(xiàng)進(jìn)行藥物干預(yù)。2.5%戊二醛固定生物被膜過夜后，使用梯度濃度（30%、50%、70%、80%、90%、95%）乙醇進(jìn)行梯度洗脫，各梯度濃度共洗脫2次，每次15 min，隨后使用100%乙醇脫水2次，每次30 min。加入100%叔丁醇置換乙醇2次，每次30 min。冷凍真空干燥脫水樣品，進(jìn)行噴金處理，置于掃描電鏡中觀察。同時(shí)設(shè)置生長對照組。

2.5 黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對生物被膜形成相關(guān)基因表達(dá)的影響

按“2.4.1”項(xiàng)方法建立給藥或不給藥的6、24、48 h生物被膜，按照制造商的規(guī)程使用Trizol試劑提取mRNA。隨機(jī)取5例RNA樣品1 μL，用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA條帶，若3條條帶完整即可證明總RNA抽提比較完整。然后使用Prime Script TMRT reagent Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。最后，采用SYBR Premix EX Taq Ⅱ Kit試劑盒配制反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR檢測。qRT-PCR的數(shù)據(jù)結(jié)果以為內(nèi)參基因采用相對表達(dá)量2???Ct法進(jìn)行分析。mRNA引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列

Table 1 Primer sequence of target gene

基因ID序列長度/bp aap-F5’-TGTCCCATACCCTCTATAGCCTTG-3’104 aap-R5’-CACCTAGTGCAGCTGGTTTCAG-3’ atlE-F5’-ACAAATGCGTGTACGAATGCA-3’112 atlE-R5’-GACGTCCTGAAGGTATCGTTGTT-3’ SarA-F5’-ATTATTTGCTTCTGTGATACGGTTGT-3’112 SarA-R5’-ACGTAATGAACACGATGAAAGAACTG-3’ agrA-F5’-TGTCTTGAAACAGCACATACACGA-3’ 97 agrA-R5’-GAACGTATACTGAATTACTTCCCCG-3’ 16S rRNA-F5’-GGCAAGCGTTATCCGGAATT-3’101 16S rRNA-R5’-GTTTCCAATGACCCTCCACG-3’

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用軟件GraphPad Prism software version 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析法，遵循檢驗(yàn)，＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃綿馬酸BB與紅霉素單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥的抗菌活性

如表2所示，黃綿馬酸BB與紅霉素聯(lián)合用藥對11株受試菌株的FICI值范圍為（0.51±0.00）～（0.75±0.05），均在0.5～1.0的區(qū)間內(nèi)，說明黃綿馬酸BB可增強(qiáng)紅霉素對表皮葡萄球菌的抑制作用，表現(xiàn)為相加作用。黃綿馬酸BB和紅霉素對菌株SE04單獨(dú)用藥的MIC分別為45.91 μg/mL和128.00 μg/mL，聯(lián)合用藥后分別降至14.00 μg/mL和22.00 μg/mL；對于菌株SE08，黃綿馬酸BB和紅霉素單獨(dú)用藥的MIC分別為40.00 μg/mL和0.31 μg/mL，聯(lián)合用藥后二者分別降至13.33 μg/mL和0.16 μg/mL。因此根據(jù)各單藥組的MIC值以及聯(lián)合用藥后的FICI值，選擇1株對紅霉素耐藥且聯(lián)合效果較好的菌株（SE04）以及1株對紅霉素敏感且聯(lián)合效果較好的菌株（SE08）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 黃綿馬酸BB與紅霉素聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝3)

Table 2 Results of combined susceptibility test of flavaspidic acid BB and erythromycin (n = 3)

菌株編號黃綿馬酸BB/(μg·mL?1)紅霉素/(μg·mL?1)FICI ()作用效應(yīng) MIC單MIC聯(lián)用MIC單MIC聯(lián)用 SE01 44.6715.005 120.00560.000.67±0.22相加 SE02 60.0020.005 120.00640.000.63±0.00相加 SE03 44.8920.00 80.00 10.000.51±0.00相加 SE04 45.9114.00 128.00 22.000.51±0.00相加 SE05 48.0020.00 96.00 12.000.51±0.00相加 SE06144.0033.33 0.16 0.070.75±0.05相加 SE07 50.0016.67 144.00 64.000.58±0.06相加 SE08 40.0013.33 0.31 0.160.75±0.18相加 SE09 25.0013.33 15.00 7.500.75±0.00相加 SE10 41.3018.005 120.00512.000.56±0.10相加 SE11 40.0020.005 120.00320.000.51±0.00相加

SE01～SE11均為表皮葡萄球菌臨床分離菌株，共11株

SE01—SE11 were all clinical isolates of, including 11 strains

3.2 黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對受試菌株時(shí)間殺菌曲線的影響

如圖1-A、B所示，菌株SE04的生長對照組4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，24 h后進(jìn)入成熟期，此后菌落數(shù)趨于平緩；黃綿馬酸BB組和紅霉素組在0～4 h菌落數(shù)持續(xù)下降，對菌落生長均有較好殺滅作用，12 h后菌落數(shù)在逐漸上升，表明殺菌作用逐漸減弱，48 h時(shí)菌落數(shù)基本趨于平衡，對比生長對照組的菌落數(shù)量均有輕微的下降。

A、B-SE04菌株的時(shí)間-殺菌曲線 C、D-SE08菌株的時(shí)間-殺菌曲線 BB-黃綿馬酸BB ERY-紅霉素 B＋E-黃綿馬酸BB＋紅霉素 1/2BB- 1/2 MIC的黃綿馬酸BB 1/4BB-1/4 MIC的黃綿馬酸BB 1/8BB-1/8MIC的黃綿馬酸BB 1/2ERY-1/2 MIC的紅霉素 1/4ERY-1/4MIC的紅霉素 1/8ERY-1/8 MIC的紅霉素 1/2B＋E-1/2 MIC的黃綿馬酸BB＋1/2MIC的紅霉素 1/4B＋E-1/4 MIC的黃綿馬酸BB＋1/4MIC的紅霉素 1/8B＋E-1/8 MIC的黃綿馬酸BB＋1/8MIC的紅霉素

聯(lián)合用藥后的殺菌作用較各單藥組好，其中1/2B＋E組在24 h內(nèi)有較好的抑制作用，較最有效的1/2 MIC兩單藥組菌落數(shù)下降了1～2 lgCFU，根據(jù)文獻(xiàn)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[15]，藥物聯(lián)用組菌落計(jì)數(shù)較最有效的單藥組減少≥2 lgCFU，定義為協(xié)同作用；藥物聯(lián)用組菌落計(jì)數(shù)較最有效的單藥組減少1～2 lgCFU，定義為相加作用。因此，表明黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素抑制SE04菌株呈相加作用。

SE08菌株的時(shí)間-殺菌曲線如圖1-C、D所示，生長對照組于6 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，24 h后進(jìn)入成熟期，此后菌落數(shù)趨于平緩。黃綿馬酸BB組在0～4 h菌落數(shù)呈下降趨勢，在6～48 h時(shí)菌落數(shù)量總體呈上升趨勢，提示其殺菌作用隨時(shí)間逐漸減弱。紅霉素組在0～24 h菌落數(shù)緩慢持續(xù)的上升，到達(dá)48 h時(shí)菌落數(shù)量達(dá)到最大。與生長對照組比較，各單藥組的菌落數(shù)量均有輕微下降。聯(lián)合用藥后整體的殺菌作用優(yōu)于各單藥組，其中聯(lián)合用藥組中1/2B＋E的抑菌作用最佳，較最有效的單藥組菌落數(shù)下降了1～2 lgCFU，表明黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素抑制SE08菌株呈相加作用。

SE04與SE08菌株的時(shí)間-殺菌曲線相比較可發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥后SE04菌株的對數(shù)生長期延遲至12 h，成熟期延至24 h；SE08菌株的對數(shù)生長期延遲至12 h，48 h內(nèi)未出現(xiàn)成熟期。提示黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對耐藥或敏感菌株均具有延遲其生長的作用，尤其對敏感菌株SE08的抑制作用更為明顯。

3.3 黃綿馬酸BB與紅霉素單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥的抗生物被膜活性

結(jié)果如表3所示，黃綿馬酸BB和紅霉素聯(lián)合用藥后，對受試菌株SE04和SE08的生物被膜的FICI值分別為0.19±0.00和0.14±0.00，均呈協(xié)同效應(yīng)。并根據(jù)聯(lián)合用藥的MBIC值，確定對受試菌株SE04的最佳聯(lián)用藥物干預(yù)質(zhì)量濃度為20 μg/mL黃綿馬酸BB與20 μg/mL紅霉素，對SE08菌株的最佳聯(lián)用藥物干預(yù)質(zhì)量濃度為20 μg/mL黃綿馬酸BB與0.04 μg/mL紅霉素，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以此質(zhì)量濃度進(jìn)行。

3.4 黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對受試菌株生物被膜的清除效果

3.4.1 黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對受試菌株生物被膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性的影響 如圖2-A～C所示，聯(lián)合用藥組各階段生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝活性均顯著低于生長對照組（＜0.001）和各單藥組（＜0.05、0.001）?？梢婞S綿馬酸BB與紅霉素聯(lián)用后可有效抑制SE04菌株生物被膜形成各階段的膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性，且比2種藥物單獨(dú)使用的效果好。

表3 黃綿馬酸BB與紅霉素對表皮葡萄球菌的抗生物被膜活性()

Table 3 Antimicrobial activities of flavaspidic acid BB and erythromycin against Staphylococcus epidermis growing in biofilm ()

菌株編號黃綿馬酸BB/(μg·mL?1)紅霉素/(μg·mL?1)FICI作用效應(yīng) MBIC單MBIC聯(lián)用MBIC單MBIC聯(lián)用 SE04320.00±0.0020.00±0.00160.00±0.0020.00±0.000.19±0.00協(xié)同 SE08160.00±0.0020.00±0.00 2.50±0.00 0.04±0.000.14±0.00協(xié)同

A～C-SE04菌株的膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性 D～F-SE08菌株的膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性 A、D-黏附階段（6 h） B、E-聚集階段（24 h） C、F-成熟階段（48 h） BB-黃綿馬酸BB ERY-紅霉素 與生長對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與兩單藥組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，圖3、6、7同

如圖2-D～F所示，相較于生長對照組，聯(lián)合用藥組在各階段均能有效降低生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝活性（＜0.001）；在黏附階段，聯(lián)合用藥組的效果優(yōu)于紅霉素組（＜0.01）；在聚集和成熟階段，聯(lián)合用藥組的作用效果均優(yōu)于各單藥組（＜0.05、0.01、0.001）?？梢婞S綿馬酸BB與紅霉素聯(lián)用后可有效抑制SE08菌株生物被膜形成各階段的膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性，且效果優(yōu)于2種藥物單獨(dú)使用。

SE04與SE08菌株對比發(fā)現(xiàn)，分別與兩單藥組比較，聯(lián)合用藥對耐藥菌株SE04的膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性的抑制作用優(yōu)勢階段主要體現(xiàn)在黏附與聚集期，敏感菌株SE08則在聚集與成熟期。

3.4.2 黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對受試菌株生物被膜總量的影響 如圖3所示，聯(lián)合用藥組在SE04與SE08菌株各階段均可有效抑制生物被膜的形成，且效果均顯著優(yōu)于生長對照組（＜0.001）和各單藥組（＜0.05、0.01、0.001）?？梢婞S綿馬酸BB與紅霉素聯(lián)用后可有效抑制SE04與SE08菌株各階段生物被膜的形成，且比2種藥物單獨(dú)使用的效果好。隨著生物被膜逐漸形成，聯(lián)合用藥對耐藥菌株SE04和敏感菌株SE08生物被膜總量的清除作用均逐漸降低。

A～C-SE04菌株的生物被膜總量 D～F-SE08菌株的生物被膜總量

3.4.3 SEM觀察受試菌株生物被膜微觀結(jié)構(gòu)的變化 如圖4、5所示，生長對照組在黏附階段（6 h）呈正常卵圓狀，大小均一且光滑，且細(xì)菌逐漸開始相互黏附成團(tuán)。與生長對照組相比，黃綿馬酸BB作用后，細(xì)菌量相對減少，細(xì)菌之間黏連減少；紅霉素作用后無明顯變化；聯(lián)合用藥組細(xì)菌量大幅度下降，細(xì)菌形態(tài)輕微變形，可觀察到菌體破裂。在聚集階段（24 h），生長對照組微菌落相互聚集，胞間連接緊密，形成片狀生物被膜。與生長對照組相比，黃綿馬酸BB作用后，菌體部分破裂皺縮，仍可見胞外聚合物包裹在菌體外部；紅霉素作用后效果不明顯；聯(lián)合用藥組細(xì)菌量大幅度減少，細(xì)菌之間黏附較松散，可見少量細(xì)胞內(nèi)容物滲出，生物被膜結(jié)構(gòu)瓦解，菌體變形皺縮。在成熟階段（48 h），生長對照組已經(jīng)形成完整復(fù)雜的成熟生物被膜，細(xì)菌間連接緊密成簇狀；各單藥組膜內(nèi)細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)完整；聯(lián)合用藥組細(xì)菌量大幅度下降，細(xì)菌之間黏連不成片，生物被膜結(jié)構(gòu)趨向瓦解，細(xì)菌呈皺縮、凹陷等狀態(tài)。

總體而言，黃綿馬酸BB與紅霉素聯(lián)合用藥對SE04和SE08菌株均表現(xiàn)出較好的生物被膜清除作用，且總體上優(yōu)于兩單藥組。尤其在聚集與成熟期，聯(lián)合用藥對敏感菌株SE08的清除作用優(yōu)于耐藥菌株SE04。

3.5 黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對生物被膜形成相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖6所示，在耐藥菌株SE04的黏附和聚集階段，與紅霉素組相比，聯(lián)合用藥組可顯著下調(diào)及表達(dá)并上調(diào)的表達(dá)（＜0.05、0.001）。且聯(lián)合用藥后對生物被膜形成各階段的基因和黏附階段的基因的表達(dá)的影響均顯著高于兩單藥組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.001）。

BB-20 μg/mL黃綿馬酸BB ERY-20 μg/mL紅霉素 BB + ERY-20 μg/mL黃綿馬酸BB＋20 μg/mL紅霉素

如圖7所示，與生長對照組相比，在敏感菌株SE08生物被膜形成的各階段，聯(lián)合用藥組均可顯著下調(diào)、的表達(dá)（＜0.01、0.001），同時(shí)在黏附階段顯著上調(diào)的表達(dá)（＜0.001）。其中，聯(lián)合用藥組對生物被膜形成各階段的、基因和黏附及聚集階段的基因表達(dá)的影響顯著高于黃綿馬酸BB組或紅霉素組（＜0.05、0.01、0.001）。

結(jié)合圖6與圖7發(fā)現(xiàn)，SE04和SE08菌株的各給藥組在各個(gè)階段均有效抑制表達(dá)，且兩株受試菌聯(lián)合用藥組均在黏附期對表達(dá)的下調(diào)作用顯著優(yōu)于單藥組；對于SE04和SE08菌株，黃綿馬酸BB在生物被膜形成聚集期對均表現(xiàn)明顯的上調(diào)作用。聯(lián)合用藥組對SE04菌株生物被膜形成各階段表達(dá)均呈顯著上調(diào)作用，對SE08菌株僅表現(xiàn)在黏附階段；聯(lián)合用藥組對SE08菌株生物被膜形成各階段的表達(dá)均呈顯著抑制作用，對SE04菌株僅表現(xiàn)在黏附期。總而言之，說明聯(lián)合用藥對耐藥和敏感受試菌基因的調(diào)節(jié)作用規(guī)律基本一致，且對耐藥菌株SE04的調(diào)控作用相較敏感菌株SE08更持久，而對SE08菌株的調(diào)控作用較SE04菌株更持久。

4 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)，紅霉素作為臨床治療常用抗生素，其在亞抑菌濃度條件下可誘導(dǎo)耐藥表皮葡萄球菌產(chǎn)生生物被膜，從而增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性[16]。因此，如何有效防止生物被膜的形成仍然是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問題。

細(xì)菌生物被膜是一個(gè)由多種物質(zhì)組成的復(fù)雜有機(jī)體，在生物被膜形成的過程中，存在多種基因表達(dá)相互調(diào)控，甚至受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響。研究表明，在細(xì)菌聚集形成微菌落時(shí)，發(fā)揮主要作用的是多糖胞間黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA），由操縱子介導(dǎo)。同時(shí)是操縱子的轉(zhuǎn)錄激活子，其可以控制的表達(dá)影響PIA的形成，分泌胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）包裹細(xì)菌，從而控制生物被膜的形成[17]。此外，在細(xì)菌增殖及聚集的過程中，還存在著非PIA依賴形成生物被膜的途徑。表皮葡萄球菌表面的相關(guān)聚集蛋白Aap是非PIA依賴途徑的關(guān)鍵，是表皮葡萄球菌細(xì)胞壁上的蛋白黏附分子，由基因編碼產(chǎn)生，可通過Zn依賴型機(jī)制介導(dǎo)細(xì)胞間相互黏附聚集，進(jìn)而促進(jìn)表皮葡萄球菌生物膜的形成[18]；生物被膜到達(dá)成熟階段后，群體感應(yīng)系統(tǒng)被激活來調(diào)控生物被膜的進(jìn)一步形成以及脫落。群體感應(yīng)系統(tǒng)通過監(jiān)測其群體密度來調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)，為菌體生長以及生物膜形成提供保障，還可以調(diào)控EPS的合成，介導(dǎo)細(xì)菌的黏附能力，影響生物膜的成熟與結(jié)構(gòu)[19]。迄今為止，葡萄球菌屬中主要被報(bào)道的群體感應(yīng)系統(tǒng)有agr系統(tǒng)和LuxS系統(tǒng)。為agr群體感應(yīng)系統(tǒng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，可激活系統(tǒng)的表達(dá)并調(diào)控RNAⅢ的表達(dá)和psmα/psmβ編碼phenol-soluble modulins（PSMs），從而進(jìn)一步調(diào)控生物被膜的形成。有研究表明，agr系統(tǒng)還能促進(jìn)生物膜脫落及解離，并可以上調(diào)細(xì)菌蛋白酶和毒素，下調(diào)黏附素等[20]。結(jié)合本研究結(jié)果，說明黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素是通過抑制和基因的表達(dá)，減少PIA生成和細(xì)菌相互聚集黏附。同時(shí)，通過上調(diào)群體感應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制生物被膜的形成。

BB-20 μg/mL黃綿馬酸BB ERY-0.04 μg/mL紅霉素 BB + ERY-20 μg/mL黃綿馬酸BB＋0.04 μg/mL紅霉素

抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)一直是臨床用藥的一大難點(diǎn)。本研究通過XTT實(shí)驗(yàn)、半定量黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃綿馬酸BB與紅霉素聯(lián)合用藥后耐藥菌株生物被膜的各階段代謝水平及生物被膜形成總量均顯著降低，且隨著生物被膜的逐漸成熟，其抑制效果逐漸減弱。結(jié)合SEM觀察結(jié)果分析，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是由于成熟的生物被膜具有較緊密的三維結(jié)構(gòu)，并且EPS為膜內(nèi)細(xì)菌形成了一層擴(kuò)散屏障，防止抗生素等有毒物質(zhì)擴(kuò)散至菌體內(nèi)，因此更能耐受藥物處理。同時(shí)，由SEM觀察結(jié)果分析可得聯(lián)合用藥可有效降低細(xì)菌量、減少細(xì)菌之間的黏連及EPS的形成。此外，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)合用藥對耐藥菌株的、和基因的表達(dá)均具明顯調(diào)控作用。綜上推斷，黃綿馬酸BB與紅霉素聯(lián)合用藥對耐藥表皮葡萄球菌生物被膜的作用機(jī)制可能是在生物被膜形成初期抑制細(xì)菌代謝活性，導(dǎo)致細(xì)菌活力降低，難以在表面進(jìn)行黏附；在細(xì)菌聚集形成微菌落時(shí)，抑制PIA的生成，導(dǎo)致EPS的分泌量減少，減少細(xì)菌間的相互聚集和黏附，從而抑制生物被膜的形成；當(dāng)微菌落逐漸擴(kuò)大，生物被膜不斷增厚到達(dá)成熟階段后，藥物較難穿透生物被膜作用于內(nèi)部菌體，但仍可通過調(diào)控群體感應(yīng)系統(tǒng)來促進(jìn)生物膜的脫落及解離，從而達(dá)到清除生物被膜的作用。

圖6 黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對SE04生物被膜形成各階段相關(guān)基因的相對表達(dá)情況()

圖7 黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素對SE08生物被膜形成各階段相關(guān)基因的相對表達(dá)情況()

綜上所述，黃綿馬酸BB聯(lián)合紅霉素可以干擾表皮葡萄球菌生物被膜的形成，有效降低細(xì)菌對其抗生素的耐藥性，達(dá)到減量增效的效果，為將黃綿馬酸BB開發(fā)成為一種新型的生物被膜抑制劑提供了理論基礎(chǔ)，也為抗菌藥物的開發(fā)利用提供了更多的可能性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Tognetti L, Martinelli C, Berti S,. Bacterial skin and soft tissue infections: Review of the epidemiology, microbiology, aetiopathogenesis and treatment: A collaboration between dermatologists and infectivologists [J]., 2012, 26(8): 931-941.

[2] 李曉雨, 馬明蔥, 譚云芳, 等. 廣東省2016年細(xì)菌耐藥性監(jiān)測及動(dòng)態(tài)分析 [J]. 中國抗生素雜志, 2018, 43(10): 1263-1270.

[3] Beenken K E, Dunman P M, McAleese F,. Global gene expression inbiofilms [J]., 2004, 186(14): 4665-4684.

[4] Ehrlich G D, Ahmed A, Earl J,. The distributed genome hypothesis as a rubric for understanding evolutionduring chronic bacterial biofilm infectious processes [J]., 2010, 59(3): 269-279.

[5] Chen Y, Liu T J, Wang K,. Baicalein inhibitsbiofilm formation and the quorum sensing system[J]., 2016, 11(4): e0153468.

[6] Peng B, Bai R F, Li P,. Two new glycosides fromwith anti-inflammatory activities [J]., 2016, 18(1): 59-64.

[7] 殷川平, 陳文浩, 莫梓童, 等. 黃綿馬酸BB對皮膚軟組織感染致病菌的抗菌活性及機(jī)制研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(6): 1662-1667.

[8] Wayne P A, Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically. [S]. 11th ed. CLSI standard M07. 2018.

[9] Ko S J, Kang N H, Kim M K,. Antibacterial and anti-biofilm activity, and mechanism of action of pleurocidin against drug resistant[J]., 2019, 127: 70-78.

[10] Manalo R V M, Josol V J D, Gloriani N G. The differential effects of atorvastatin co-administered with ampicillin on the bacterial growth and biofilm formation of[J]., 2017, 7(5): 178-183.

[11] 馬冬梅, 陶慶春, 齊宏偉. 雙黃連粉針劑聯(lián)合三種抗生素對廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抑菌分析 [J]. 中國臨床研究, 2017, 30(12): 1702-1703.

[12] 陳學(xué)情, 蔣家璇, 任志鴻, 等. 納米銀的抗菌特性及對多重耐藥菌株的抗菌作用 [J]. 微生物學(xué)報(bào), 2017, 57(4): 539-549.

[13] 姜?jiǎng)? 陳向東, 汪輝, 等. 莫西沙星對耐藥葡萄球菌生物膜體外藥效學(xué)研究 [J]. 藥學(xué)與臨床研究, 2015, 23(4): 347-350.

[14] Schneider R, Primon-Barros M, von Borowski R G,. Pseudonajide peptide derived from snake venom alters cell envelope integrity interfering on biofilm formation in[J]., 2020, 20(1): 237.

[15] Luther M K, Arvanitis M, Mylonakis E,. Activity of daptomycin or linezolid in combination with rifampin or gentamicin against biofilm-formingorin anpharmacodynamic model using simulated endocardial vegetations and ansurvival assay usinglarvae [J]., 2014, 58(8): 4612-4620.

[16] 何洪靜. 表皮葡萄球菌耐藥特征及其PIA上游調(diào)控子與亞-MIC紅霉素影響其生物膜形成的關(guān)系研究 [D]. 重慶: 第三軍醫(yī)大學(xué), 2015.

[17] Tormo M A, Martí M, Valle J,. SarA is an essential positive regulator ofbiofilm development [J]., 2005, 187(7): 2348-2356.

[18] Conrady D G, Wilson J J, Herr A B. Structural basis for Zn2+-dependent intercellular adhesion in staphylococcal biofilms [J]., 2013, 110(3): E202-E211.

[19] 舒琴, 牛永武, 陳啟和. 細(xì)菌生物被膜中群體感應(yīng)調(diào)控機(jī)制及其控制研究展望 [J]. 生物加工過程, 2019, 17(3): 292-299.

[20] Le K Y, Michael O. Quorum-sensing regulation in staphylococci-an overview [J]., 2015, 6: 1174-1182.

Antibacterial and antibiofilm effects of flavaspidic acid BB combined with erythromycin on

CAI Zhi-ling1, MO Zi-tong1, ZHENG Shi-qian1, XIE Sheng-jun1, LAN Shi-hua1, SHEN Zhi-bin1, 2, 3

1. School of TCM, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2. Guangdong Provincial Engineering Center of topical precise drug delivery system, Guangzhou 510006, China 3. Guangdong Provincial Cosmetics Engineering Technology Research Center, Guangzhou 510006, China

To explore the antibacterial and antibiofilm effects of flavaspidic acid BB combined with erythromycin on(SE), and to provide the theoretical basis for the development of flavaspidic acid BB into a new type of antibacterial drug.The microdilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of flavaspidic acid BB and erythromycin against 11 strains of SE. And the antimicrobial susceptibility against the strains were evaluated with fractional inhibitory concentration index (FICI) and the minimum biofilm inhibitory concentration (MBIC) of flavaspidic acid BB combined with erythromycin by chessboard dilution method. By drawing a time-kill curve, the dynamic bactericidal effect of flavaspidic acid BB combined and erythromycin on SE was evaluated. XTT colorimetric method, semi-quantitative adhesion test and scanning electron microscope (SEM) were used to evaluate the scavenging effect of the combined drug on the biofilm of the strains. The expression changes of biofilm formation related genes (,,) were detected by qRT-PCR.FICI value of BB and erythromycin ranged from (0.51 ± 0.00) to (0.75 ± 0.05), which showed additive effect. According to the time-kill curve, the combination of drugs could effectively inhibit and kill the SE. In each stage of biofilm formation, the combination drug group could significantly inhibit the metabolic activity of the tested bacteria and the formation of biofilm substrate quality, and reduce the amount of bacteria and the adhesion between bacteria and inhibit the formation of extracellular polymer. For resistant strain SE04, the expressions ofandgenes were down-regulated andgene expression was up-regulated at each stage of biofilm formation in drug combination group. For sensitive strain SE08, drug combination group could down-regulate the expression ofandgenes at all stages, and up-regulate the expression ofgene at adhesion and aggregation stages.The combination of flavaspidic acid BB and erythromycin has good antibacterial and antibiofilm effects on SE, which showed additive effect. The antibiofilm effect is associated with inhibiting bacterial metabolic activity, formation of biofilm substrate quality, and the expression of genes related to biofilm formation.

(L.) Schott.; flavaspidic acid BB;; biofilm; drug combination

R285

A

0253 - 2670(2022)08 - 2417 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.019

2021-10-20

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“中醫(yī)藥現(xiàn)代化”重點(diǎn)專項(xiàng)項(xiàng)目（2018YFC1707100）

蔡芝玲（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幪崛》蛛x技術(shù)與應(yīng)用。E-mail: cc34293821@qq.com

沈志濱（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及新藥研發(fā)。E-mail: szb8113@126.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]