于仁峰，鄒小倉(cāng)，鄒大陽(yáng)，李琳昊，王可慧，賀曉明，徐雅晴，秦日輝，莫冬冬，段佳慧，余濤*，劉威*，郭金鵬*

目前，對(duì)于由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）沒有特效治療方法，早發(fā)現(xiàn)、早報(bào)告、早檢測(cè)、早隔離是疫情防控的重要手段［1］。SARS-CoV-2 屬于β-冠狀病毒簇，是一種具有外膜的正鏈單股RNA 病毒，其基因組可編碼 RNA聚合酶、刺突 （S） 糖蛋白、膜 （M） 糖蛋白、包膜（E） 糖蛋白和核衣殼（N）蛋白［2］。其中N蛋白不僅將病毒RNA和蛋白質(zhì)包裝成病毒體，還能促進(jìn)病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，并損害宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，是一種高免疫原性且在感染過(guò)程中大量表達(dá)的蛋白，目前關(guān)于SARS-CoV-2 N蛋白的報(bào)道相對(duì)較少，迫切需要對(duì)SARS-CoV-2 N蛋白的更新認(rèn)識(shí)［3-5］。同時(shí)，N蛋白相對(duì)保守，在病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中所占比例最大，感染早期機(jī)體能產(chǎn)生抗N蛋白的高水平抗體［6］。另外一個(gè)重要的蛋白是S蛋白，其可以介導(dǎo)SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞。研究顯示，中和抗體主要通過(guò)與S1亞基上的受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）片段結(jié)合進(jìn)而競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷S蛋白與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2（ACE2）的結(jié)合，因此，SARS-CoV-2的S1蛋白是抗病毒中和抗體的重要靶點(diǎn)［7］，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是研究疫苗的常用抗原［8］。檢測(cè)血清中SARS-CoV-2抗體不僅簡(jiǎn)單、快速，而且能區(qū)分急性感染和既往感染，更適合基層醫(yī)院使用。冠狀病毒基因組所編碼的抗原中，N 蛋白具有較高的免疫原性，可在早期感染時(shí)分泌到體液中，作為抗原檢測(cè)的生物標(biāo)志物，同時(shí)機(jī)體產(chǎn)生抗N蛋白抗體可被用于檢測(cè)SARS-CoV-2感染［9］。本研究建立了SARS-CoV-2抗N 蛋白IgG抗體熒光免疫層析方法，具有檢測(cè)時(shí)間短、方法簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可使用免疫熒光檢測(cè)儀讀取硝酸纖維素（NC）膜質(zhì)控線（C線）、檢測(cè)線（T線）熒光值，使靈敏度更高，更客觀可靠，可用于檢測(cè)人血清、血漿、指尖血樣本中的抗SARSCoV-2 N蛋白IgG抗體。制備的免疫層析檢測(cè)試紙條，可輔助臨床判斷被檢者是否感染SARS-CoV-2以及體內(nèi)是否產(chǎn)生抗體，對(duì)疾病流行篩查及評(píng)估均具有較大意義。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 50例健康人血清（陰性樣本，本課題研究始于2020年8月，期間解放軍疾病預(yù)防控制中心采集注射腺病毒疫苗的健康人血清）及COVID-19患者陽(yáng)性滅活血清（陽(yáng)性樣本，來(lái)源于解放軍疾病預(yù)防控制中心2020年3月隨機(jī)采集于武漢火神山醫(yī)院的陽(yáng)性血清樣本）。

1.2 試劑與儀器 量子點(diǎn)微球（QDS）（上海邁瑞爾科技有限公司、昆道公司、BRAVEOS以及ACMES）、鼠抗人IgG抗體（北京索萊寶公司）、硝酸纖維素膜（NC膜）（WATMAN）、玻璃微纖維（樣品墊）（上海金標(biāo)公司）、聚脂纖維（結(jié)合墊）（上海金標(biāo)公司）、吸水墊（上海金標(biāo)公司）、N蛋白IgG抗體檢測(cè)ELISA試劑盒（北京科衛(wèi)科技有限公司），SARS-CoV-2抗N蛋白IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品85.3 μg/g，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，編號(hào)：GBW（E）091110）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺 （EDC）、NHS（麥克林公司）、熒光檢測(cè)儀（北京弘進(jìn)久安生物科技有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（大龍公司）、噴金劃膜儀（上海金標(biāo)公司）、斬切機(jī)（上海金標(biāo)公司）、玻璃儀器（欣維爾公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)原理 將N蛋白抗體和鼠抗人IgG抗體分別包被到NC膜C線、T線對(duì)應(yīng)區(qū)域，將偶聯(lián)了量子點(diǎn)的N蛋白抗原噴涂到已處理好的玻纖墊上；若待測(cè)血清中含有N蛋白抗體，在層析的過(guò)程中，與玻纖墊上的量子點(diǎn)標(biāo)記N蛋白抗原特異度結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物繼續(xù)向上層析，并與NC膜T線區(qū)域包被的鼠抗人IgG抗體結(jié)合，使T線位置受激發(fā)光激發(fā)顯示出紅色條帶，而未與血清中抗體結(jié)合的量子點(diǎn)標(biāo)記N蛋白抗原則繼續(xù)向前層析，與C線包被的N蛋白抗體結(jié)合，使C線位置受激發(fā)光激發(fā)顯示出紅色條帶（陽(yáng)性）；若待測(cè)血清中無(wú)N蛋白IgG抗體則量子點(diǎn)標(biāo)記抗原無(wú)法與T線包被的鼠抗人IgG結(jié)合，直接向上層析，與C線包被的抗N蛋白IgG抗體結(jié)合，C線位置受激發(fā)光激發(fā)顯示出紅色條帶，而在T線位置無(wú)顯色條帶（陰性）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 SARS-CoV-2 重組N 蛋白抗原的制備 核酸序列來(lái)自GenBank，序列號(hào)：QQL14119.1，氨基酸1-194；將序列送至測(cè)序公司進(jìn)行合成，然后酶切連接至pET28a載體中。將連接成功、測(cè)序正確的載體命名為pET28a-COV_N，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21大腸埃希菌中，待細(xì)菌生長(zhǎng)至波長(zhǎng)為600的吸光度（OD值）為 0.06時(shí)，加入0.05 mmol/L IPTG，在16 ℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)8 h。4 000 r/min，30 min收集菌體，加入裂解緩沖液，重懸菌體至無(wú)顆粒狀，置冰上，超聲破碎。18 000 r/min，30 min離心，收集上清。超聲上清經(jīng)過(guò)0.45 μm針孔過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，用5倍柱體積裂解緩沖液平衡填料。將處理好的上清與平衡好的Ni柱4 ℃結(jié)合1.5 h，后轉(zhuǎn)入重力柱內(nèi)。連接恒流泵和蛋白檢測(cè)儀，觀察峰圖收集流穿。用洗脫緩沖液對(duì)填料進(jìn)行目的蛋白洗脫，分5～8次，每次1倍柱體積洗脫緩沖液進(jìn)行目的蛋白洗脫。收集每次洗脫液，進(jìn)行電泳鑒定。

1.4.2 重組N 蛋白抗原的ELISA試劑盒驗(yàn)證 將初始濃度為2 mg/ml的SARS-CoV-2重組N蛋白用coating緩沖液稀釋至1μg/ml，用以制作蛋白工作液。設(shè)置10孔（試劑盒的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10倍、20倍、30倍、40倍、陰性對(duì)照，每濃度梯度設(shè)2個(gè)平行），用上述制備好的工作液與ELISA試劑盒作對(duì)比，參照物為試劑盒內(nèi)自帶N蛋白包被的板孔，設(shè)定12孔（陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10倍、20倍、30倍、40倍、陰性對(duì)照、空白，每濃度梯度設(shè)2個(gè)平行）；實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說(shuō)明書，450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。

1.4.3 量子點(diǎn)檢測(cè)試紙條的制備及優(yōu)化

1.4.3.1 試紙條的制備 用相應(yīng)的處理液分別浸泡金標(biāo)墊、樣品墊后烘干，然后將其分別裁成尺寸適宜的小條，裝入干燥劑并將袋口封緊備用；EDC/NHS法活化量子點(diǎn)微球，用PBS（pH值6.0）反應(yīng)緩沖液稀釋SARSCoV-2 N蛋白抗原，然后將活化后的量子點(diǎn)微球迅速加入SARS-CoV-2 N蛋白中，混勻37 ℃孵育1 h；4 ℃，14 000 r/min離心15 min，去上清；加封閉液（1% BSA溶液）200 μl，充分超聲分散，孵育2 h；根據(jù)比例稀釋后，進(jìn)行噴金，噴量參數(shù)為2.5 μl/cm。取出NC膜，剪成300 mm/條，平整貼在PVC背板上，室溫放置30～60 min。將N蛋白IgG抗體（0.5 mg/ml）及鼠抗人IgG（0.5 mg/ml）利用噴金劃膜儀劃線（操作流程參考《三維劃膜噴金儀操作流程》），劃好的NC膜置于干燥箱中烘干。將干燥的吸水紙裁成31.5 mm×300 mm每條，貼在背板長(zhǎng)端，在NC膜下端貼上金墊與樣品墊，兩端均壓NC膜1 mm，切成3.88 mm寬的試紙條，備用。

1.4.3.2 量子點(diǎn)微球的篩選 選取邁瑞爾、昆道、BRAVEOS、ACMES四家公司生產(chǎn)量子點(diǎn)，記作1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)，靜置10 min后1號(hào)量子點(diǎn)出現(xiàn)明顯沉淀（圖1）。

按照1.4.3.1標(biāo)記量子點(diǎn)的方法分別用4種量子點(diǎn)標(biāo)記SARS-CoV-2N蛋白抗原，并制成試紙條；向每個(gè)試紙條結(jié)合墊分別滴加1.2 μl 5倍稀釋后的量子點(diǎn)標(biāo)記抗原溶液，用陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，得出T、C線熒光值，每種實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置6個(gè)平行，計(jì)算其T線熒光值平均值。

1.4.3.3 最適檢測(cè)時(shí)間的確定 為了確定量子點(diǎn)試紙條的最佳檢測(cè)時(shí)間，取同一試紙條檢測(cè)陽(yáng)性血清標(biāo)準(zhǔn)品，每隔30 s測(cè)一次信號(hào)，記錄數(shù)據(jù)，繪制曲線。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 陰、陽(yáng)性血清檢測(cè)對(duì)比 應(yīng)用制備好的試紙條檢測(cè)陰、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清（ELISA試劑盒提供），加樣10 min后用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光值，并置于紫外光燈下觀察。

1.5.2 確定檢測(cè)閾值（臨界值） 取陰性樣本血清，測(cè)其T、C線熒光值，計(jì)算T/C線熒光比值（FIT/FIC值），利用SPSS（統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案）軟件推算其中離群樣本，去除離群值，利用SPSS軟件對(duì)其余數(shù)據(jù)進(jìn)行探索性檢驗(yàn)分析，確定此組數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布，確定臨界值。

1.5.3 試紙條靈敏度與重復(fù)性驗(yàn)證 利用SARS-CoV-2抗N蛋白IgG抗體〔85.3μg/g，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，編號(hào)：GBW（E）091110〕來(lái)驗(yàn)證試紙條的靈敏度。將抗 N 蛋白IgG單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋為1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶10 000，每個(gè)稀釋倍數(shù)3個(gè)重復(fù)，取同一批次制作的試紙條檢測(cè)不同濃度結(jié)果取均值。另抽取制備的3 批次試劑卡，檢測(cè)1∶500、1∶2 000、1∶5 000的N 蛋白IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度平行檢測(cè)5次，測(cè)其T、C線熒光值，計(jì)算FIT/FIC均值。

1.5.4 特異度驗(yàn)證 選取季節(jié)性冠狀病毒229E（HD15OC2014）、NL63（HD15DE0922）、HKU1（HD15JA0702）、OC43（HD15JA0704）4種分型的N蛋白IgG抗體（均購(gòu)自義翹神州公司）及支原體P1蛋白、呼吸道合胞病毒F0蛋白、麻疹病毒N蛋白和風(fēng)疹病毒E1蛋白IgG抗體（睿信生物科技公司）驗(yàn)證試紙條的特異度。每種樣本檢測(cè)3次，測(cè)其T、C線熒光值，計(jì)算FIT/FIC均值。

1.5.5 方法學(xué)比較 隨機(jī)抽取本實(shí)驗(yàn)制備的85個(gè)試紙條與SARS-CoV-2抗體檢測(cè)ELISA試劑盒（北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司）同時(shí)對(duì)35份SARS-CoV-2患者血清（血清由解放軍疾病預(yù)防控制中心提供）和50例正常人血清進(jìn)行檢測(cè)比較，同時(shí)對(duì)樣本核酸檢測(cè)結(jié)果（臨床確診）進(jìn)行三方比較（PCR核酸檢測(cè)、ELISA法、免疫層析試紙條）。

1.5.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)抽取同批次90條檢測(cè)試紙條，置于60.1℃烘箱中烘烤。依據(jù)阿倫尼烏斯公式設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，由其附表溫度與老化天數(shù)關(guān)系表可知，37 ℃環(huán)境下保存91 d相當(dāng)于常溫（25 ℃）下1年的穩(wěn)定性，等同于60.1 ℃環(huán)境下保存9.3 d。因此，60.1 ℃需要測(cè)試的時(shí)間間隔為第0天、第1天、第2天、第4天、第8天（約為25 ℃0 d、40 d、80 d、160 d、320 d）。每批次取出18條試紙條，測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品抗體稀釋1∶500、1∶2 000、1∶5 000 三種濃度及三個(gè)陰性血清1#、2#、3#，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行，計(jì)算其FIT/FIC均值。

1.5.7 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)確定好的實(shí)驗(yàn)條件制作試紙條，利用SARS-CoV-2N蛋白IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，編號(hào)：GBW（E）091110）稀釋不同濃度，測(cè)量其T、C線熒光值，繪制散點(diǎn)圖，推導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS（統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案）統(tǒng)計(jì)分析采集的陰性樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)，繪制散點(diǎn)圖，推算出其中離群值，去除離群值對(duì)其余數(shù)據(jù)進(jìn)行探索性分析，判斷此數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。計(jì)算第95百分位點(diǎn)，確定臨界值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 N 蛋白制備、純化及驗(yàn)證結(jié)果 圖2a峰圖顯示250 mmol/L咪唑洗脫時(shí)有蛋白峰出現(xiàn)，SDS-PAGE電泳圖顯示IPTG誘導(dǎo)后有分子量約為21 kDa的目的蛋白表達(dá)，250 mmol/L咪唑洗脫后目的條帶單一，蛋白量多，雜帶較少（圖3b）。將純化的N蛋白與試劑盒中N蛋白進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證結(jié)果顯示：橫坐標(biāo)為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不同濃度（10倍、20倍、30倍、40倍）后樣本、陰性標(biāo)準(zhǔn)品及空白孔，縱坐標(biāo)為OD值（450 nm波長(zhǎng)下吸光度），自制的N蛋白抗原包板與抗體結(jié)合，而且所測(cè)得陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果（OD值）均在14.5以上，比ELISA試劑盒中原N蛋白抗原包板檢測(cè)結(jié)果（OD值最高8.2）效果明顯，說(shuō)明純化的N蛋白滿足抗原抗體結(jié)合要求，可以應(yīng)用于免疫層析法檢測(cè)的建立。見圖3。

圖2 蛋白洗脫峰和SDS-PAGE 電泳圖Figure 2 Protein elution peak and SDS-PAGE electropherogram

圖3 N蛋白ELISA試劑盒驗(yàn)證結(jié)果圖Figure 3 Validation results of N protein ELISA kit

2.2 量子點(diǎn)的篩選結(jié)果 用4種量子點(diǎn)標(biāo)記N蛋白抗原，分別制作試紙條，檢測(cè)標(biāo)定陽(yáng)性血清，得出T、C線熒光值，對(duì)比T線熒光值大小，篩選最優(yōu)量子點(diǎn)，相同條件下，4種不同量子點(diǎn)標(biāo)記的抗原試紙條C線及T線的數(shù)值呈現(xiàn)差異，1號(hào)量子點(diǎn)微球及3號(hào)量子點(diǎn)微球的T線熒光值較高（4 424、4 665），說(shuō)明這兩種量子點(diǎn)的偶聯(lián)效率比較高。從經(jīng)濟(jì)適用效果方面考慮，最終確定3號(hào)量子點(diǎn)（BRAVEOS公司）作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料。見圖4。

圖 4 量子點(diǎn)篩選數(shù)據(jù)圖Figure 4 Data graph of quantum dots selecting

2.3 最適檢測(cè)時(shí)間的確定 加樣后8～10 min T線熒光值達(dá)到最高并趨于穩(wěn)定，由此將10 min作為反應(yīng)最佳時(shí)間。用試紙條檢測(cè)陽(yáng)性血清標(biāo)準(zhǔn)品確定最佳檢測(cè)時(shí)間，見圖5。

圖 5 T值隨時(shí)間變化曲線圖Figure 5 Curve of T value changing with time

2.4 陰、陽(yáng)性樣本血清檢測(cè)對(duì)比 檢測(cè)陰陽(yáng)性血清標(biāo)準(zhǔn)品，熒光檢測(cè)儀軟件圖顯示：陰性標(biāo)準(zhǔn)品T線位置無(wú)熒光波峰，C線位置出現(xiàn)熒光波峰；而陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品T、C線位置均出現(xiàn)波峰；紫外燈下可見陽(yáng)性血清T線、C線均出現(xiàn)紅色熒光帶，陰性血清C線出現(xiàn)紅色熒光帶、T線未出現(xiàn)條帶，見圖6。

圖 6 陰、陽(yáng)性樣本血清檢測(cè)圖Figure 6 Positive and negative serum test graph

2.5 確定檢測(cè)閾值（臨界值） 分析采集的陰性血清數(shù)據(jù)，樣本檢測(cè)結(jié)果FIT/FIC值相對(duì)集中，個(gè)別數(shù)值差別較大（圖7）。利用SPSS（統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案）軟件推算其中離群樣本，得出箱圖顯示：4號(hào)、7號(hào)為極端離群值，41號(hào)、43號(hào)、51號(hào)為離群值，去除此5個(gè)樣本，見圖8。利用SPSS（統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案）對(duì)其余數(shù)據(jù)進(jìn)行探索性檢驗(yàn)分析，得出P=0.027，可以認(rèn)為該數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，見圖9。因此應(yīng)用第95百分位數(shù)法確定其臨界值范圍為0.062，因健康人SARS-CoV-2 N蛋白IgG抗體值偏高為異常，因此選擇百分位數(shù)法計(jì)算的上側(cè)界值作為第95百分位數(shù)，為0.062，即此試紙條N蛋白IgG抗體檢測(cè)FIT/FIC臨界值為0.062［10］。即經(jīng)過(guò)熒光檢測(cè)儀測(cè)定，最終得出樣本FIT/FIC值≥0.062可判定為陽(yáng)性，＜0.062為陰性。

圖 7 樣本T/C值散點(diǎn)圖Figure 7 Sample T/C value scatter plot

圖 8 陰性樣本FIT/FIC值箱圖Figure 8 Box graph of samples' FIT/FIC values

圖 9 排除5例離群值樣本后陰性樣本FIT/FIC值正態(tài)性檢驗(yàn)直方圖Figure 9 Histogram of samples' FIT/FIC values for normality test

2.6 試紙條靈敏度與重復(fù)性驗(yàn)證 利用SARS-CoV-2抗N蛋白IgG抗體來(lái)驗(yàn)證試紙條的靈敏度。結(jié)果顯示：1∶500～1∶5 000 的標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性，1∶10 000 則為陰性。標(biāo)準(zhǔn)品為85.3 μg/g，稀釋10 000倍為8.53 ng/g，稀釋5 000倍為17.06 ng/g，故該方法的靈敏度為8.53～17.06 ng/g的SARS-CoV-2N 蛋白IgG單克隆抗體，見圖10。另抽取制備的3 批次試劑卡，檢測(cè)1∶500、1∶2 000、1∶5 000 的N 蛋白IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度平行檢測(cè)5次，進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，各濃度標(biāo)準(zhǔn)品均得出陽(yáng)性結(jié)果，且T、C線熒光值（FIT/FIC值）的變異系數(shù)（CV）≤10%，可見所研制試紙條重復(fù)性良好，見表1。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測(cè)量表Table 1 Repeatability experiment test scale

圖10 靈敏度實(shí)驗(yàn)測(cè)量數(shù)據(jù)圖Figure 10 Measurement data graph of sensitivity experiment

2.7 特異度驗(yàn)證 選取季節(jié)性冠狀病毒四種分型的IgG抗體（均購(gòu)自義翹神州公司）及支原體P1蛋白、呼吸道合胞病毒F0蛋白、麻疹病毒N蛋白和風(fēng)疹病毒E1蛋白IgG抗體驗(yàn)證試紙條的特異度，此批次試紙條檢測(cè)以上8種病原IgG抗體，其FIT/FIC值均小于臨界值0.062，結(jié)果均呈陰性，說(shuō)明試紙條特異度良好。見表2。

表2 特異度實(shí)驗(yàn)測(cè)量表Table 2 Specificity experiment test scale

2.8 方法學(xué)比較 利用本實(shí)驗(yàn)制備的試紙條與SARSCoV-2抗體檢測(cè)ELISA試劑盒（北京科衛(wèi)）同時(shí)對(duì)血清樣本進(jìn)行檢測(cè)比較，同時(shí)樣本核酸檢測(cè)結(jié)果（臨床確診）進(jìn)行三方比較（核酸檢測(cè)、ELISA法檢測(cè)、免疫層析試紙條），結(jié)果顯示：ELISA檢測(cè)法與免疫層析試紙條檢測(cè)法陽(yáng)性符合率為94.12%，陰性符合率為98.04%，總體符合率為96.47%。本研究建立的免疫層析法檢測(cè)試紙條檢測(cè)SARS-CoV-2 N蛋白IgG抗體的靈敏度為94.29%（32/35），特異度為100.00%（50/50），檢測(cè)性能良好。見表 3。

表3 N蛋白抗體試紙條、ELISA試劑盒與核酸檢測(cè)方法學(xué)對(duì)比結(jié)果Table 3 Comparison results of N protein antibody strip、ELISA kit and nucleic acid detection methods

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)抽取同批次90條檢測(cè)試紙條進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，推測(cè)保存時(shí)間，結(jié)果顯示：60.1 ℃下保存4 d（160 d，25 ℃）的試紙條檢測(cè)效能減弱，僅能測(cè)出1∶500高濃度抗體標(biāo)準(zhǔn)品，且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示C線熒光值偏低，由此推測(cè)本研究試紙條保存時(shí)限約為常溫環(huán)境中160 d。見圖11。

圖11 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)圖Figure 11 Data graph of stability experiment test

2.10 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用SARS-CoV-2 N蛋白IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品推導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，以FIT/FIC均值為縱坐標(biāo)，樣本中抗體濃度為橫坐標(biāo)做坐標(biāo)圖，得出相關(guān)曲線 y=0.039 9x+3.052 4（R2=0.981），利用熒光檢測(cè)儀測(cè)出FIT/FIC值即可在一定范圍內(nèi)初步定量檢測(cè)。見圖12。

圖 12 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 12 Standard curve graph

3 討論

免疫層析技術(shù)是一種將抗原抗體特異度反應(yīng)與色譜層析技術(shù)相結(jié)合的新型膜檢測(cè)分析方法，是目前最常用的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)（POCT）檢驗(yàn)技術(shù)。傳統(tǒng)以膠體金為標(biāo)志物的免疫層析檢測(cè)方法雖然價(jià)格低廉、檢測(cè)簡(jiǎn)便、肉眼直觀可見，但其靈敏度和特異度方面均差強(qiáng)人意。新型熒光標(biāo)記材料量子點(diǎn)具有熒光尺寸可調(diào)，發(fā)射光譜窄而對(duì)稱，高量子產(chǎn)率，寬吸收光譜，熒光強(qiáng)度高，耐光漂白和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在多聯(lián)檢測(cè)上是很有前途的納米材料［11］。本研究表達(dá)了SARS-CoV-2具有診斷意義的抗原蛋白-N蛋白，并利用量子點(diǎn)作為標(biāo)記材料標(biāo)記N蛋白，應(yīng)用免疫層析技術(shù)原理制備了SARS-CoV-2 IgG抗體檢測(cè)試紙條，能夠在10 min左右檢測(cè)出人血清中IgG抗體，與季節(jié)性冠狀病毒229E、NL63、HKU1、OC43及支原體、呼吸道合胞病毒等其他呼吸道病毒抗體無(wú)交叉反應(yīng)，重復(fù)性良好，預(yù)測(cè)其穩(wěn)定性可于常溫下（25 ℃）保存160 d。本試紙條檢測(cè)靈敏度為8.53～17.06 ng/ml，特異度為100.00%，靈敏度為94.29%。SHEN等［12］評(píng)價(jià)了膠體金免疫層析法檢測(cè)SARS-CoV-2抗體的效果，檢測(cè)97例核酸PCR法陽(yáng)性病例，膠體金法檢測(cè)出69例陽(yáng)性，靈敏度為71.1%，檢測(cè)53例核酸PCR法陰性病例，膠體金法檢測(cè)出2例陽(yáng)性，特異度為96.2%。由此可見，量子點(diǎn)免疫層析法相比膠體金性能更為優(yōu)良，其原因可能為膠體金法免疫層析通過(guò)肉眼觀察結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果捕捉率偏低，而量子點(diǎn)等熒光材料通過(guò)發(fā)射熒光可被儀器采集熒光讀取結(jié)果，結(jié)果可靠性更高。另外量子點(diǎn)更優(yōu)良的性能決定著其在免疫層析領(lǐng)域的應(yīng)用必將廣泛推廣。

同時(shí)，本課題研究具有一定的局限性，體現(xiàn)在樣本數(shù)量較少，SARS-CoV-2陽(yáng)性血清樣本有35例，且樣本血清中IgG抗體濃度未知，無(wú)法代表不同抗體濃度梯度的患者。另外，檢測(cè)時(shí)也可能因?yàn)榄h(huán)境因素或樣本血清內(nèi)其他干擾因子存在而出現(xiàn)假陽(yáng)性。利用量子點(diǎn)免疫層析法制備了SARS-CoV-2 N蛋白抗體檢測(cè)試紙條，操作簡(jiǎn)便，靈敏度及特異度高，可以應(yīng)用于POCT，進(jìn)一步結(jié)合SARS-CoV-2 S1蛋白抗體檢測(cè)，在COVID-19診斷及疫苗注射判斷中意義重大。本研究將進(jìn)一步設(shè)計(jì)研發(fā)同一試紙條不同T線檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)出抗N、S1蛋白抗體，也為下一步研究熒光材料免疫層析法多元檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

4 意義

目前SARS-CoV-2感染的大量排查主要采用核酸檢測(cè)的方法，因其靈敏度強(qiáng)而成為疑似病例確診的金標(biāo)準(zhǔn)［13］。但該技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所及人員要求高，操作繁瑣，受環(huán)境條件影響較大，容易受氣溶膠的污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性［14］。血清學(xué)改變是COVID-19患者疾病發(fā)展過(guò)程中的普遍事件，發(fā)生在感染的早期并一直持續(xù)至感染后期，甚至康復(fù)期。檢測(cè)COVID-19 患者血清中產(chǎn)生的抗體，可做到早診斷、早隔離、早治療?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案（試行第七版）》［15］首次將血清SARSCoV-2特異度抗體作為COVID-19確診的指標(biāo)之一。SARS-CoV-2包含眾多蛋白，其中N蛋白包裹病毒基因組RNA并形成螺旋狀核糖核蛋白，使其被包裝成病毒粒子［16-17］。除了病毒RNA包裝和病毒顆粒形成［8］，N蛋白已被證明通過(guò)招募RNA解旋酶DDX1來(lái)促進(jìn)RNA模板讀?。?7］，從而參與亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄。N蛋白作為高保守、抗原表位強(qiáng)的蛋白，其抗體檢測(cè)在臨床診斷中具有重要意義。

目前國(guó)內(nèi)上市的SARS-CoV-2疫苗主要包括滅活病毒疫苗（SARS-CoV-2），減毒腺病毒載體疫苗及mRNA疫苗，其中可以產(chǎn)生抗N蛋白IgG抗體的只有滅活病毒疫苗，因此，檢測(cè)抗N蛋白IgG抗體可以判斷是否接種過(guò)滅活病毒疫苗：若無(wú)疫苗接種史，則為既往感染；尤其合并檢測(cè)抗S1蛋白IgG抗體，在普查、篩查中判斷疫苗接種史及既往感染史均有重要指導(dǎo)意義。另外針對(duì)目前國(guó)外主要兩種疫苗（輝瑞mRNA疫苗、阿斯利康腺病毒疫苗）注射情況下，在國(guó)境安檢快速篩查N蛋白IgG抗體及S1蛋白IgG抗體，更有助于判斷入境人員為既往感染或疫苗接種，有利于有效開展疫情防控。

作者貢獻(xiàn)：于仁峰進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，撰寫論文；鄒大陽(yáng)、余濤、劉威進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；徐雅晴、秦日輝進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；于仁峰、莫冬冬、段佳慧參與試紙條的制作；于仁峰、鄒小倉(cāng)、賀曉明進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；于仁峰、李琳昊、王可慧進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；王可慧進(jìn)行論文的修訂；劉威負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；劉威、郭金鵬對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。