夏 鑄，蔣煒濱，夏 彪

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，重慶 400016)

近年來，越來越多的研究都表明許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病都與炎癥相關(guān)。小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)作為一種CNS內(nèi)固有的免疫細(xì)胞，可以通過其遷移、增殖及分泌的細(xì)胞因子來避免腦細(xì)胞在急性腦部炎癥病變中受到進(jìn)一步損傷。但在慢性CNS炎癥性病變中，MG會誘導(dǎo)一些自身免疫反應(yīng)，對機(jī)體產(chǎn)生不良后果。在許多炎性病程中都發(fā)現(xiàn)有MG的激活[1]，例如腦梗死、多發(fā)性硬化(MS)、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)等。

正電子發(fā)射斷層掃描(PET)是一種無創(chuàng)成像技術(shù)，能夠可視化和量化藥物在體內(nèi)的生化和藥理學(xué)過程。一種轉(zhuǎn)位蛋白(TSPO)的特異性PET顯像劑可以在活體中評估大腦中神經(jīng)炎癥(激活的MG)的狀態(tài)。11C-PK11195是第1個廣泛用于評估的TSPO 的PET顯像劑，但其低信噪比和高的非特異性結(jié)合阻礙了其進(jìn)一步應(yīng)用。一些新的TSPO特異性配體，如11C-DAA1106、18F-FEDAA1106和11C -PBR28等在嚙齒類動物大腦中顯示出良好的體內(nèi)特性[2]。DPA-714是具有高親和力的吡唑并嘧啶類的TSPO配體，目前已應(yīng)用到動物和人類的PET顯像研究中。18F-DPA-714(logP為2.44)與11C-PK11195(logP為3.35)相比，具有更好的生物利用度和更低的非特異性結(jié)合。在健康人體的研究中，18F-DPA-714在體內(nèi)的代謝穩(wěn)定性和生物分布較好，并且有效劑量(17.2 μSv/MBq)適中，表明其可能是一個對神經(jīng)炎性病變敏感、具有臨床應(yīng)用前景的PET顯像劑[3-4]。本研究旨在探索一種簡單、高效、自動化合成18F-DPA-714的方法，并對其進(jìn)行質(zhì)量控制，以期為臨床使用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 HM-10型回旋加速器和 CFN-F100多功能合成模塊(日本住友重工業(yè)株式會社)，高效液相色譜(HPLC)儀(美國Alltech公司)，201型HPLC紫外檢測器(美國 LabAlliance公司)，HPLC放射性檢測器(B-FC-3200，美國BIOSCAN公司)，H218O豐度98%(上?；ぱ芯吭?，無菌濾膜Millex(美國Millipore公司)，冷化合物19F-DPA-714標(biāo)準(zhǔn)品及藥物合成前體(北京派特生物，純度>99%)，色譜純乙腈、乙醇(美國Sigma公司)，醋酸銨(分析純，成都科龍)，Kryptofi2.2.2(K2.2.2)(德國ABX公司)，QMA柱、C18小柱(美國Waters公司)，CRC.25R活度計(jì)(美國Capintec公司)，電子天平(上海舜宇恒平)，半制備型色譜柱(YMS，AM12305-2510 WT，ODS-AM，250 mm×10 mm，S-5 μm)，分析型色譜柱(Alltima C18，250 mm×4.6 mm 5 u，美國Grace公司)，清潔級ICR小鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.218F-DPA-714的自動化合成 參考Michelle L.James的合成方法[5-6]，合成路線見圖1，采用住友CFN-F100多功能合成模塊，經(jīng)自主編輯自動化程序(圖2)。使用醫(yī)用回旋加速器60 μA束流，打靶30 min，通過核反應(yīng)18O(p，n)18F生產(chǎn)18F-，18F-傳入到多功能合成模塊中，18F-經(jīng)QMA柱捕獲18F-，用相轉(zhuǎn)移催化劑 K2.2.2/K2CO3溶液0.9 mL，將18F-從QMA柱上洗脫至反應(yīng)瓶中，通氮?dú)鈼l件下，110 ℃干燥5 min，除去水分，再次加入1 mL無水乙腈，氮?dú)鈼l件下，90 ℃干燥3 min，使18F-與K2.2.2混合物完全除去水分。將1 mL乙腈前體溶液(2～4 mg/mL)加入至反應(yīng)瓶，95 ℃密閉加熱反應(yīng)10 min，得粗產(chǎn)品冷卻后，轉(zhuǎn)移至半制備型HPLC C18反相柱(250 mm×10 mm，5 μm)，再次加入1.5 mL乙腈至反應(yīng)瓶中，將反應(yīng)瓶壁殘留物再次轉(zhuǎn)移至半制備型HPLC C18反相柱，進(jìn)行分離純化，制備型色譜分離條件為：流動相為V(乙腈)∶V(0.1 mol/L NH4OAc)=60∶40，流速4 mL/min，收集6.5 min左右的放射性產(chǎn)品峰于中間瓶，加30 mL水稀釋產(chǎn)品中的乙腈濃度，再轉(zhuǎn)移至C18小柱富集產(chǎn)品，用10 mL水沖洗C18小柱，進(jìn)一步除去乙腈，最后用1 mL乙醇洗脫產(chǎn)品，并過有機(jī)相無菌濾膜，加入生理鹽水稀釋乙醇濃度至10%以下制成可用于靜脈注射的產(chǎn)品。從18F-傳入合成模塊至獲得最終產(chǎn)品，整個過程為自動化合成，無須人工添加物料，極大地避免了藥物的輻射。

圖1 18F-DPA-714的合成路線

圖2 18F-DPA-714自動化控制程序流程圖

1.3質(zhì)量控制 物理檢查：觀察產(chǎn)品透明度和顏色，測定放射活度?；瘜W(xué)檢查：測 pH值、產(chǎn)品穩(wěn)定性和放射化學(xué)純度。采用HPLC，色譜條件為色譜柱：Alltima C18，250 mm×4.6 mm 5 u，流動相為V(乙腈)∶V(0.1 mol/L NH4OAc)=60∶40，流速1 mL/min，波長254 nm，柱溫25 ℃，放射性檢測器為BIOSCAN，B-FC-3200。分別進(jìn)樣冷化合物19F-DPA-714標(biāo)準(zhǔn)品、藥物合成前體及產(chǎn)品各10 μL，記錄保留時間。產(chǎn)品在0、2、4 h時分別進(jìn)樣測定放射化學(xué)純度，以觀察放射化學(xué)純度有無變化。

1.4比活度測定 取冷化合物19F-DPA-714標(biāo)準(zhǔn)品1.06 mg，配制成1.06 mg/mL乙腈溶液，用乙腈稀釋成以下系列濃度，分別為0.331 25、0.662 5、1.325、2.65、5.3、10.6、21.2 μg/mL，色譜條件同上，進(jìn)樣10 μL，繪制19F-DPA-714濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。18F-DPA-714產(chǎn)品進(jìn)樣10 μL，記錄產(chǎn)品紫外峰面積和放射性濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算18F-DPA-714比活度。

1.5細(xì)菌內(nèi)毒素檢測 待18F-DPA-714完全衰變至無活度后，取樣委托重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科對該藥物溶液進(jìn)行內(nèi)毒素檢查及無菌檢查。

1.6異常毒性試驗(yàn) 取小鼠5只，每只尾靜脈注射18F-DPA-714約11 MBq，觀察48 h，記錄小鼠的活動狀態(tài)及體重變化。

2 結(jié) 果

2.118F-DPA-714的自動化合成結(jié)果 利用CFN-F 100多功能合成模塊經(jīng)自主編輯自動化程序后，進(jìn)行18F-DPA-714全自動合成，整個合成過程無須人為干預(yù)，避免了操作人員的輻射危險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用親和取代標(biāo)記法，前體投入為2～4 mg，整個制備耗時約為55 min，經(jīng)半制備型HPLC純化后，放射化學(xué)純度>99%，未衰減校正的合成效率為18%～36%(n=20)，為18F-DPA-714的研究和臨床應(yīng)用提供了保障。

2.2質(zhì)量檢測結(jié)果 本品為無色透明溶液，pH值為6左右，放射化學(xué)純度>99%，18F-DPA-714在上述分析色譜條件下，保留時間為8.8 min左右，與標(biāo)準(zhǔn)品19F-DPA-714保留時間(8.2 min左右)基本一致(紫外檢查器在放射性監(jiān)測器前端，故放射峰會稍有延遲)(圖3、4)，且與前體保留時間(約11.0 min)有明顯差異(圖5)。穩(wěn)定性測試結(jié)果顯示，0、2、4 h放射化學(xué)純度均保持在98%以上，無明顯變化。

圖3 19F-DPA-714的紫外圖譜

圖4 18F-DPA-714的放射圖譜

圖5 DPA-714前體的紫外圖譜

2.3比活度 采用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品19F-DPA-714繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其公式為y=22 981x+2 048，R2=0.999 8，線性良好，經(jīng)計(jì)算結(jié)果顯示，18F-DPA-714比活度可達(dá)675 GBq/mg。比活度足夠高，可以滿足臨床使用。

2.4細(xì)菌內(nèi)毒素檢測 經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科按照《中國藥典2020年版》中方法檢測，內(nèi)毒素、無菌檢查均為陰性，符合注射液使用標(biāo)準(zhǔn)。

2.5毒性試驗(yàn) 小鼠注射18F-DPA-714后，48 h內(nèi)每只小鼠均正常生長，無異常反應(yīng)及死亡現(xiàn)象發(fā)生。

3 討 論

炎癥顯像是核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熱點(diǎn)話題，18F-FDG仍然是應(yīng)用最為廣泛的，但其為廣譜的正電子顯像劑，針對炎癥的顯像恰恰存在不足。MG在AD發(fā)病機(jī)制中的作用已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，MG激活而高表達(dá)的TSPO靶點(diǎn)也成為神經(jīng)炎性疾病顯像的研究熱點(diǎn)[7-8]。11C-PK11195作為廣泛應(yīng)用的神經(jīng)炎性病變顯像劑，雖已用于動物和臨床研究，但其半衰期短(20.3 min)和藥代動力學(xué)方面的不足限制了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。

TSPO是一種相對分子量為18×103，位于線粒體膜外的具有5個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，主要表達(dá)于合成類固醇的內(nèi)分泌器官，包括心臟、腎臟、腎上腺皮質(zhì)、睪丸或卵子[9]。在巨嚼細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，以及激活的MG等，都是呈現(xiàn)高表達(dá)水平[10-11]。TSPO最典型的功能之一是參與膽固醇從線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，這對類固醇的合成至關(guān)重要[12]。在CNS中，TSPO在神經(jīng)炎癥狀態(tài)下顯著上調(diào)，TSPO的異常過度表達(dá)是許多其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)展中的關(guān)鍵病理信號。研究發(fā)現(xiàn)，MG在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，MG在致炎因子作用下被激活成反應(yīng)性MG，產(chǎn)生大量前體炎性因子，從而導(dǎo)致神經(jīng)變性的發(fā)生[13]。正常情況下TSPO在CNS中低表達(dá)，并且局限在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞和MG)中，在發(fā)生腦損傷或炎性病變時，TSPO 表達(dá)上調(diào)。而神經(jīng)炎癥發(fā)生在AD發(fā)作前階段，是主要的驅(qū)動力。TSPO也與AD和缺血引起的梗死密切相關(guān)[14-15]。動物研究方面，有研究證實(shí)了TSPO特異性示蹤劑可以觀察到大鼠腦缺血模型中腦梗區(qū)域的放射性攝取[16]；在AD中，示蹤劑在腦內(nèi)的濃聚也發(fā)現(xiàn)與AD特異性Tau蛋白聚集部位密切相關(guān)。此外，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顯像還在動脈粥樣硬化性疾病中得到了應(yīng)用[11]。所以，用PET顯像位于MG上的TSPO，已經(jīng)成為研究CNS炎癥的重要手段，TSPO也成為PET顯像的重要靶點(diǎn)，可用于檢測與腦部疾病相關(guān)的炎癥，并監(jiān)測抗炎療法的治療反應(yīng)。

本研究采用日本住友CFN-F100多功能合成模塊，可以很好地根據(jù)需要實(shí)現(xiàn)的合成反應(yīng)進(jìn)行自主編輯自動化合成程序，實(shí)現(xiàn)自動化合成，能很好地避免放射性藥物的輻射，這對放射性藥物的制備至關(guān)重要。本研究中18F-DPA-714的合成制備主要通過親核取代反應(yīng)進(jìn)行氟化。該反應(yīng)成敗的關(guān)鍵在于18F-的干燥除水，本實(shí)驗(yàn)中采用2次加入乙腈，通氮?dú)鈼l件下，干燥除水，保證18F-在K2.2.2的作用下與前體進(jìn)行氟化。結(jié)合文獻(xiàn)中已經(jīng)有的相應(yīng)氟化反應(yīng)溫度和氟化反應(yīng)時長[5]?？紤]放射性藥物前體價格昂貴的因素，本研究主要考察了前體的用量，分別考察了1、2、4 mg前體用量下的產(chǎn)品收率，結(jié)果顯示，1 mg前體時，收率不足10%，2 mg和4 mg前體產(chǎn)品收率(22%vs.24%)相差不大，考慮藥物制備成本，故本實(shí)驗(yàn)確定采用2 mg前體用量為宜。此外，本實(shí)驗(yàn)中，前體氟化反應(yīng)結(jié)束冷卻后，無須在進(jìn)入半制備型HPLC前進(jìn)行去除18F-的預(yù)處理，直接將反應(yīng)液加入半制備型HPLC進(jìn)樣器中，增加1次1.5 mL乙腈清洗反應(yīng)器(將殘留在反應(yīng)器壁上的混合物洗出)，連同反應(yīng)液一起加入到半制備型HPLC中進(jìn)行純化分離。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品19F-DPA-714進(jìn)樣預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，該藥物的出峰時間為6.5 min，在合成純化處理中，18F-DPA-714的出峰時間與標(biāo)準(zhǔn)品相同，收集6.5 min左右的產(chǎn)品峰，加30 mL水稀釋乙腈濃度至10%以下(減少產(chǎn)品在C18小柱中的漏傳損失)，采用C18小柱進(jìn)行18F-DPA-714產(chǎn)品富集，進(jìn)一步用13 mL水沖洗C18小柱，以便除去產(chǎn)品中的乙腈，最后采用1.5 mL乙醇洗脫產(chǎn)品，過無菌濾膜后，加生理鹽水至乙醇濃度達(dá)10%以下即得最終產(chǎn)品。

經(jīng)過考察，本研究確定的色譜分析條件為色譜柱：Alltima C18，250 mm×4.6 mm 5 u，流動相為V(乙腈):V(0.1 mol/L NH4OAc)=60∶40，流速1 mL/min，波長254 nm，柱溫25 ℃，放射性檢測器為BIOSCAN，B-FC-3200。該條件下，標(biāo)準(zhǔn)品19F-DPA-714(紫外圖譜保留時間為8.2 min)和18F-DPA-714(放射圖譜保留時間為8.8 min)與前體(紫外圖譜保留時間為11.0 min)之間能很好地分開，說明該體系下系統(tǒng)適用性好。經(jīng)分析型HPLC分析，該產(chǎn)品18F-DPA-714放射化學(xué)純度>99%，比活度高達(dá)675 GBq/mg，穩(wěn)定性好，適用于動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究。該藥物logP為2.44，在親和力、信噪比、生物分布和代謝穩(wěn)定性方面都優(yōu)于11C-PK11195[3-4]，能很好地穿過血腦屏障，迅速分布到腦組織中，可應(yīng)用于腦部的神經(jīng)炎性疾病等方面的研究。

本實(shí)驗(yàn)中建立的在線自動化合成方法，成功制備出TSPO特異性顯像劑18F-DPA-714，收率穩(wěn)定，產(chǎn)量高，建立的質(zhì)量控制方法能很好地測定其放射化學(xué)純度和比活度，該方法制備的18F-DPA-714各項(xiàng)指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)。本研究為后續(xù)開展的動物研究和臨床應(yīng)用研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。