劉光宇，徐曉靜，夏科科，孫海汐，陶月如，崔 震，顧 穎

（深圳華大生命科學(xué)研究院，廣東 深圳 518083）

谷子（Setaria italica）作為1 年生的二倍體禾本科植物，主要在亞洲、非洲北部、南美洲和北美洲的干旱和半干旱地區(qū)種植，是優(yōu)質(zhì)的糧飼兼用作物[1-2]。由于谷子基因組較小、生育期短、自花授粉、種質(zhì)資源豐富、與其他主糧作物和生物質(zhì)能源草本植物關(guān)系密切，有巨大的潛力成為模式作物以更好地了解C4 植物的光合作用[3-4]。雖然在過去的20 a谷子的遺傳轉(zhuǎn)化效率較低（5.5%～9.0%），但最近高效的谷子遺傳轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)被報道，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)19.2%，這使得利用基因編輯工具進(jìn)行谷子功能基因研究和遺傳改良成為可能[5-8]。

CRISPR/Cas9 （Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）系統(tǒng)是進(jìn)行基因編輯的重要工具之一。該系統(tǒng)由gRNA（Guide RNA）引導(dǎo)Cas9 在靶位點通過識別前間隔序列鄰近基序（PAM）產(chǎn)生雙鏈DNA 斷裂，隨后通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復(fù)（HDR）機(jī)制引入基因突變[9]。NHEJ 主要通過產(chǎn)生短小的核苷酸插入或缺失造成基因突變，而HDR介導(dǎo)的基因組編輯可在目標(biāo)DNA 序列中精確引入所需的基因片段[10]。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已被廣泛有效地應(yīng)用于包括植物在內(nèi)的多種生物的靶向基因突變。將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應(yīng)用于一個新的植物物種時，首先需要針對系統(tǒng)中的表達(dá)元件，如啟動子、Cas9和gRNA 等進(jìn)行優(yōu)化。內(nèi)源性的組成型啟動子和密碼子優(yōu)化可以提高Cas9 在宿主內(nèi)的表達(dá)水平[11-16]。gRNA 表達(dá)元件呈現(xiàn)多元化，比如單一gRNA、雙gRNA 串聯(lián)和基于tRNA 的工具包等。增加gRNA 數(shù)量可以使gRNA表達(dá)元件釋放更多成熟的gRNA，增加Cas9的靶位點，進(jìn)而提高基因編輯效率或進(jìn)行多位點的同時編輯[17-20]。對Cas9 和gRNA 表達(dá)元件同時進(jìn)行優(yōu)化組合可進(jìn)一步提高基因編輯效率。這些高效的基因編輯工具被用于植物育種以提高新品種的培育效率[10，21]。

植物原生質(zhì)體可用于快速評估基因編輯工具的效率，進(jìn)而對基因編輯工具進(jìn)行優(yōu)化[22-24]。植物原生質(zhì)體易于獲得，并且基因編輯工具可通過聚乙二醇（PEG）快速導(dǎo)入原生質(zhì)體中，試驗在7 d內(nèi)可以完成?；蚓庉嫻ぞ咄ㄟ^植物組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化周期至少在3個月以上，獲得再生植株后還需要進(jìn)行大量的篩選工作。因此，基于原生質(zhì)體的方法優(yōu)化CRIPSR/Cas9系統(tǒng)比基于組織培養(yǎng)的方法更高效。另外，核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物也可以通過PEG 介導(dǎo)傳遞到植物原生質(zhì)體中，在不引入外源DNA 的情況下誘導(dǎo)靶點突變[25-27]。這種突變區(qū)別于轉(zhuǎn)基因作物的突變機(jī)制，有助于提高公眾對基因編輯作物的接受度。

為了檢測轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)的突變頻率，需要提取原生質(zhì)體DNA 并對靶向序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，隨后可以用2 種簡單的方法來評估擴(kuò)增產(chǎn)物：DNA 酶分析法和大規(guī)模平行測序法。DNA 酶分析法依賴酶消化產(chǎn)物的凝膠圖像密度來粗略估計誘變效率，包括限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、切割擴(kuò)增多態(tài)性序列分析和T7 核酸內(nèi)切酶Ⅰ（T7EⅠ）分析[28]。但由于限制性內(nèi)切酶切割不完全或PCR 擴(kuò)增錯誤等原因，很難在靶點檢測到低效率的突變，并且容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，而大規(guī)模平行測序法可以通過計算突變序列的百分比來避免這些問題[29-30]。

目前，在谷子中學(xué)者們對一些簡單的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)行了測試[22-23]。LIN 等[22]設(shè)計了一種單一RNA的基因編輯工具，將其轉(zhuǎn)入谷子原生質(zhì)體中，通過DNA酶分析法測得其對八氫番茄紅素脫氫酶基因（PDS）靶點的編輯效率為10.2%。CHENG等[23]設(shè)計了雙gRNA 系統(tǒng)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入谷子愈傷組織中，在65 個再生植株中檢測到26個編輯事件。但是，高效的基因組編輯工具仍需要開發(fā)和優(yōu)化。因此，針對谷子內(nèi)源化Cas9表達(dá)元件，設(shè)計了多種gRNA 表達(dá)元件與其組合構(gòu)建了多種CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)，將它們轉(zhuǎn)入谷子原生質(zhì)體中，通過大規(guī)模平行測序技術(shù)分析SiPDS基因的突變頻率來評估這些基因編輯系統(tǒng)的編輯效率，從而快速篩選出基于tRNA 的高效基因編輯工具，并驗證RNP 復(fù)合物在谷子中進(jìn)行基因編輯的有效性。這種基于原生質(zhì)體的篩選系統(tǒng)可用于評估和優(yōu)化谷子基因組編輯工具，有助于加速谷子的基因功能研究和遺傳改良進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及其培養(yǎng)

供試谷子品種為豫谷1 號，將其成熟種子置于30 ℃烘箱中48 h 打破休眠，隨后浸泡于5% H2O2溶液中16 h 以提高種子萌發(fā)率，然后用75%乙醇消毒1 min，2.5%次氯酸鈉表面消毒10 min。消毒完成后，挑選飽滿健康的種子平鋪于培養(yǎng)皿中的濾紙上，加入適量的蒸餾水，置于28 ℃培養(yǎng)箱中，光照條件下培養(yǎng)2 d，再轉(zhuǎn)入黑暗條件下培養(yǎng)5 d，隨后收獲黃化苗用于谷子原生質(zhì)體的制備[31-32]。

1.2 載體構(gòu)建

從Phytozome 數(shù)據(jù)庫獲取谷子（Setaria italicv2.2）參考基因組序列，通過BLAST 獲得谷子PDS基因序列，并進(jìn)一步通過Sanger 測序確認(rèn)該基因在豫谷1號中的序列信息。利用CRISPR-GE（http://skl.scau.edu.cn/）設(shè)計6 個gRNA 用以靶向SiPDS基因保守結(jié)構(gòu)域，序列和位置信息見圖1。根據(jù)谷子密碼子偏好優(yōu)化Cas9序列并在序列首尾加入2 個核定位信號（NLS）。所有核苷酸序列通過BGI-Write 平臺合成。

圖1 設(shè)計的gRNA序列和靶向SiPDS的位置Fig.1 Designed gRNAs sequences and targeting sites in SiPDS

首先，以pCAMBIA1300 載體為骨架整合Super啟動子（SP）或谷子內(nèi)源的泛素啟動子（Ubi）驅(qū)動的綠色熒光蛋白基因（GFP），構(gòu)建報告質(zhì)粒SP-GFP和Ubi-GFP以指示原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化效率。然后，同樣以pCAMBIA1300 載體為骨架整合SP 或Ubi 啟動子驅(qū)動的Cas9 表達(dá)元件，構(gòu)建中間載體SP-Cas9和Ubi-Cas9以進(jìn)一步構(gòu)建多種基因編輯系統(tǒng)。合成的單一gRNA、雙gRNA 和基于tRNA 結(jié)構(gòu)并包含4個gRNA 的表達(dá)元件由水稻（Oryza sativa）U6 啟動子驅(qū)動，并通過多克隆位點區(qū)域的限制性內(nèi)切酶BsaⅠ的2 個位點將其分別導(dǎo)入SP-Cas9或Ubi-Cas9中間載體，構(gòu)建SP-gRNA1、Ubi-gRNA1、UbigRNA3、Ubi-dgRNAE1、Ubi-dgRNAE12、Ubi-tRNA質(zhì)粒（圖2）。SP-gRNA1 和Ubi-gRNA1 用以篩選在谷子中更適合驅(qū)動Cas9的啟動子。Ubi-gRNA1、Ubi-gRNA3、Ubi-dgRNAE1、Ubi-dgRNAE12 和UbitRNA 用以優(yōu)化gRNA 表達(dá)元件，從而篩選高效的CRIPSR/Cas9基因編輯系統(tǒng)。

圖2 構(gòu)建的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)Fig.2 The constructed CRISPR/Cas9 gene editing systems

1.3 RNP復(fù)合物制備和體外切割活性分析

用MEGAshortscript?T7 轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，AM1354）進(jìn)行g(shù)RNA 體外轉(zhuǎn)錄。參考LIANG 等[33]的方法在Cas9 反應(yīng)緩沖液中將1 μg gRNA3、gRNA4和gRNA5 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別與1 μg Cas9（NEB，M0386S）混合并在室溫下靜置10 min 制備RNP 復(fù)合物。根據(jù)SiPDS基因靶位點附近的序列設(shè)計1 對引物，引物序列為5′-CCTGCAAGGTACCAACTTGA-3′和5′-GGTGCTTTTATGTGCAACCAGG-3′，通過PCR擴(kuò)增獲得667 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物。將此擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，添加制備好的RNP 復(fù)合物，37 ℃下共培養(yǎng)2 h。取20 μL反應(yīng)液在1.5%的瓊脂糖凝膠中于120 V電壓下電泳20 min，然后通過觀察凝膠圖像檢測Cas9的切割活性，以篩選高效的RNP復(fù)合物。

1.4 原生質(zhì)體的制備和瞬時轉(zhuǎn)化

原生質(zhì)體分離和轉(zhuǎn)化采用PEG 介導(dǎo)的改良方法進(jìn)行[32]。用刀片將黃化苗的幼莖切成0.5～1.0 mm 的小段，隨后放入裝有15 g/L 纖維素酶‘Onozuka’R-10（Yakult Pharmaceutical）、7.5 g/L 離析酶R-10（Yakult Pharmaceutical）、10 mmol/L 嗎啉乙磺酸（MES，pH 值5.7，Sigma，M3671）、10 mmol/L CaCl2（Sigma，C5670）、0.4 mol/L D-甘露醇（Sigma，M1902）和0.1% 牛血清白蛋白（BSA，Sigma，V900933）溶液的三角瓶中。三角瓶包裹錫紙后放入搖床中，60 r/min 培養(yǎng)約5 h 進(jìn)行酶解反應(yīng)。反應(yīng)完成后組織懸浮液通過孔徑40 μm 的過濾器去除酶解溶液和組織碎片，用W5 緩沖液[154 mmol/L NaCl（Sigma，S5886）、5 mmol/L KCl（Sigma，P5405）、125 mmol/L CaCl2和2 mmol/L MES（pH 值5.7）]清洗2 次。將清洗后的混合溶液以100×g轉(zhuǎn)速緩慢離心5 min，收集原生質(zhì)體，隨后用W5 緩沖液再洗滌原生質(zhì)體2次，并在MMG 溶液（0.4 mmol/L D-甘露醇、15 mmol/L MgCl2和4.0 mmol/L MES，pH 值5.7）中重懸原生質(zhì)體，顯微鏡下用血細(xì)胞儀計數(shù)，然后將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×106個/mL。

質(zhì)粒（10 μg）和體外切割活性較高的RNP 復(fù)合物（20 μg Cas9 和20 μg gRNA）分別與細(xì)胞濃度為2×106個/mL 的原生質(zhì)體在新鮮配制的400 g/L PEG溶液中暗置20 min。除去上清液后重懸于1 mL W5緩沖液中，室溫暗置培養(yǎng)48 h。

1.5 大規(guī)模平行測序

提取室溫暗置培養(yǎng)48 h 的原生質(zhì)體DNA，并設(shè)計引物（表1）擴(kuò)增含有SiPDS基因靶位點的DNA 序列。使用MGIEasy AmpSeq 建庫試劑盒構(gòu)建測序文庫。用BGISEQ-500測序儀對文庫進(jìn)行大規(guī)模平行測序。

表1 測序文庫構(gòu)建所用引物信息Tab.1 Primers used for construction of sequencing library

測序read 中的突變有4 種類型，包括缺失、插入、替換和混合（替換加缺失、替換加插入等復(fù)雜類型）。每種類型的總突變效率通過突變的read 總數(shù)除以總read 數(shù)來估計。為了盡量減少擴(kuò)增子測序錯誤引起的問題，測序數(shù)據(jù)中只發(fā)生一次的突變read 不計算在內(nèi)[31]。每個CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的誘變效率由每個gRNA 序列區(qū)域內(nèi)所有突變類型的總突變效率決定。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效谷子原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立

為了建立高效的谷子原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，利用PEG 介導(dǎo)法將SP-GFP和Ubi-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入來源于7 d 黃化苗幼莖的原生質(zhì)體中。質(zhì)粒中的GFP基因表達(dá)的產(chǎn)物受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時會發(fā)射綠色熒光（圖3a）。通過顯微觀察和統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，SP-GFP和Ubi-GFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率為50.44%和57.36%（圖3b），這與之前報道的高效谷子原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化效率相近[22，34]。

圖3 SP和Ubi驅(qū)動GFP基因在谷子原生質(zhì)體中的瞬時表達(dá)Fig.3 The transient expression of GFP driven by SP and Ubi promoters in S.italica protoplasts

2.2 谷子原生質(zhì)體中多種CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的優(yōu)化

為了篩選更適合驅(qū)動Cas9基因表達(dá)的啟動子，構(gòu)建了SP-gRNA1 和Ubi-gRNA1 質(zhì)粒并檢測它們在谷子原生質(zhì)體中對SiPDS基因的編輯效率。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)SP-gRNA1 質(zhì)粒的谷子原生質(zhì)體的基因突變頻率為0.5%，而轉(zhuǎn)Ubi-gRNA1 質(zhì)粒的谷子原生質(zhì)體的基因突變頻率為5.5%（圖4），說明在谷子原生質(zhì)體中內(nèi)源性Ubi 啟動子比SP 啟動子更適合驅(qū)動Cas9基因的表達(dá)。因此，在后續(xù)試驗中選擇Ubi啟動子來驅(qū)動Cas9基因的表達(dá)。

圖4 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)對SiPDS基因的突變頻率Fig.4 Mutation efficiency of SiPDS gene induced by CRISPR/Cas9 gene editing systems

為了研究多元化gRNA 表達(dá)元件對提高基因突變效率的作用，設(shè)計了雙gRNA系統(tǒng)，并構(gòu)建了UbidgRNAE1 和Ubi-dgRNAE12 質(zhì)粒。與單一gRNA 系統(tǒng)Ubi-gRNA1 相比，Ubi-dgRNAE1 對SiPDS基因第一外顯子靶點的基因突變頻率增加了1.66 倍，為14.56%（圖4）。靶向SiPDS基因第12 外顯子的雙gRNA 系統(tǒng)Ubi-dgRNAE12 比單一gRNA 系統(tǒng)UbigRNA3 的基因突變頻率提高了1.11 倍，為15.71%（圖4）。這些結(jié)果表明，額外添加1 個gRNA 可以提高CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)對SiPDS基因的突變效率。

為了進(jìn)一步提高靶向基因的突變效率，利用tRNA 結(jié)構(gòu)優(yōu)化gRNA 表達(dá)元件并構(gòu)建了包含4 個gRNA 的Ubi-tRNA 質(zhì)粒。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)Ubi-tRNA質(zhì)粒的谷子原生質(zhì)體的SiPDS基因突變頻率提升至51.24%，相較于轉(zhuǎn)Ubi-gRNA3 和Ubi-dgRNAE12 質(zhì)粒的谷子原生質(zhì)體分別增加了5.87 倍和2.26 倍（圖4）。綜上，利用tRNA 系統(tǒng)組裝多個gRNA 可以進(jìn)一步提高CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)對SiPDS基因的突變效率。

2.3 谷子原生質(zhì)體中SiPDS基因多個靶位點同時編輯的實現(xiàn)

為了進(jìn)一步調(diào)查多元化gRNA 基因編輯系統(tǒng)誘導(dǎo)SiPDS基因的多位點突變效率，本研究統(tǒng)計了Ubi-dgRNAE1、Ubi-dgRNAE12、Ubi-tRNA 系統(tǒng)在單一靶位點和多個靶位點同時發(fā)生編輯事件的頻率。結(jié)果（表2）表明，Ubi-dgRNAE1 在單一靶位點的突變頻率為14.42%，而同時編輯2 個靶位點的突變頻率僅為0.14%。在轉(zhuǎn)Ubi-dgRNAE12 谷子原生質(zhì)體中，也發(fā)現(xiàn)同時編輯SiPDS基因2 個靶位點的突變頻率極低。上述結(jié)果表明，利用雙gRNA 系統(tǒng)同時編輯SiPDS基因2 個靶位點的效率極低。轉(zhuǎn)Ubi-tRNA 谷子原生質(zhì)體中SiPDS基因單一靶位點的突變頻率為48.00%，同時編輯2、3 個靶位點的突變頻率分別為2.99%、0.24%，分別占總突變頻率的5.83%、0.47%。這些結(jié)果證實了tRNA 結(jié)構(gòu)可以有效提高基因編輯系統(tǒng)同時靶向SiPDS基因多個位點的突變效率，而雙gRNA 串聯(lián)結(jié)構(gòu)對提高多位點編輯效率的作用不明顯。

表2 谷子原生質(zhì)體中CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)同時靶向SiPDS基因多個位點的突變頻率Tab.2 Mutation frequency of targeting multiple sites by CRISPR/Cas9 gene editing systems in S.italica protoplasts

2.4 RNP復(fù)合物在谷子原生質(zhì)體中編輯SiPDS基因的有效性分析

為了篩選高效的RNP 復(fù)合物，選取gRNA3、gRNA4、gRNA5 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物分別與Cas9蛋白混合制備RNP 復(fù)合物。用RNP-gRNA3、RNPgRNA4 和RNP-gRNA5 復(fù)合物對SiPDS基因靶點擴(kuò)增的DNA序列進(jìn)行體外切割活性檢測，凝膠圖像顯示RNP-gRNA5 復(fù)合物體外切割活性高于RNPgRNA3和RNP-gRNA4復(fù)合物（圖5a）。根據(jù)此結(jié)果將RNP-gRNA5 復(fù)合物轉(zhuǎn)入谷子原生質(zhì)體后進(jìn)行大規(guī)模平行測序以評估其引起SiPDS基因突變的效率。結(jié)果表明，RNP-gRNA5復(fù)合物引起SiPDS基因的突變頻率為2.0%（圖5b）。

為了進(jìn)一步研究RNP-gRNA5 復(fù)合物誘導(dǎo)的SiPDS基因靶點突變類型，對突變譜進(jìn)行了分析，包括1、2、3 及以上堿基對（bp）缺失、插入和其他（替換、替換加缺失、替換加插入等）突變類型。統(tǒng)計結(jié)果（圖5c）顯示，缺失突變類型在總突變類型中的占比高達(dá)98.33%。其中，1、2、3 bp 缺失突變類型分別占35.41%、35.30%、24.76%，3 bp以上缺失突變類型占比下降至2.86%。插入和其他突變類型在總突變類型中的占比不超過2%。上述結(jié)果表明，RNPgRNA5 復(fù)合物誘導(dǎo)的SiPDS基因突變類型主要為小片段（1～3 bp）的缺失。

圖5 RNP復(fù)合物在谷子原生質(zhì)體中編輯SiPDS基因的有效性分析Fig.5 Efficiency of RNP complexes editing SiPDS gene in S.italica protoplasts

3 結(jié)論與討論

谷子穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化可以實現(xiàn)編輯位點在后代植株中的穩(wěn)定遺傳，但需要組織培養(yǎng)、載體傳遞和植株再生等較煩瑣的過程，對于基因編輯工具的篩選和優(yōu)化既費時又費力。相對而言，谷子原生質(zhì)體更容易獲得，轉(zhuǎn)化容易，試驗周期較短，已用于突變檢測[22]、再生[35]和蛋白質(zhì)互作[36]等研究中。與前人[22，34-36]研究結(jié)果相比，本研究采用生長7 d 的黃化苗制備谷子原生質(zhì)體，從時間上更早，并且轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到同樣的高效水平。此外，大規(guī)模平行測序可以在短時間內(nèi)以較低的人工成本實現(xiàn)高通量突變檢測和分析，并且可以提供比傳統(tǒng)DNA酶分析法更準(zhǔn)確的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。因此，基于谷子原生質(zhì)體的大規(guī)模平行測序系統(tǒng)可以作為一種簡便有效的方法對基因編輯工具進(jìn)行快速篩選和優(yōu)化，在穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化前即可篩選到高效的基因編輯工具。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在谷子中的應(yīng)用相對比較簡單，目前只有包含單一或2 個gRNA 的基因編輯工具被報道，并且其基因突變效率不高[22-23]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中更多的組件需要測試和優(yōu)化以開發(fā)更高效的基因編輯工具。優(yōu)化Cas9基因的密碼子以適應(yīng)寄主植物已成為共識。許多研究用內(nèi)源性Cas9 啟動子提高CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基因突變效率[13-16]。本研究利用開發(fā)的原生質(zhì)體系統(tǒng)證明谷子內(nèi)源性Ubi 啟動子可以提高CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)對SiPDS基因的突變效率，也可以進(jìn)一步應(yīng)用本研究開發(fā)的這套系統(tǒng)快速篩選更高效的啟動子及其他元件。

多元化的gRNA 表達(dá)元件可以釋放出更多成熟的gRNA，以靶向多個位點從而提高編輯效率。2個gRNA串聯(lián)的表達(dá)元件可以提高Cas9在胡蘿卜細(xì)胞中的靶向概率[18]，相似的表達(dá)元件被用來靶向獼猴桃PDS基因的2 個不同外顯子以確?；蚯贸齕19]。本研究結(jié)果表明，與單一gRNA 導(dǎo)向的基因編輯系統(tǒng)相比，2 個gRNA 串聯(lián)的基因編輯系統(tǒng)UbidgRNAE1 和Ubi-dgRNAE12 的總突變頻率提高，但是同時編輯2 個靶位點的的突變頻率還是極低，說明在CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中串聯(lián)2 個gRNA 的表達(dá)元件對同時編輯2 個靶位點效率的提升并不明顯，在最近報道的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[23]。進(jìn)一步利用tRNA 結(jié)構(gòu)優(yōu)化CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，構(gòu)建的Ubi-tRNA 質(zhì)粒不僅具有較高的總誘變頻率，而且增強(qiáng)了多重基因組編輯能力。這些結(jié)果表明，基于tRNA 的CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)可以高效地引起目標(biāo)基因突變，提高誘變效率。未來將其應(yīng)用于谷子的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化可能產(chǎn)生更多的突變植株，甚至可以進(jìn)行多基因編輯以達(dá)到更高的育種目標(biāo)。

通過RNP 復(fù)合物進(jìn)行基因組編輯提供了一種在植物中無外源DNA 引入和低脫靶編輯的方法[10]。在作物中應(yīng)用RNP 復(fù)合物引起的編輯效率并不高，介于2.4%～9.7%，但在萵苣中卻異常地高達(dá)46%[25-27]。本研究結(jié)果表明，RNP 復(fù)合物RNPgRNA5 在谷子原生質(zhì)體中的誘變效率為2.0%。這種相對較低的誘變效率可能是由于RNP-gRNA5 的轉(zhuǎn)化效率較低或者是選取的gRNA 活性不高。不過這些問題可以通過使用本研究開發(fā)的原生質(zhì)體系統(tǒng)進(jìn)一步篩選優(yōu)化更多的RNP 復(fù)合物來解決。盡管RNP 復(fù)合物引起的基因突變效率不高，但由于該方法簡便、快速、可操作性強(qiáng)，對于大多數(shù)研究來說仍然是可以接受的[26]。此外，RNP 復(fù)合物可在不引入外源DNA 的情況下對目標(biāo)基因進(jìn)行編輯。RNP復(fù)合物有巨大的潛力成為重要的基因編輯工具。