尚付梅 任中海 萬里新 張敬偉 李長(zhǎng)生 馬慧利 張蕾 冀葉 袁小筍 劉紅利

結(jié)直腸癌是全球第三大常見的惡性腫瘤，每年約860 000例患者死于該病，在中國(guó)，結(jié)直腸癌已成為惡性腫瘤相關(guān)死亡率的第五大誘因，其發(fā)病率預(yù)計(jì)將會(huì)繼續(xù)增長(zhǎng)[1]。PIK3CA是結(jié)直腸癌中最常見的突變癌基因之一。據(jù)報(bào)道，約有15%～20%的結(jié)直腸癌患者攜帶PIK3CA突變[2]。近年來，越來越多的研究報(bào)道腸道菌群與慢性肝病、腸易激綜合征、炎癥性腸病、結(jié)直腸癌等一系列疾病密切相關(guān)[3-4]。腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)及多樣性變化對(duì)多系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展起重要作用。目前，尚缺乏報(bào)道PIK3CA突變型與野生型結(jié)直腸癌患者之間的腸道菌群結(jié)構(gòu)。因此，本研究采用16s DNA 高通量測(cè)序技術(shù)，分析PIK3CA不同基因型結(jié)直腸癌患者之間的腸道菌群結(jié)構(gòu)，揭示PIK3CA基因狀態(tài)與結(jié)直腸癌患者腸道菌群的關(guān)系，為探究腸道菌群對(duì)PIK3CA基因狀態(tài)的影響提供潛在的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年12月至2017年12月華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院飲食結(jié)構(gòu)相似的局部可切除且結(jié)直腸癌患者19例，收集所有患者手術(shù)切除的腫瘤黏膜組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ARMS）技術(shù)檢測(cè)PIK3CA的表達(dá)狀態(tài)，根據(jù)PIK3CA檢測(cè)結(jié)果分為兩組：PIK3CA突變型組（n=4），PIK3CA野生型組（n=15）。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）飲食結(jié)構(gòu)相似，無特殊飲食習(xí)慣；2）局部可手術(shù)切除的原發(fā)結(jié)直腸癌患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）其它部位惡性腫瘤病史患者；2）繼發(fā)結(jié)直腸癌患者；3）多部位原發(fā)結(jié)直腸癌患者；4）術(shù)前6天行腸道準(zhǔn)備；5）術(shù)前3個(gè)月使用過抗生素；6）術(shù)前行新輔助放療或化療；7）存在其它胃腸道系統(tǒng)性疾??；8）術(shù)前2周內(nèi)使用過益生菌或益生元；9）存在代謝性或感染性疾病。入組患者的PIK3CA突變型率為21.05%；平均年齡為（62.68±13.31）歲。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有患者簽署知情同意書后接受結(jié)直腸癌腫瘤切除術(shù)，并留取腫瘤組織活檢標(biāo)本，迅速置入無菌試劑盒中，并用冰盒將其轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，再迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行，避免環(huán)境細(xì)菌污染及交叉污染。

1.2.2 基因組 DNA 提取及PCR擴(kuò)增 采用Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Omega 公司），提取所有患者的基因組DNA，并使用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度及濃度。使用PCR擴(kuò)增儀（購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌的16S rDNA V3V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其上、下游引物序列分別為：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

1.2.3 測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)高通量測(cè)序 采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 試劑盒構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)，并在 Illumina MiSeq PE 250（購(gòu)自美國(guó)Illumina公司）平臺(tái)上執(zhí)行2×300 bp的雙端、高通量測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 使用QIIME軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、過濾及質(zhì)量評(píng)估，得到有效的測(cè)序數(shù)據(jù)。使用usearch軟件，通過UPARSE-OTU algorithm，對(duì)獲得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，以97%的序列相似性進(jìn)行分類單元（OTUs）聚類，然后對(duì)OTUs 的代表序列進(jìn)行物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況?；騉TU豐度矩陣，采用R軟件計(jì)算各組所共有和特有的OTU數(shù)量，繪制Venn圖。根據(jù)OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果，用 R軟件分析比較不同分組在不同分類水平上的組成和豐度分布。通過主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)群落數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行自然分解并通過對(duì)樣本排序，從而觀測(cè)樣本之間的差異。 Metastats分析是基于群落豐度采用Mothur 軟件分析樣本（組）間分類學(xué)組成差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法，對(duì)各個(gè)分類單元在樣本（組）之間的豐度差異進(jìn)行兩兩比較檢驗(yàn)。使用Mothur軟件，計(jì)算豐度位于前50位的優(yōu)勢(shì)屬之間的Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)，構(gòu)建優(yōu)勢(shì)微生物類群的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Chi-Square檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、Fisher 精確檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較分析，采用R軟件統(tǒng)計(jì)作圖。對(duì)于α多樣性指數(shù)（Chao1、ACE、Shannon和Simpson）使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較各組樣本微生物多樣性差異。使用變異的多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）來評(píng)估兩組之間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 16S rDNA高通量測(cè)序結(jié)果

本研究通過對(duì)PIK3CA野生型與突變型結(jié)直腸癌組織中16S rDNA 基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，共獲得高質(zhì)量的優(yōu)化序列共251 211 911條，每個(gè)樣品中的平均序列數(shù)為39 004條，平均序列長(zhǎng)度為429 bp，且這些序列長(zhǎng)度主要集中在400 bp 以上，本研究的測(cè)序深度基本趨于飽和狀態(tài)。

本研究通過UCLUST序列比對(duì)方法對(duì)OTU進(jìn)行聚類分析，以97%的序列相似度作為OTU劃分閾值，并將每個(gè)OTU中豐度最高的序列定義為該OTU的代表序列，分析每個(gè)樣本在各分類水平上（phylum，class，order，family，genus，species）的微生物群落鑒定結(jié)果。根據(jù)OTU豐度矩陣，計(jì)算各組所共有和特有的OTU數(shù)量，即 Venn圖（圖1A），有190個(gè)OTU在PIK3CA野生型與突變型腫瘤組織中是共有的，有88個(gè)OTU在PIK3CA突變型結(jié)直腸癌腫瘤組織中特有（圖1A）。

2.2 PIK3CA突變型與野生型分組之間的菌群組成結(jié)構(gòu)

根據(jù)OTU分類結(jié)果，對(duì)PIK3CA突變型與野生型之間的菌群組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，在門（phylum）水平上，PIK3CA突變型與野生型腫瘤組織中的優(yōu)勢(shì)菌門主要均由變形菌門（Proteobacteria）、棲熱菌門（Thermi）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，占總?cè)郝涞?8%以上，其中占比最高的是變形菌門，占比70%以上（圖1B）。

圖1 PIK3CA突變型與野生型分組

2.3 PIK3CA突變型與野生型分組之間的Alpha多樣性分析

Alpha多樣性反映微生物群落的豐富度和均勻度，常用的度量Alpha多樣性的度量標(biāo)準(zhǔn)包括：ACE指數(shù)，Chao1指數(shù)，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)。Chao1或ACE指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高；Shannon指數(shù)則綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，Shannon指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高。Shannon指數(shù)對(duì)群落的豐富度以及稀有OTU更敏感，Simpson指數(shù)值越高，表明群落多樣性越高。本研究采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較了PIK3CA突變型與野生型之間微生物菌群多樣性差異，研究結(jié)果顯示ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在PIK3CA突變型的結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中明顯高于PIK3CA野生型（圖1C，均P＜0.001），說明PIK3CA突變型與PIK3CA野生型的結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的菌群多樣性有顯著性差異，揭示了PIK3CA基因表達(dá)狀態(tài)可能與結(jié)直腸癌腫瘤局部微環(huán)境的菌群多樣性密切相關(guān)。

2.4 PIK3CA突變型與野生型之間的Beta多樣性分析

Beta多樣性分析主要考察不同樣本之間群落結(jié)構(gòu)的差異性。通過PCA分析反映不同分組之間的群落組成差異。本研究采用PCA分析比較了結(jié)直腸癌腫瘤組織中PIK3CA突變型與野生型之間的菌群結(jié)構(gòu)差異，使用PERMANOVA分析兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系，結(jié)果顯示PIK3CA突變型與野生型的結(jié)直腸癌腫瘤組織中的菌群結(jié)構(gòu)有顯著性差異（圖2，P=0.004）。

圖2 PIK3CA突變型與野生型分組之間菌群結(jié)構(gòu)的PCA分析

2.5 PIK3CA突變型與野生型之間的Metastats分析

本研究采用Metastats分析比較了結(jié)直腸癌腫瘤組織中PIK3CA突變型與野生型之間的微生物群落組成差異。Metastats結(jié)果顯示，在門水平上，有5種菌門存在顯著差異，其中厚壁菌門（Firmicutes），裝甲菌門（Armatimonadetes），放線菌門（Actinobacteria）及擬桿菌門（Bacteroidetes）4種菌門在PIK3CA突變型腸癌患者腫瘤組織中明顯富集，而變形菌門（Proteobacteria）在PIK3CA野生型患者中明顯富集（圖3，P＜0.01）。在屬（genus）水平上，有29種菌屬有顯著性差異（本研究中僅列出差異最顯著的前20個(gè)分類單元），其中包含Allobaculum，擬無枝酸菌（Amycolatopsis）及厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus）在內(nèi)的18種菌屬在PIK3CA突變型患者腫瘤組織明顯富集，而不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）在PIK3CA野生型患者中明顯富集（圖4，P＜0.01）。

圖3 門水平上，PIK3CA突變型與野生型結(jié)直腸癌腫瘤組織之間的菌門豐度分布

圖4 屬水平上，PIK3CA突變型與野生型結(jié)直腸癌腫瘤組織之間的菌屬豐度分布

2.6 PIK3CA突變型與野生型分組之間的Spearman關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析

Spearman關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析根本目的是考察不同群落成員之間的相互作用，通過關(guān)聯(lián)分析的方法，找尋群落成員在不同生境下共同出現(xiàn)或彼此排斥的相互作用模式，從而推斷不同微生物類群之間可能的相互“協(xié)作”或“競(jìng)爭(zhēng)”關(guān)系。根據(jù)OTU或各分類單元在不同樣本中的豐度分布，可以尋找彼此之間呈現(xiàn)正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的微生物類群，進(jìn)而構(gòu)建優(yōu)勢(shì)微生物類群的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，探索其彼此相關(guān)的生態(tài)學(xué)意義。如圖5所示，紅線表明正相關(guān)，綠線表明負(fù)相關(guān)。通過某節(jié)點(diǎn)的連接越多，表明該屬與菌群中其它成員的關(guān)聯(lián)越多。在PIK3CA野生型結(jié)直腸癌腫瘤組織中，本研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）與假單胞菌（Pseudomonas）呈正相關(guān)（圖5A）。在PIK3CA突變型的結(jié)直腸癌腫瘤組織中，擬桿菌屬（Bacteroides）與嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus）、蛭弧菌（Bdellovibrio）、棒桿菌屬（Corynebacterium）呈正相關(guān)（圖5B）。

圖5 PIK3CA突變型與野生型結(jié)直腸癌腫瘤組織之間的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者PIK3CA突變型與野生型中的腫瘤組織微生物菌群，無論是Alpha多樣性，還是Beta多樣性均有顯著性差異，首次揭示了不同PIK3CA基因狀態(tài)下結(jié)直腸癌患者腸道菌群組成結(jié)構(gòu)不同。

近期有研究報(bào)道了腸道菌群與結(jié)直腸癌患者的發(fā)生及不良預(yù)后相關(guān)[5]。產(chǎn)腸毒素脆弱類桿菌（Bacteroides fragilis）是Bacteroidetes成員中的一種常見的人類共生菌。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Bacteroides fragilis通過激活STAT3的表達(dá)，分泌促炎性細(xì)胞因子 IL-17，進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌的發(fā)生[6]。在人體實(shí)驗(yàn)中，有研究發(fā)現(xiàn)，Bacteroides fragilis在結(jié)直腸癌患者黏膜組織中明顯富集[7]，并且與其較晚的臨床分期顯著相關(guān)，說明腸黏膜中Bacteroides fragilis的豐度越高，其臨床預(yù)后越差[8]。此外，Viljoen 等[7]也發(fā)現(xiàn)Bacteroides fragilis與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，在人類結(jié)直腸癌的原發(fā)腫瘤部位中可檢出Bacteroides，同樣在腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位中亦可檢出同樣的微生物菌，說明Bacteroides在腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移瘤中保持了微生物組的穩(wěn)定性，揭示了Bacteroides在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要地位[9]。本研究發(fā)現(xiàn)Bacteroidetes在PIK3CA突變型腸癌患者腫瘤組織明顯富集，在PIK3CA野生型患者中并未觀察到Bacteroidetes的增多，推測(cè)腸道菌群中高豐度的Bacteroidetes是否促進(jìn)了PIK3CA突變，進(jìn)而影響了結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后，這有待于在未來的研究中進(jìn)一步揭示。

眾所周知，PIK3CA編碼Ⅰ類磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylino-sitol 3-kinases，PI3Ks）的p110催化亞單位。目前對(duì)PI3Ks的研究主要集中在Ⅰ型。Ⅰ型由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成的，活化的RTKs與調(diào)節(jié)亞基結(jié)合后使催化亞基到達(dá)細(xì)胞膜，活化Ⅰ型PI3Ks，激活PI3K-AKT-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響細(xì)胞的增殖、分化，進(jìn)而導(dǎo)致人類各種惡性腫瘤的發(fā)生[10]，比如在乳腺癌，膀胱癌和結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中可觀察到PIK3CA的高突變頻率[11]。PIK3CA突變不僅可以減少細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可以促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)、提高其下游激酶PI3Ks的活性[12]。PIK3CA是結(jié)直腸癌中最常見的突變癌基因之一。據(jù)報(bào)道，約有15%～20%的結(jié)直腸癌患者攜帶PIK3CA突變[2]。本研究發(fā)現(xiàn)PIK3CA在結(jié)直腸癌中的突變率為21.05%，不同研究中報(bào)道的PIK3CA突變率有所差異，這可能與種族人群、研究隊(duì)列和檢測(cè)技術(shù)有關(guān)[13]。一些研究表明，PIK3CA突變與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[14]。Farina等[15]發(fā)現(xiàn)具有PIK3CA外顯子20突變的患者比PIK3CA野生型腸癌患者具有更低的無病生存期。Ogino等[16]報(bào)道了PIK3CA突變是Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后因素。本研究發(fā)現(xiàn)，Bacteroides fragilis與PIK3CA突變均與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)PIK3CA突變型的結(jié)直腸癌患者中Bacteroidetes明顯富集。既往研究發(fā)現(xiàn)PIK3CA突變會(huì)引起PI3K/AKT/mTOR通路的激活，而mTOR是重要的代謝調(diào)控通路，影響多種代謝產(chǎn)物的合成[10]。Ogino等[16]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者中的氨基酸、無機(jī)酸、醛、脂肪酸等多種代謝產(chǎn)物與對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接的影響。因此，本研究推測(cè)，PIK3CA突變是否潛在的引起了腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步縮短了結(jié)直腸癌患者的生存期。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)益生菌干預(yù)顯著改善大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)，并特異性降低包含F(xiàn)usobacterium在內(nèi)的某些致病菌豐度，初步顯示出益生菌干預(yù)對(duì)大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)整能力。此外，該研究也發(fā)現(xiàn)益生菌通過調(diào)節(jié)免疫功能和抑制潛在有害細(xì)菌的生長(zhǎng)等機(jī)制預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生[16]。因此，本研究認(rèn)為，未來的研究中，能否通過腸道菌群移植，益生菌干預(yù)，尋找靶向于特定腸道菌群的藥物等一系列途徑，來逆轉(zhuǎn)腸道菌群穩(wěn)態(tài)的破壞，進(jìn)而阻斷腸道菌群變化給人類帶來的包括結(jié)直腸癌等在內(nèi)的一系列疾病，期待更多的研究進(jìn)一步揭示。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PIK3CA突變型與野生型結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著性差異，揭示了結(jié)直腸癌患者中的腸道菌群結(jié)構(gòu)與PIK3CA突變之間存在著潛在的關(guān)系，然而其中具體的機(jī)制尚不明確，有待更深入的研究進(jìn)一步揭示。