呂建明，曹志秦，黃嘉華，陳國棟，胡丹*，高昊, **

（1. 暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632；2. 沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

真菌物種資源豐富，據(jù)估計自然界中存在的真菌多達(dá)220萬到380萬種[1]。豐富的真菌資源蘊(yùn)藏了巨大的活性物質(zhì)合成潛能，真菌在藥物發(fā)現(xiàn)中扮演著極其重要的角色[2]，如青霉素、環(huán)孢菌素、洛伐他汀等均是從真菌中發(fā)現(xiàn)的明星藥物分子[3]。然而，自20世紀(jì)80年代以來，人們從真菌中發(fā)現(xiàn)活性新天然產(chǎn)物的概率越來越低[4]，加之制藥公司在天然藥物研發(fā)上的投入越來越少[5]，天然產(chǎn)物化學(xué)研究進(jìn)入到一個漫長的低谷期。近年來，隨著高通量測序技術(shù)以及生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)真菌基因組中編碼天然產(chǎn)物的基因簇數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于已從中所發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物數(shù)量，提示真菌中尚存在大量的沉默基因簇有待進(jìn)一步的發(fā)掘。因此，如何最大限度地激活沉默基因簇，已成為后基因組時代高效利用真菌資源的關(guān)鍵。本文系統(tǒng)總結(jié)了真菌沉默基因簇激活策略的研究進(jìn)展，以期為充分釋放真菌蘊(yùn)含的化學(xué)潛能提供參考。

根據(jù)次生代謝產(chǎn)物激活的可預(yù)測性和不可預(yù)測性，我們將目前的激活策略分為非定向的沉默基因簇激活策略和定向的沉默基因簇激活策略（見圖1）：非定向激活策略包括基于培養(yǎng)基成分改變或培養(yǎng)條件優(yōu)化的激活策略、基于微生物共培養(yǎng)的激活策略、基于表觀遺傳調(diào)控的激活策略、基于全局調(diào)控因子的激活策略以及基于代謝分流的激活策略等；定向激活策略包括基于啟動子置換的激活策略與基于異源表達(dá)的激活策略等。

圖 1 真菌沉默基因簇激活的代表性策略Figure 1 Representative strategies for activation of fungal silent gene clusters

1 真菌沉默基因簇的非定向激活策略

非定向的沉默基因簇激活是指通過物理刺激、化學(xué)誘導(dǎo)或表觀遺傳調(diào)控等手段非定向地激活次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控方法。該策略可以同時激活多個不同的生物合成基因簇，有助于快速高效地挖掘結(jié)構(gòu)多樣的真菌活性天然產(chǎn)物。

1.1 基于培養(yǎng)基成分改變或培養(yǎng)條件優(yōu)化的激活策略

1.1.1 改變培養(yǎng)基種類從同一菌株獲得多樣的次生代謝產(chǎn)物，最簡單直接的方式就是采用不同的培養(yǎng)基對目標(biāo)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，也就是我們經(jīng)常所說 的OSMAC策 略（one strain many compounds）（見圖1）。Zheng等[6]從一株地衣內(nèi)生真菌Nodulisporiumsp.的大米固體發(fā)酵培養(yǎng)物中分離鑒定了2個4-甲基孕甾類化合物nodulisporisteriods A和B。隨后，Zhao等[7]采用PDB培養(yǎng)基（potato dextrose broth）對上述菌株進(jìn)行了重新發(fā)酵，結(jié)果從其胞外提取物中獲得了8個新的綠膠霉素類化合物nodulisporiviridins A ～ H，其 中nodulisporiviridin G具有Aβ42聚集抑制活性（IC50= 1.2 μmol · L-1）。此外，該類化合物還可提高Aβ轉(zhuǎn)基因果蠅的短期學(xué)習(xí)記憶能力。Wang等[8]從松口蘑中分離獲得了一株真菌Trichoderma harzianum，發(fā)現(xiàn)其在4種培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物明顯不同，并從這4種培養(yǎng)基的提取物中分離鑒定了8個新化合物，其中2，3-dialkylchromone具有突出的昆蟲誘捕與致死活性。

1.1.2 培養(yǎng)基中添加金屬離子和鹵素向培養(yǎng)基中添加一定量的金屬離子、鹵素等也會使目標(biāo)菌株的代謝產(chǎn)物發(fā)生變化。金屬離子通過影響生物體的生理結(jié)構(gòu)與酶的功能來使其代謝產(chǎn)物發(fā)生變化[9]。研究人員發(fā)現(xiàn)向培養(yǎng)基中加入鈷離子[10]、鐵離子[11]、鋅離子[11]、銅離子[12]等均有可能改變菌株的代謝，從而獲得新的代謝產(chǎn)物。鹵素的添加會改變培養(yǎng)基的滲透壓，因此有可能激活因滲透壓失衡而沉默的基因，特別是對于海洋來源的真菌，其激活效果更為明顯。Sureram等[13]發(fā)現(xiàn)向紅樹林來源的真菌Aspergillus unguis的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加KBr或KI后，其可合成多個新的具有芳香酶抑制活性的代謝產(chǎn)物。Yu等[14]通過添加NaI的方式從一株植物內(nèi)生真菌Pestalotiopsis lespedezae的大米發(fā)酵提取物中分離鑒定了10個新的ambuic acid類聚酮化合物，其中pestallic acid Q是首次從內(nèi)生真菌中分離鑒定的碘化天然產(chǎn)物。

1.1.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化合適的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)溫度、pH、溶氧量等是真菌正常生長代謝的關(guān)鍵，因此培養(yǎng)條件的改變也會對基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。Scherlach等[15]通過改變培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)周期、溫度以及溶氧量，從Aspergillus nidulans的發(fā)酵液中分離獲得了2個新的異吲哚啉酮類生物堿aspernidines A和B。Siridechakorn等[16]發(fā)現(xiàn)將SDB培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose broth）的pH調(diào)至5.0時，植物內(nèi)生真菌Rhytidhysteron rufulum可合成2個新的具有抗腫瘤活性的聚酮化合物rhytidenones G和H，其中rhytidenone H的活性顯著高于rhytidenone G，其對淋巴瘤細(xì)胞Ramos和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975的IC50分別達(dá)到了0.018和0.252 μmol · L-1。

1.2 基于微生物共培養(yǎng)的激活策略

在自然條件下，微生物之間存在著復(fù)雜的相互作用，可誘導(dǎo)彼此合成結(jié)構(gòu)多樣的代謝產(chǎn)物。然而，由于通過改變培養(yǎng)基成分或培養(yǎng)條件很難模擬這種復(fù)雜的相互作用，因此，通過將不同的微生物進(jìn)行混合培養(yǎng)，模仿微生物所處的天然生態(tài)環(huán)境，有望獲得單獨培養(yǎng)時無法產(chǎn)生的天然產(chǎn)物（見圖1）。

自1989年Sonnenbichler等[17]首次通過混合培養(yǎng)從Heterobasidion annosum中分離獲得多個具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物以來，研究人員在近30年間通過采用真菌與真菌或真菌與細(xì)菌的混合培養(yǎng)方式獲得了大量的活性天然產(chǎn)物[18-19]。人們認(rèn)為微生物混合培養(yǎng)時主要通過3種作用方式來激活沉默基因[20]。第一種方式是一種微生物合成底物或前體，然后被另一種微生物所利用來合成特定的代謝產(chǎn)物。如Rhizopussp.在合成植物毒素根霉素（rhizoxin）時，需要其內(nèi)生細(xì)菌Burkholderiasp.提供前體化合物WF-1360F[21-22]。第二種是一種微生物合成信號分子，誘導(dǎo)另一種微生物的基因表達(dá)。如植物病原細(xì)菌Ralstonia solanacearum通過合成脂肽類化合物ralsolamycin來激活植物病原真菌Fusarium fujikuroi中bikaverin等化合物的生物合成基因，從而保護(hù)真菌免受細(xì)菌的侵染[23]。第三種是混合培養(yǎng)的微生物通過細(xì)胞之間的物理接觸來激活沉默基因。如放線菌Streptomyces hygroscopicus通過菌絲體之間的相互作用，激活A(yù). nidulans的苔色酸合成酶基因[24]。

不論是基于培養(yǎng)基成分改變或培養(yǎng)條件優(yōu)化的激活策略，還是基于微生物共培養(yǎng)的激活策略，人們都需要通過大量的篩選才能獲得合適的激活條件。因此，為了提高沉默基因簇的激活效率，研究人員又發(fā)展了干預(yù)靶點明確的非定向激活策略。

1.3 基于表觀遺傳調(diào)控的激活策略

表觀遺傳是指在不改變基因序列的情況下，基因的表達(dá)發(fā)生了可遺傳的變化[25]。在真菌中，表觀遺傳修飾與次生代謝產(chǎn)物的合成密切相關(guān)，如DNA的甲基化對基因的轉(zhuǎn)錄有抑制作用[26]，組蛋白的乙?；ǔせ罨虮磉_(dá)，但在少數(shù)情況下會抑制基因的表達(dá)[27]，組蛋白的甲基化也會影響基因的表達(dá)[28]。因此，表觀遺傳調(diào)控也被廣泛用于真菌沉默基因簇的激活（見圖1）[29]。

1.3.1 表觀遺傳小分子抑制劑的添加基于已鑒定的表觀遺傳修飾酶，人們篩選獲得了多個表觀遺傳小分子抑制劑，包括DNA甲基化酶（DNA methyltransferase，DNMT）抑 制 劑5-氮 胞 苷（5-Aza）與N-phthalyl-L-tryptophan（RG108），組 蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑辛二酰雙羥肟酸（SBHA）、辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）、煙酰胺（nicotinamide）、丁酸鈉（sodium butyrate）、丙 戊 酸（valproic acid）和octanoylhydroxamic acid，以及組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）抑制劑漆樹酸（anacardic acid）。為了通過表觀遺傳調(diào)控來激活沉默基因簇，研究人員將這些抑制劑單獨或以組合的方式添加到真菌培養(yǎng)體系中，獲得了多個新的天然產(chǎn)物（見表1）。

表 1 表觀遺傳修飾酶抑制劑在真菌沉默基因簇激活中的應(yīng)用Table 1 Application of epigenetic modification enzymes inhibitors in the activation of fungal silent gene clusters

續(xù)表1

1.3.2 表觀遺傳調(diào)控基因的敲除雖然利用小分子抑制劑進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控簡單方便，但由于一些抑制劑的特異性較差，可能會抑制其他酶的功能，從而影響真菌的生長代謝。因此，利用基因編輯方法對真菌中的表觀遺傳修飾酶基因進(jìn)行定向敲除或過表達(dá)也是一種重要的調(diào)控手段。目前，研究人員通過對真菌中的HDAC、HAT以及組蛋白甲基化酶（histone methyltransferase，HMT）編碼基因的敲除或過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了多個新的天然產(chǎn)物（見表2）。

表 2 表觀遺傳修飾酶基因敲除或過表達(dá)在真菌沉默基因簇激活中的應(yīng)用Table 2 Application of knockout or overexpression of epigenetic modification enzymes-encoding genes in the activation of fungal silent gene clusters

1.4 基于全局調(diào)控因子的激活策略

除了表觀遺傳修飾酶，全局調(diào)控因子也可同時調(diào)控多個基因的表達(dá)（見圖1）。全局調(diào)控因子是一類在特定的誘導(dǎo)條件下（如周圍環(huán)境的變化），可同時調(diào)控多個基因表達(dá)的調(diào)控因子[48]。2004年，BoK等[49]從曲霉屬真菌中找到了一個全局調(diào)控因子基因laeA，發(fā)現(xiàn)敲除laeA可以抑制部分基因的表達(dá)，從而使菌株不再合成相應(yīng)的天然產(chǎn)物，而laeA的過表達(dá)則可以促進(jìn)相關(guān)化合物的合成。隨后，全局調(diào)控因子LaeA被廣泛用于真菌沉默基因簇的激活[50-52]。除LaeA之外，目前用于真菌沉默基因簇激活的全局調(diào)控因子還有RsmA[53]、MeaB[54]、PacC[55]、HapX[56]、McrA[57]、AreA[58]、LaeB[59]、CreA[60]、TRI6[61]等。

1.5 基于代謝分流的激活策略

代謝分流是指通過敲除菌株中主要代謝產(chǎn)物的生物合成關(guān)鍵基因，使得更多的前體流向其他化合物生物合成代謝流的一種激活策略（見圖1）。Wei等[62]通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)一株植物內(nèi)生真菌Penicillium dangeardii的基因組中含有43個次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，但該菌株在多種培養(yǎng)條件下主要高產(chǎn)紅青霉毒素類化合物（rubratoxins）。隨后，Wei等采用表觀遺傳調(diào)控的方法來激活該菌株的其他沉默基因簇，但結(jié)果顯示代謝產(chǎn)物并沒有發(fā)生明顯的變化。Wei等推測可能是由于該菌株在合成rubratoxins時消耗了大量的底物，從而抑制了其他化合物的合成。隨后，Wei等敲除了P. dangeardii中參與rubratoxins合成的聚酮合酶基因rbtJ，并最終從敲除菌株中分離獲得了23個新化合物，部分化合物表現(xiàn)出突出的細(xì)胞毒、抗炎或抗氧化活性。與表觀遺傳調(diào)控策略以及全局調(diào)控因子策略不同，代謝分流策略并不是通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來激活沉默基因，而是通過調(diào)節(jié)代謝流使得沉默基因可以獲得足量的前體，從而合成相應(yīng)的產(chǎn)物。

2 真菌沉默基因簇的定向激活策略

定向的沉默基因簇激活是指對特定沉默基因簇進(jìn)行靶向激活，不同于非定向激活策略，定向激活策略通常只能激活某一特定的生物合成基因簇。

2.1 基于啟動子置換的激活策略

啟動子置換是指利用新的啟動子替換沉默基因原有的啟動子，從而使得沉默基因可以在原宿主中進(jìn)行正常表達(dá)?？紤]到真菌次生代謝產(chǎn)物可能會對原宿主產(chǎn)生毒性，因此為了不影響真菌的生長，同時又能激活沉默基因獲得新的活性天然產(chǎn)物，研究人員通常選用誘導(dǎo)型啟動子來替換沉默基因原有的啟動子。

2.1.1 生物合成基因啟動子的置換該策略主要是利用誘導(dǎo)型啟動子，如乙醇脫氫酶啟動子（alcohol dehydrogenase promoter，alcA）[63]，置換沉默的生物合成基因原有的啟動子，然后在誘導(dǎo)劑的作用下驅(qū)動目標(biāo)基因表達(dá)，從而合成新的代謝產(chǎn)物。然而，由于真菌中每一個基因的表達(dá)通常都需要一個啟動子來驅(qū)動[64]，因此在進(jìn)行啟動子置換時，需要對基因簇中所有沉默的生物合成基因的啟動子進(jìn)行替換（見圖1）。Yeh等[65]從A. nidulans的基因組中發(fā)現(xiàn)了一個含有6個基因的沉默基因簇，為了研究這個基因簇的功能，作者用alcA同時替換了這6個基因的啟動子，最后發(fā)現(xiàn)這個沉默的基因簇負(fù)責(zé)蛋白酶抑制劑fellutamide B的生物合成。

2.1.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因啟動子的置換真菌的生物合成基因簇中通常含有多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，其主要負(fù)責(zé)合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，然后與基因簇中其他基因的啟動子序列特異性結(jié)合，從而激活特定基因簇的表達(dá)[66]。因此，當(dāng)沉默的基因簇中含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因時，人們只需將轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的啟動子置換便可激活該基因簇，不需要對基因簇中所有生物合成基因的啟動子進(jìn)行置換。目前，研究人員已鑒定的真菌中負(fù)責(zé)調(diào)控特定基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子包括Zn(II)2Cys6、Cys2His2、Basic leucine zipper(bZIP)、Ankyrin repeat、Winged helix等類型（見表3）。其中，最普遍的特異性調(diào)控因子為Zn(II)2Cys6類型。據(jù)統(tǒng)計，近90%參與調(diào)控真菌聚酮類化合物生物合成的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子均屬于Zn(II)2Cys6型[67]。

表 3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因啟動子置換在真菌沉默基因簇激活中的應(yīng)用Table 3 Application of promoters replacement of transcriptional regulatory genes in the activation of fungal silent gene clusters

Chiang等[77]從A. nidulans中發(fā)現(xiàn)了一個沉默的含有2個聚酮合酶基因以及多個修飾酶基因的基因簇，然后將基因簇中的Zn(II)2Cys6型轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因afoA的啟動子替換為alcA啟動子，并最終發(fā)現(xiàn)該沉默基因簇負(fù)責(zé)聚酮類化合物asperfuranone的生物合成，該化合物可通過阻止細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)凋亡來抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖[78]。此外，人們還可將啟動子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因在體外連接，然后再轉(zhuǎn)染到原始菌株中，從而靶向激活沉默的基因簇。Bergmann等[79]從A. nidulans中發(fā)現(xiàn)了一個沉默的含有8個基因的基因簇，作者將該基因簇中的Zn(II)2Cys6型轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因apdR與alcA啟動子連接，隨后導(dǎo)入至A. nidulans中，最后在環(huán)戊酮的誘導(dǎo)下分離鑒定出2個新的聚酮-非核糖體肽雜合體aspyridones A和B。

2.2 基于異源表達(dá)的激活策略

異源表達(dá)是指將沉默的基因與高效啟動子連接，然后導(dǎo)入到遺傳操作簡單的異源宿主中，在特定的條件下誘導(dǎo)基因表達(dá)產(chǎn)生新天然產(chǎn)物的一種策略（見圖1）。由于啟動子置換策略無法用于難以建立遺傳操作體系的菌株，因此異源表達(dá)成為另一種被廣泛使用的沉默基因簇靶向激活策略。目前，用于表達(dá)真菌沉默基因簇的異源宿主主要有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和曲霉屬真菌（Aspergillusspp.）。

2.2.1 基于釀酒酵母異源表達(dá)的激活策略釀酒酵母是一種被廣泛研究的單細(xì)胞真菌，在異源激活真菌沉默基因簇方面有著重要的應(yīng)用[80]。目前，研究人員已對釀酒酵母的遺傳信息與生命活動規(guī)律有了較為深入的認(rèn)識，并開發(fā)了一系列針對釀酒酵母遺傳改造的分子生物學(xué)技術(shù)與工具[81]。因此，極易利用合成生物學(xué)技術(shù)調(diào)控釀酒酵母的代謝流，構(gòu)建不同的底盤細(xì)胞，為激活不同類型天然產(chǎn)物生物合成的基因簇提供高效的異源宿主。Bian等[82]為了利用釀酒酵母激活沉默的倍半萜環(huán)化酶基因，首先在釀酒酵母中過表達(dá)了甲羥戊酸途徑中的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因tHMG1，隨后同時將法尼基焦磷酸（farnesyl-PP，F(xiàn)PP）合成酶基因ERG20以及從Fusarium graminearum基因組中挖掘到的倍半萜環(huán)化酶基因FgJ03939導(dǎo)入到上述底盤酵母菌中，最終獲得了8個不同類型的倍半萜類化合物。然而，由于釀酒酵母只能識別不含有內(nèi)含子的基因序列，因此在利用釀酒酵母進(jìn)行異源表達(dá)時通常需要準(zhǔn)確去除真菌基因中的內(nèi)含子序列。

2.2.2 基于曲霉屬真菌異源表達(dá)的激活策略近20年，研究人員通過紫外誘變、基因敲除等技術(shù)手段獲得了多個具有營養(yǎng)缺陷的曲霉屬菌株，包括米曲霉Aspergillus oryzaeNSAR1[83]、構(gòu)巢曲霉Aspergillusnidulans[84-85]等，為開展真菌天然產(chǎn)物的異源合成提供了新的選擇。與釀酒酵母不同，曲霉屬真菌可以準(zhǔn)確識別和去除真菌基因中的內(nèi)含子序列，因此只需從目標(biāo)菌株基因組中擴(kuò)增沉默基因，然后與淀粉酶啟動子amyB或乙醇脫氫酶啟動子alcA等連接后導(dǎo)入到曲霉中，最后在淀粉或環(huán)戊酮等的誘導(dǎo)下即可驅(qū)動基因的表達(dá)[86]。目前，研究人員以曲霉屬真菌作為異源宿主已激活了大量的真菌沉默基因簇，并發(fā)現(xiàn)了多個活性突出、結(jié)構(gòu)新穎的萜類[87-88]、聚酮類[89-90]以及生物堿類化合物[91]。然而，由于人們對曲霉屬真菌的生命活動規(guī)律認(rèn)識較少，且曲霉屬真菌中大量的修飾酶可能作用于異源合成的產(chǎn)物[92]，因此曲霉屬真菌作為異源宿主合成真菌天然產(chǎn)物仍有一定的局限性。

3 結(jié)語與展望

真菌是藥物發(fā)現(xiàn)的重要源泉。特別是近年來研究人員通過生物信息分析發(fā)現(xiàn)真菌中含有大量未被激活的次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，因此如何激活這些沉默基因簇已成為研究人員關(guān)注的焦點。針對這一問題，研究人員開發(fā)了多種非定向與定向的沉默基因簇激活策略，并在此基礎(chǔ)上獲得了大量結(jié)構(gòu)新穎、活性突出的天然化合物。然而，這些策略有各自的優(yōu)勢及局限性（見表4），單獨使用一種策略很難全面激活真菌中的沉默基因簇。因此，為了實現(xiàn)真菌資源的高效利用，應(yīng)同時采用多種策略以最大限度地激活真菌沉默基因簇。

表 4 不同沉默基因簇激活策略的優(yōu)缺點Table 4 Advantages and disadvantages of various strategies for activating silent gene clusters

續(xù)表4

此外，盡管真菌中存在大量的沉默基因簇，但這些基因簇是簡單的處于沉默狀態(tài)，還是發(fā)生了基因突變失去了功能，現(xiàn)有的生物信息分析手段還無法進(jìn)行有效的區(qū)分。未來有必要引入人工智能及大數(shù)據(jù)分析手段，提高對沉默基因簇和失活基因簇的辨別，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)失活基因的修復(fù)技術(shù)，從而提高沉默基因簇的激活效率。其次，針對大多數(shù)的非模式菌株，無法建立其高效的遺傳操作體系是限制其沉默基因簇激活的瓶頸，包括外源基因無法導(dǎo)入，或無合適的篩選基因用于轉(zhuǎn)染菌株的篩選，因此，需進(jìn)一步開發(fā)非模式真菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法以及篩選技術(shù)。最后，異源表達(dá)是定向激活沉默基因簇的重要手段，但目前用于真菌沉默基因簇表達(dá)的異源宿主種類相對較少，未來還需要開發(fā)不同的異源宿主，以適應(yīng)特定來源的真菌沉默基因表達(dá)。