何 昊，唐白露，王華堂

(湖南文理學院，湖南常德，415000)

柑桔在我國南方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著舉足輕重的地位[1]。枳是我國柑桔生產(chǎn)中常用的砧木之一[2]。在柑桔生產(chǎn)中，為了防止雜草生長，會使用草甘膦等除草劑[3-4]。草甘膦如果用量過多或者頻繁噴施，很容易在土壤中積累，導致土壤污染，使土壤質量下降[5-6]。如果根據(jù)果園中草甘膦使用量(4.48 kg/hm2)來估算，噴施一次后，會有80%以上的草甘膦藥液進入土壤，可使表層13 cm土壤的草甘膦含量達到2 mg/kg左右[7]。我國南方地區(qū)氣候溫暖濕潤，非常適合各種雜草生長，因此部分果園中草甘膦的實際使用量可能更多，且使用次數(shù)也會增加，這將導致土壤中草甘膦積累量增多。草甘膦可以被植物根系吸收并在植物體內(nèi)積累，最終抑制整個植株的生長。前人利用不同劑量草甘膦處理枳、溫州蜜柑、臍橙植株后發(fā)現(xiàn)，高劑量的草甘膦會對新梢產(chǎn)生毒害作用，并抑制根系對土壤養(yǎng)分的吸收[4，8-9]。雖然草甘膦對柑桔植株的危害已經(jīng)受到關注，但是關于草甘膦對柑桔根際環(huán)境的影響仍鮮見報道，尤其是草甘膦對柑桔根際土壤有機酸含量、土壤酶活性以及微生物的影響尚不明確。根際土壤有機酸主要來源于植物根系分泌物，是調控根際生物和非生物互作的重要因子[10-12]。根際土壤酶活性和根際微生物群落更是與植物的健康生長息息相關[13-15]。本試驗以此為切入點，通過使用不同劑量的草甘膦處理柑桔砧木枳幼苗，觀察其對枳幼苗生長的影響，以及對根際土壤有機酸、酶活性和微生物的作用，探明草甘膦對枳苗根際環(huán)境的危害，以期為草甘膦污染土壤的修復以及草甘膦的規(guī)范使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 枳幼苗 選飽滿枳種子，先用25 ℃溫水浸泡24 h，再埋入蛭石中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待種子萌發(fā)，幼苗生長至10 cm左右，挑選長勢一致的枳幼苗進行盆栽。

1.1.2 供試土壤 種植枳苗所使用的土壤取自湖南文理學院生物園中閑置的已開墾地塊，且5年內(nèi)沒有種植過柑桔和其他作物，僅有馬唐草、馬齒莧等雜草生長。采用五點法取土，取土深度為10～30 cm(去除表層10 cm的土壤)，將所取土壤弄碎平鋪于室內(nèi)地面，去除碎石及其他雜質，自然風干后過0.5 cm網(wǎng)篩，再與一定量泥炭和蛭石按體積比3∶1∶1混合均勻，用于枳苗盆栽種植。試驗所用園土的有機質為25.79 g/kg，堿解氮為66.88 mg/kg，有效磷為51.02 mg/kg，有效鉀為63.61 mg/kg，pH值為6.76。

1.2 方法

1.2.1 草甘膦處理設計 設5個處理，即在盆栽基質中添加不同量草甘膦，使盆栽基質中草甘膦含量分別為0(空白對照)、5、10、15和20 mg/kg。以塑料盆(直徑18 cm × 高18 cm)為種植容器，每盆裝4 kg盆栽基質，選擇苗齡25 d、具備5～6片葉、高10 cm左右、長勢一致的枳幼苗種于盆中，每盆一株，每個草甘膦處理20盆，放置于通風透光的塑料大棚中培養(yǎng)。每隔3 d左右澆一次水，澆水量以盆底無多余水分流出為限。盆栽時間為2020年4月1日至7月30日。

1.2.2 枳苗生長指標測定 2020年7月30日，從每個處理選取10株無明顯病蟲害和損傷的枳苗用于指標測定。使用直尺測定枳苗株高(從根頸到莖尖)和主根長(從根頸到根尖)，使用游標卡尺測定莖粗(根頸上方2 cm處)，使用Expression 10000XL根系掃描儀(Epson，日本)測定總根長、總表面積、總根尖數(shù)。根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[16]測定。葉干質量測定方法：從每株幼苗中部摘取3片大小相近的葉片，每個處理10株苗共摘取30片葉，每10片葉的總干質量作為一次重復。隨后去除所有葉片，將幼苗從根頸處剪斷即分為莖和根。將葉、莖和根在105 ℃烘箱中干燥20 min，然后在80 ℃烘干48 h至恒重，用于干質量的測定。

1.2.3 根際土壤收集與分析 每個處理的根際土壤也取自以上選擇的10株枳苗。從盆土中小心取出枳苗，將根系上的大塊土壤(基質)去除，然后用細毛刷將依附在根系表面的細土輕輕刷下收集，用于后續(xù)的根際土壤有機酸含量、土壤酶活性以及土壤細菌和真菌生物量測定。

根際土壤有機酸含量測定參照羅燕等[17]的方法。稱取10 g根際土，加入100 mL超純水，搖勻后過濾，濾液先通過陽離子交換樹脂柱，再通過陰離子交換樹脂柱，隨后用1 mol/L的鹽酸洗脫陰離子交換柱內(nèi)的有機酸組分，蒸干，超純水定容至10 mL，過0.45 μm濾膜后作為待測液，利用高效液相色譜儀測定有機酸的種類和含量。同時配置草酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、丙二酸、苯甲酸、奎寧酸和檸檬酸的標準液用于繪制標準曲線。

根際土壤酶活性測定參照羅燕等[17]的方法。過氧化氫酶活性用高錳酸鉀滴定法測定，以0.1 mol/L的高錳酸鉀與1 g土反應所用的體積(mL)表示。脲酶活性用苯酚-次氯酸鈉比色法測定，以1 g土在24 h內(nèi)釋放的NH3-N的質量(mg)表示。轉化酶活性用3，5-二硝基水楊酸比色法測定，以1 g土在24 h內(nèi)釋放的葡萄糖的質量(mg)表示。酸性磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法測定，以1 g土在24 h內(nèi)釋放酚的質量(mg)表示。

根際土壤細菌和真菌的生物量分別用胞壁酸和氨基葡萄糖含量來表示。胞壁酸主要來源于細菌的細胞壁，氨基葡萄糖則存在于細菌和真菌中。細菌中胞壁酸和氨基葡萄糖的含量比例為1∶2，因此，可以通過測定出細菌中胞壁酸含量后換算出細菌氨基葡萄糖的含量，再用總氨基葡萄糖減去細菌氨基葡萄糖即可得真菌中氨基葡萄糖含量[18]。根際土壤中胞壁酸和氨基葡萄糖含量的測定參照Zhang等[19]的方法。稱取0.5 g根際土，加入6 mol/L的鹽酸10 mL于105 ℃水解8 h，冷卻后加入1 μg/mL的肌醇溶液100 μL混勻過濾，濾液蒸干后用蒸餾水再溶解，調pH值為6.6～6.8，離心(3 000 r/min)10 min，收集上清液再蒸干，用6 mL甲醇溶解后再次離心，上清液轉移至衍生瓶中，在45 ℃下氮氣吹干，加入1 mL水和100 μL N-甲基氨基葡萄糖，冰凍后進行冷凍干燥，再通過醛糖腈乙酸酯法進行氨基糖衍生。衍生物采用氣相色譜法檢測，色譜條件參照寧照等[20]的方法。土壤中胞壁酸和氨基葡萄糖含量的計算公式為：m =(miAx)/(AiRf)，mi為肌醇濃度，Ai為肌醇的峰面積，Ax為樣品中胞壁酸或氨基葡萄糖的峰面積，Rf為胞壁酸或氨基葡萄糖的相對校正因子，利用標準樣品的校正因子來計算。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SAS 8.1軟件的Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 草甘膦對枳苗地上部分生長的影響

土壤(盆栽基質)中草甘膦含量不同，枳苗地上部分生長效果不同。土壤中草甘膦含量≤10 mg/kg時，對枳苗株高、莖粗、葉干質量和莖干質量沒有顯著影響；≥15 mg/kg時，使枳苗株高、葉干質量和莖干質量降低顯著，20 mg/kg草甘膦處理還使莖粗顯著減小(見表1)。

表1 土壤(盆栽基質)中草甘膦含量對枳幼苗地上部分生長的影響

2.2 草甘膦對枳苗根系生長的影響

土壤中草甘膦含量不同，枳苗根系生長情況也有所不同。5 mg/kg草甘膦處理對枳苗根系生長無影響；10 mg/kg草甘膦處理對枳苗根系生長影響較小，僅根系總表面積有所減小。較高濃度(≥15 mg/kg)的草甘膦處理則會明顯抑制枳苗根系的生長，且抑制效果隨著濃度的增加而增強(見表2)。

表2 土壤(盆栽基質)中草甘膦含量對枳幼苗根系生長的影響

2.3 草甘膦對根際土壤有機酸含量的影響

枳根際土壤有機酸的主要種類為草酸、琥珀酸、丙二酸和檸檬酸，其中以草酸的含量最多，所占比例達90%左右；檸檬酸含量最少，所占比例不超過1%。不同劑量草甘膦處理對枳根際土壤中各類有機酸含量的影響有所不同。根際土壤中草酸與琥珀酸含量在5 mg/kg的草甘膦處理中會有所增加，而后隨著草甘膦劑量增加，草酸與琥珀酸含量會逐漸下降，在20 mg/kg的草甘膦條件下，草酸與琥珀酸含量與清水處理組相比分別減少了31%和47%。根際土壤中丙二酸和檸檬酸受草甘膦的影響較大，隨著草甘膦處理劑量增加，丙二酸和檸檬酸含量會逐漸下降；在20 mg/kg的草甘膦處理中，丙二酸已經(jīng)檢測不到，而檸檬酸也只有微量存在(見表3)。

表3 土壤(盆栽基質)中草甘膦含量對枳根際土壤有機酸含量的影響 mg/kg

2.4 草甘膦對根際土壤酶活性的影響

不同劑量草甘膦處理對枳根際土壤酶活性的影響也有所不同。枳根際土壤中過氧化氫酶和轉化酶活性在5 和10 mg/kg的草甘膦處理中沒有發(fā)生明顯的變化，而后隨著草甘膦劑量繼續(xù)增加，過氧化氫酶和轉化酶活性會逐漸下降，在20 mg/kg草甘膦處理中，過氧化氫酶和轉化酶活性與清水處理組相比分別下降了35%和65%。根際土壤中的脲酶和酸性磷酸酶活性除了在5 mg/kg的草甘膦處理中變化不明顯，在其他處理條件下均顯著下降；在20 mg/kg草甘膦處理中，脲酶和酸性磷酸酶活性分別下降了60%和48%(見表4)。

表4 土壤(盆栽基質)中草甘膦含量對枳根際土壤酶活性的影響

2.5 草甘膦對根際土壤細菌和真菌的影響

草甘膦對枳根際土壤中細菌和真菌的影響差異較大。在5和10 mg/kg草甘膦處理下，枳根際土壤細菌胞壁酸含量與清水對照差異不明顯，隨著草甘膦濃度進一步增加，根際土壤胞壁酸含量也逐漸減少，在20 mg/kg草甘膦處理下根際土壤胞壁酸含量與清水處理相比減少了31%。根際土壤中真菌氨基葡萄糖含量則隨著草甘膦濃度的增加呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，在20 mg/kg草甘膦處理下，氨基葡萄糖含量與清水處理相比減少了12%(見圖1)。

圖1 土壤(盆栽基質)中草甘膦含量對枳根際土壤細菌和真菌生物量的影響

3 討論與結論

在本試驗中，5和10 mg/kg草甘膦處理對枳苗地上部和地下部的生長沒有明顯影響，這與陳貴虎等[21]和梁敬崎等[22]利用較低劑量草甘膦處理枳和紅桔幼苗的試驗結果相同。少量的草甘膦進入土壤后，可以很快與鋁和鐵等金屬離子結合，從而失去活性，并且也會被土壤微生物降解為水、磷酸和二氧化碳[5-6]，因而對枳幼苗根系產(chǎn)生的毒害作用不明顯。然而，較高量的草甘膦進入土壤，則無法在短時間內(nèi)全部與金屬離子結合或者被微生物降解，殘存的草甘膦可以被植物根系吸收，再經(jīng)過植物輸導組織運輸?shù)街仓甑厣喜糠諿23]。草甘膦在植物體內(nèi)會通過抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性致使莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的轉化受阻，進而導致蛋白質合成受到干擾[24-25]。草甘膦進入葉片細胞后，還會抑制類胡蘿卜素、葉綠素合成以及光合作用相關酶的活性，阻礙光合產(chǎn)物的積累[26-27]。因此，在較高量草甘膦脅迫下，枳幼苗的地上部分生長受到了明顯的抑制作用。植物根系是最先接觸土壤中草甘膦的器官，草甘膦被根系吸收后會在根尖部分大量富集，并絡合細胞中的金屬陽離子，從而造成根系細胞受損，影響根系生長[26]，較高量的草甘膦還會減少枳幼苗根系生物量，并抑制根系長度增長，這與宋宏峰等[28]在毛桃上的研究結果相似。

土壤酶主要來源于土壤中動植物和微生物的分泌物以及殘體的分解物，是植物營養(yǎng)元素的活性庫，土壤酶活性改變將會影響土壤中碳、氮、磷等元素的循環(huán)過程[32-33]。在本試驗中，高量草甘膦處理的枳根際土壤過氧化氫酶、脲酶、轉化酶和酸性磷酸酶活性均顯著降低。這可能是由于高量的草甘膦抑制了枳幼苗根系以及土壤微生物的生長，最終導致來源于植物根系和土壤微生物的土壤酶也相應減少。

土壤微生物與土壤腐殖質形成、有機物分解、養(yǎng)分轉化與循環(huán)等過程密切相關，是土壤質量的重要影響因子[34]。在本試驗中，根際土壤真菌氨基葡萄糖含量會隨著草甘膦劑量的增加而呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，這與根際土壤中草酸含量的變化趨勢相似。植物根系分泌的有機酸可以作為營養(yǎng)物質被根際土壤真菌利用，有機酸在根際土壤中積累而形成的酸性環(huán)境也更有利于真菌的生長，因此根際土壤真菌數(shù)量與植物根系分泌物通常會呈現(xiàn)出正相關[35]。而高量的草甘膦處理不僅減少了根系有機酸的分泌，也可能會抑制根際真菌的生長[5]。根際土壤中細菌胞壁酸含量則隨著草甘膦劑量增大而減少，并不會出現(xiàn)增加的情況，可能是因為根際土壤真菌與細菌之間會存在競爭關系。

綜上可知，高量草甘膦存在于土壤中會顯著抑制枳幼苗地上部和地下部的生長，并降低根際土壤有機酸含量、土壤酶活性以及細菌和真菌的生物量，使根際土壤環(huán)境逐漸向不利于枳幼苗生長的方向發(fā)展。