卓澤文，劉樹榮，李名志，王 宇，2，孔令保，2

（1.南昌市動(dòng)物病毒與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的家豬、野豬的一種急性、熱性、高度接觸性動(dòng)物傳染病，所有品種和年齡的豬均可感染，發(fā)病率和死亡率最高可達(dá)100%，且目前全世界沒有有效的疫苗［1］。自2018 年8 月在沈陽發(fā)現(xiàn)中國首例非洲豬瘟病例以來［2］，中國大陸32 個(gè)省級(jí)行政區(qū)均已發(fā)生非洲豬瘟疫情［3］，對(duì)中國養(yǎng)豬業(yè)及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了巨大威脅，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億元。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《非洲豬瘟疫情應(yīng)急實(shí)施方案（2020 年第二版）》建議從生豬的生產(chǎn)養(yǎng)殖、調(diào)運(yùn)、屠宰等環(huán)節(jié)建立檢測(cè)監(jiān)測(cè)，故ASFV 的現(xiàn)場(chǎng)、快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)是及時(shí)發(fā)現(xiàn)和控制非洲豬瘟疫情的關(guān)鍵。

ASFV 是一種大型的高度復(fù)雜的包膜雙鏈閉合線性DNA 病毒［4］，p72編碼基因位于遺傳多樣性極低的區(qū)域，是ASFV 株系分型的重要基因，因此是核酸檢測(cè)的最佳靶基因之一［5，6］。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)自2000 年日本學(xué)者Notomi 等在《Nucleic Acids Research》上報(bào)道后，經(jīng)過20 多年的發(fā)展，已經(jīng)成為一項(xiàng)十分成熟的技術(shù)［7］。目前針對(duì)ASFV 的檢測(cè)方法主要是核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)。在中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心OIE 參考實(shí)驗(yàn)室公布的非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)工作中，抗體檢測(cè)試劑的敏感性只有60%～70%，而核酸檢測(cè)試劑的敏感性達(dá)93%～100%。此外，抗體檢測(cè)成本較高、再現(xiàn)性較差、操作復(fù)雜，很難在基層實(shí)驗(yàn)室和豬場(chǎng)推廣使用；熒光定量PCR 等方法仍存在對(duì)檢測(cè)設(shè)備有較高要求、用時(shí)較長(zhǎng)等問題，不能滿足于現(xiàn)場(chǎng)和基層實(shí)驗(yàn)室的快速檢測(cè)。本研究基于LAMP 技術(shù)建立一種適合豬場(chǎng)和農(nóng)戶現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的高效、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、價(jià)格低廉的ASFV快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Bst 3.0 DNA 聚合酶及其緩沖液購自NEB 公司；甜菜堿購自Solarbio 公司；核酸電泳10×Loading buffer購自TaKaRa 公司；2k DNA Marker、核酸染料購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；10 mmol/L dNTP 購自生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖購自GenStar公司。

1.2 儀器設(shè)備

梯度PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；瓊脂糖水平電泳儀購自上海天能科技有限公司；掌上離心機(jī)購自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司。

1.3 模板及引物

模板為本實(shí)驗(yàn)室保藏的pCMV-ASFV-p72 質(zhì)粒，將該質(zhì)粒序列信息在NCBI 官網(wǎng)上進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定保守序列。將ASFVp72基因保守序列導(dǎo)入LAMP 引物在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V5，設(shè)計(jì)并篩選出一組LAMP 引物，引物序列信息見表1。引物擴(kuò)增核心區(qū)域167 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司（長(zhǎng)沙）合成。

表1 LAMP 引物序列信息

1.4 方法

Bst 3.0 DNA 聚合酶使用說明書推薦的LAMP 反應(yīng)體系各成分終濃度為1×等溫?cái)U(kuò)增緩沖液Ⅱ（含2 mmol/L MgSO4）、6 mmol/L MgSO4、1.4 mmol/L dNTPs、1.6 μmol/L FIP、1.6 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、320 U/mL Bst 3.0 DNA 聚合酶、模板、ddH2O。以該體系為基礎(chǔ)，以pCMV-ASFV-p72質(zhì)粒為模板，ddH2O 為陰性對(duì)照，采取單因素試驗(yàn)，對(duì)反應(yīng)溫度、甜菜堿濃度、Mg2+濃度、dNTPs 濃度、Bst 3.0 DNA 聚合酶濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，使用20×鈣黃綠素-MnCl2顯色液（含1 mmol/L 鈣黃綠素、10 mmol/L MnCl2）進(jìn)行顯色，建立可視化LAMP 檢測(cè)方法。

1.4.1 反應(yīng)條件優(yōu)化 受梯度PCR 儀溫度設(shè)置程序限制，無法以1 ℃為梯度設(shè)置溫度梯度，因此設(shè)置的 溫 度 梯 度 為63.0、64.2、64.9、66.0、67.0、68.3、69.0 ℃；甜菜堿終濃度梯度設(shè)置為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mol/L；Mg2+的終濃度梯度設(shè)置為2、4、6、8、10、12 mmol/L；dNTPs 的終濃度梯度設(shè)置為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mmol/L；Bst 3.0 DNA聚合酶終濃度梯度設(shè)置為80、160、240、320、400、480 U/mL，反應(yīng)結(jié)束后4 ℃冷卻5 min，2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

1.4.2 LAMP 體系靈敏度試驗(yàn) 為檢測(cè)LAMP 可視化檢測(cè)方法的靈敏度，將pCMV-ASFV-p72 質(zhì)粒稀釋至107、106、105、104、103拷貝/μL 的模板溶液，加入優(yōu)化后的LAMP體系至106、105、104、103、102拷貝/μL，使用20×鈣黃綠素-MnCl2顯色液（含1 mmol/L 鈣黃綠素、10 mmol/L MnCl2）進(jìn)行顯色，檢測(cè)體系靈敏度。

1.4.3 LAMP 體系特異性試驗(yàn) 以實(shí)驗(yàn)室保存的分別含有ASFV p72、ASFV p54、ASFV p30、乙腦病毒（JEV）NS1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）N蛋白和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）N 蛋白編碼基因的質(zhì)粒為模板，加入優(yōu)化后的LAMP 體系，使用20×鈣黃綠素- MnCl2顯色液進(jìn)行顯色，檢測(cè)LAMP 體系特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

如圖1 所示，綜合電泳條帶亮度及各條帶濃度比例分析可知，LAMP 反應(yīng)的最佳溫度為67.0 ℃，LAMP 反應(yīng)體系的最佳甜菜堿終濃度為1.25 mol/L，最佳Mg2+終濃度為8 mmol/L，最佳dNTPs 終濃度為1.25 mmol/L，最佳Bst 3.0 DNA 聚合酶終濃度為320 U/mL。

圖1 反應(yīng)條件優(yōu)化

綜上所述，優(yōu)化后的LAMP 反應(yīng)體系各成分終濃度為1×等溫?cái)U(kuò)增緩沖液Ⅱ（含2 mmol/L MgSO4）、6 mol/L MgSO4、1.25 mol/L 甜 菜 堿、1.25 mmol/L dNTPs、1.6 μmol/L FIP、1.6 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、320 U/mL Bst 3.0 DNA 聚合酶、1×鈣黃綠素-MnCl2顯色液、模板、ddH2O。

2.2 LAMP 體系的靈敏度

如圖2 所示，當(dāng)質(zhì)粒模板濃度不低于103拷貝/μL 時(shí)，肉眼能夠觀察到體系發(fā)出的綠色熒光；當(dāng)質(zhì)粒模板濃度低于103拷貝/μL 時(shí)，肉眼不能觀察到體系發(fā)出的綠色熒光。因此，優(yōu)化后的LAMP 可視化檢測(cè)方法靈敏度為103拷貝/μL 模板。

圖2 靈敏度檢測(cè)

2.3 LAMP 體系的特異性

如圖3 所示，優(yōu)化后的LAMP 可視化檢測(cè)方法能成功檢測(cè)出ASFVp72基因，而對(duì)ASFVp54基因、ASFVp30基 因、JEVNS1基 因、PRRSVN基 因、PEDVN基因等病毒基因無顯色反應(yīng)，具有良好的特異性。

圖3 特異性檢測(cè)

3 小結(jié)與討論

非洲豬瘟是由非ASFV 引起的一種高傳染性、高致死率的豬烈性傳染病［1，8］。2020 年8 月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《非洲豬瘟常態(tài)化防控技術(shù)指南（試行版）》指出，非洲豬瘟的防控形勢(shì)依然復(fù)雜嚴(yán)峻。一是境外疫情輸入風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)存在。二是病毒分布廣，沒有明顯的地區(qū)、季節(jié)差異，并已在部分野豬群中定殖，根除難度進(jìn)一步加大。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的數(shù)據(jù)顯示，與2017 年相比，2020 年底生豬出欄頭數(shù)減少1.75 億頭，同比減少24.93%；豬肉產(chǎn)量減少0.13 億t，同比減少24.56%，豬肉價(jià)格也因此一直高于非洲豬瘟疫情發(fā)生前。因此建立靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低廉、操作簡(jiǎn)單的ASFV 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理疫病，對(duì)于防控非洲豬瘟至關(guān)重要。

LAMP 技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單且鑒定便捷及時(shí)而受到研究人員青睞，目前已成功將該技術(shù)用于檢測(cè)鑒定各類病原微生物、寄生蟲、轉(zhuǎn)基因成分、腫瘤、胚胎性別、食品過敏原等［9-11］。在針對(duì)ASFV 的檢測(cè)方面，劉桂榮［12］針對(duì)ASFV 的B646L、E183L基因建立實(shí)時(shí)熒光LAMP 每管可檢測(cè)出40 拷貝、分子信標(biāo)LAMP 每管可檢測(cè)出500 拷貝；王林等［13］依據(jù)商品化的熒光目視檢測(cè)試劑盒建立針對(duì)p72基因建立的實(shí)時(shí)熒光LAMP 快速檢測(cè)方法靈敏度為10 拷貝/μL；楊吉飛等［6］建立的可以檢測(cè)到2 fg 的pGEM-T-vp72-E70 重組質(zhì)粒，但沒有進(jìn)行可視化判定；韋瑩華等［14］建立的Real-time LAMP 可在30 min 內(nèi)檢測(cè)低至100 拷貝/μL 的重組質(zhì)粒；市面上部分qPCR 試劑盒靈敏度也在10～102拷貝/μL［15］。而本試驗(yàn)建立的LAMP 可視化檢測(cè)方法可在60 min 內(nèi)檢測(cè)低至103拷貝/μL 的重組質(zhì)粒，與常規(guī)PCR 的靈敏度持平或略微提高，進(jìn)一步電泳結(jié)果表明，102拷貝/μL 的重組質(zhì)粒能檢測(cè)到但不足以進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間能進(jìn)行顯色反應(yīng)。本試驗(yàn)采用的Bst 3.0 DNA 聚合酶不僅具有DNA 聚合酶活性，也具有高逆轉(zhuǎn)錄酶活性，能進(jìn)行RT-LAMP 擴(kuò)增，也能在樣本不純的情況下進(jìn)行擴(kuò)增；高彥萍等［16］使用Bst 3.0 DNA 聚合酶實(shí)現(xiàn)對(duì)馬鈴薯卷葉病毒的RT-LAMP 檢測(cè)；Silva 等［17，18］使用Bst 3.0 DNA 聚合酶實(shí)現(xiàn)對(duì)寨卡病毒的RT-LAMP 檢測(cè)，并證明RNA 酶抑制劑不影響B(tài)st 3.0 DNA 聚合酶活性；因此本試驗(yàn)建立的LAMP 可視化檢測(cè)方法不僅能夠檢測(cè)ASFV 基因組中的p72 序列，也能檢測(cè)p72的mRNA，間接地提高了臨床檢測(cè)的靈敏度；考慮到質(zhì)粒超螺旋構(gòu)象與ASFV 基因組線性構(gòu)象的差別，本試驗(yàn)建立的LAMP 可視化檢測(cè)方法能適應(yīng)基層和現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)要求。

綜上所述，本試驗(yàn)基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)，根據(jù)非洲豬瘟病毒p72基因保守序列設(shè)計(jì)一組LAMP 引物，采取單因素試驗(yàn)對(duì)LAMP 體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以鈣黃綠素-MnCl2顯色液進(jìn)行可視化判定，靈敏度和特異性試驗(yàn)表明建立的LAMP 可視化檢測(cè)方法具有很好的靈敏度和特異性。該方法較熒光定量PCR、ELISA 等檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)的儀器要求更低，僅需一個(gè)恒溫水浴鍋，反應(yīng)時(shí)間更短，人員培訓(xùn)更簡(jiǎn)單，適合豬場(chǎng)和農(nóng)戶的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。