王紫璇, 徐芷蕙, 黃曉薇, 于旭東, 蔡澤坪*, 羅佳佳, 李世東

菠蘿蜜白化突變體葉片表皮形態(tài)研究

王紫璇1, 徐芷蕙1, 黃曉薇1, 于旭東1, 蔡澤坪1*, 羅佳佳2,3, 李世東1

(1. 海南大學(xué)林學(xué)院，熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海口 571101; 3. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，?？?570228)

為探究木本植物白化突變體葉片表皮形態(tài)的變化，在掃描電鏡下觀測了菠蘿蜜()白化突變體(AAS)和正常(CK)幼苗葉片的表皮細(xì)胞和氣孔器，對MAP65家族蛋白構(gòu)建了進(jìn)化樹，并分析了基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明，AAS表皮細(xì)胞和氣孔器的大小、形態(tài)均發(fā)生較大變化。與CK相比，AAS表皮細(xì)胞的周長、面積較小，密度較大，凸出數(shù)量和長度均減少，氣孔器較小且大小不一。下表皮小細(xì)胞和異常氣孔器的數(shù)量在AAS中大幅增加。MAP65家族成員大部分基因在AAS中下調(diào)表達(dá)。因此，推測菠蘿蜜白化突變體的發(fā)生可能與基因表達(dá)有關(guān)。

菠蘿蜜；白化突變體；葉；表皮細(xì)胞；氣孔器；基因表達(dá)

葉片表皮是調(diào)控蒸騰作用的重要組成成分，同時(shí)也是植物抵御生物和非生物入侵的第一道防線。表皮細(xì)胞和氣孔器在保護(hù)植株、調(diào)節(jié)光合和呼吸作用等多種生理過程中發(fā)揮著重要的作用[1]。大多數(shù)雙子葉植物表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁會形成凸出(lobe)，從而使表皮細(xì)胞相互嵌合，緊密排列[2]。雙子葉植物氣孔器一般由2個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞構(gòu)成，通過控制氣孔器的開閉來調(diào)控與外界氣體的交換[3]。已對很多植物的表皮形態(tài)進(jìn)行了研究[4–7]，如擬南芥()、水稻()、玉米()、小麥()、野丁香()等，而菠蘿蜜()的表皮形態(tài)研究還較少。

植物葉片是進(jìn)行光合作用的主要器官，光對葉表皮形態(tài)具有一定的調(diào)控作用。有研究表明，強(qiáng)光環(huán)境下葉表皮細(xì)胞的體積會減小[8]。Thomas等[9]報(bào)道氣孔的密度隨光照強(qiáng)度的增加而增加。Kang等[10]的研究表明，在藍(lán)光和紅光下隱花色素(cryptochrome, CRY)和光敏色素B (phytochrome B, phyB)功能缺失突變體中氣孔的發(fā)育受到抑制；在遠(yuǎn)紅光下光敏色素A (phyA)缺失突變體中氣孔器幾乎不發(fā)育。

MAPs (microtubule associated proteins)是一類與微管結(jié)合的蛋白。MAP65s對維持微管穩(wěn)定以及微管成束起關(guān)鍵作用。MAP65-1可通過抑制與微管切斷酶KTN1 (katanin)的結(jié)合，保護(hù)微管免受切斷[11]。微管排布會影響細(xì)胞的生長過程。當(dāng)微管平行聚集成束并橫向排列時(shí)，局部表皮細(xì)胞的生長會受到抑制，從而使表皮細(xì)胞形成凹陷[12]。同時(shí)，微管還可通過調(diào)節(jié)纖維絲的長度影響細(xì)胞生長，當(dāng)微管正常排布時(shí)，纖維絲較長，抑制細(xì)胞向纖維絲平行的方向生長[13]。

菠蘿蜜是一種常綠木本植物，具有較高食用、觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[14]。白化突變植株光合色素缺失, 從而使得葉片發(fā)育異常[15]。同時(shí)葉色白化突變體也是一類難得的材料，可發(fā)掘其觀賞價(jià)值[16]。目前有關(guān)白化現(xiàn)象對表皮形態(tài)影響方面的研究較少，對白化葉片表皮形態(tài)及其形成機(jī)制進(jìn)行研究，可為植物細(xì)胞形態(tài)建成、分子調(diào)控機(jī)制和植株園藝性狀改良提供重要依據(jù)[17]。

本文在掃描電鏡下觀察了菠蘿蜜白化突變體(AAS)和正常(CK)幼苗葉片的表皮細(xì)胞和氣孔器變化，基于MAP65家族蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹，并對MAP65家族基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為探究木本植物白化突變體葉片表皮形態(tài)變化機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料種植于海南大學(xué)儋州校區(qū)。菠蘿蜜()白化突變體(albino mutant, AAS)和作為對照(CK)的正常幼苗均為實(shí)生苗，來源于同一棵帶有隱性白化基因的菠蘿蜜成年母株，取幼苗成熟葉片為材料(圖1)。

1.2 方法

種子萌發(fā)與幼苗的栽種 采用謝柳青等[18]的方法，選取發(fā)育良好的種子，點(diǎn)播于經(jīng)滅菌處理的基質(zhì)(營養(yǎng)土∶蛭石=3∶1)中，在(32±3) ℃、光照強(qiáng)度約1 440mol/(m2·s)的環(huán)境下栽種，每天定時(shí)澆水和管理。

掃描電鏡觀察 幼苗萌發(fā)第15天用鑷子取莖尖向下第3枚葉片, 觀測面向上置于電鏡載物臺,并用液氮速凍約3 min。在掃描電子顯微鏡下對葉片上下表皮進(jìn)行觀察并拍照。

表皮細(xì)胞形態(tài) 表皮細(xì)胞測量周長、面積和密度。周長為單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞壁長度，面積為細(xì)胞壁圍成的面積。此外，為反映AAS與CK表皮細(xì)胞的嵌合程度，參照Armour等[19]的方法對相鄰2個(gè)表皮細(xì)胞交界點(diǎn)的直線距離和細(xì)胞壁長度進(jìn)行測量，并統(tǒng)計(jì)凸出數(shù)量，重復(fù)大于100次; 表皮細(xì)胞的密度為單位面積的表皮細(xì)胞個(gè)數(shù)，重復(fù)3次。小細(xì)胞是指小于平均面積60%的細(xì)胞，小細(xì)胞密度為單位面積內(nèi)小細(xì)胞的個(gè)數(shù)，重復(fù)3次。

氣孔器形態(tài) 氣孔器測量長度、寬度、面積、周長、密度和氣孔指數(shù)。長度和寬度分別為氣孔器的長軸和短軸長；周長為2個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞外圍細(xì)胞壁圍成的曲線長；面積為2個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞外圍曲邊圍成的面積，重復(fù)大于100次。氣孔指數(shù)=氣孔器個(gè)數(shù)/ (氣孔器個(gè)數(shù)+表皮細(xì)胞個(gè)數(shù))，重復(fù)3次。形態(tài)異常的氣孔器為面積不足平均面積60%的氣孔器，計(jì)算異常氣孔器占全部氣孔器的比例，重復(fù)3次。

保衛(wèi)細(xì)胞形態(tài) 保衛(wèi)細(xì)胞測量長度、寬度、周長和面積。寬度為氣孔器橫向邊緣切點(diǎn)到氣孔中軸線的距離；長度為保衛(wèi)細(xì)胞縱向展平時(shí)兩端點(diǎn)的距離；周長為保衛(wèi)細(xì)胞外圍曲邊與氣孔中軸線圍成的曲線長；面積為保衛(wèi)細(xì)胞外圍曲邊與氣孔中軸線圍成的面積，重復(fù)大于100次。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析

采用Image J軟件對葉片表皮細(xì)胞和氣孔器進(jìn)行測量。采用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，以<0.05表示差異顯著,< 0.01表示差異極顯著，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

1.4 MAP65家族基因的表達(dá)分析

本研究前期已完成菠蘿蜜轉(zhuǎn)錄組測序(PRJNA 579273)，從擬南芥數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis. org/)中獲得AtMAP65家族成員的氨基酸序列，使用BioEdit軟件，通過本地Blast篩選出與擬南芥AtMAP65-1 (AT5G55230)同源的蛋白，并在擬南芥數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST驗(yàn)證。從AAS葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲取菠蘿蜜MAP65家族基因表達(dá)量。并通過在線網(wǎng)站Expression Heatmapper (http://www2.heatmapper.ca/ expression/)進(jìn)行可視化，標(biāo)準(zhǔn)化方法為Row Z-score標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

用Clustal W將菠蘿蜜和擬南芥MAP65的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，采用MEGA 6.05軟件以鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹，設(shè)置步長為1 000，模式為Poisson model，缺口設(shè)為Pairwise deletion進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果和分析

2.1 表皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

CK幼苗的葉片顏色為綠色，而AAS為白色(圖1)。AAS和CK的上表皮細(xì)胞周長分別是347.25和923.67m，AAS是CK的37.59%，差異極顯著；AAS和CK下表皮細(xì)胞周長分別是146.18和524.09m, AAS是CK的27.89%，差異極顯著(圖2, 圖3)。AAS和CK上表皮細(xì)胞面積分別是85.03和202.73m2, AAS是CK的41.94%，差異極顯著；AAS和CK下表皮細(xì)胞面積分別是54.44和128.00m2，AAS是CK的42.53%，差異極顯著(圖3)，這表明光合色素缺失嚴(yán)重抑制葉表皮細(xì)胞的大小。

AAS和CK上表皮細(xì)胞密度分別是2 816.98和1 077.77 num./mm2，AAS是CK的2.61倍，差異極顯著；AAS和CK下表皮細(xì)胞密度分別是6 458.43和2 008.03 num./mm2，AAS是CK的3.22倍，差異極顯著(圖3)，這表明光合色素缺失使葉表皮細(xì)胞的密度成倍增加。

圖1 菠蘿蜜正常幼苗(A)和白化突變體(B)植株形態(tài)

圖3 葉片表皮細(xì)胞的形態(tài)特性。1: CK上表皮細(xì)胞; 2: AAS上表皮細(xì)胞; 3: CK下表皮細(xì)胞; 4: AAS下表皮細(xì)胞。柱上不同大小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。

氣孔器僅分布于葉片的下表皮(圖2)。與CK相比，AAS上、下表皮細(xì)胞的凸出較少，分別是CK的60.82%和29.50%，差異極顯著(圖3)。AAS的上、下表皮相鄰2個(gè)細(xì)胞交界點(diǎn)直線距離的中位數(shù)分別是11.55和6.62m，是CK的57.43%和46.95%; 相鄰2個(gè)細(xì)胞交界點(diǎn)的細(xì)胞壁長度分別是14.22和7.40m，是CK的39.38%和52.48% (圖4: A, B)。這表明光合色素缺失使AAS的上、下表皮細(xì)胞凸出減少。

圖4 相鄰2個(gè)細(xì)胞交界點(diǎn)間直線距離(A)和細(xì)胞壁長度(B)及其線性關(guān)系(C: 上表皮, D:下表皮)。1: CK上表皮細(xì)胞; 2: AAS上表皮細(xì)胞; 3: CK下表皮細(xì)胞; 4: AAS下表皮細(xì)胞。

在葉片的上、下表皮中，AAS和CK的相鄰2個(gè)細(xì)胞交界點(diǎn)間的直線距離與細(xì)胞長度都呈正相關(guān)。線性回歸分析表明，CK上表皮的回歸系數(shù)是1.86, AAS為1.33，是CK的71.50%；而CK下表皮的回歸系數(shù)是1.97，AAS為1.11，是CK的56.35% (圖4: C, D)，這表明受光合色素缺失的影響，AAS上、下表皮細(xì)胞間的嵌合程度降低。

AAS下表皮的小細(xì)胞較多，CK小細(xì)胞的密度為19.15 num./mm2，AAS為279.38 num./mm2，是CK的14.59倍，差異極顯著。

2.2 氣孔器形態(tài)

AAS和CK的氣孔器均分布于葉片下表皮。CK氣孔器的長度、寬度、周長和面積分別為23.22、18.48、64.90m和333.67m2，而AAS分別為20.16、17.50、58.81m和292.67m2，分別是CK的86.82%、94.70%、90.62%和87.71%，差異達(dá)極顯著或顯著水平。此外，AAS周長和面積的變異系數(shù)分別為15.18%和29.78%，是CK的2.60和3.09倍。CK的氣孔密度為390.58 num./mm2, AAS為1 044.92 num./mm2,是CK的2.68倍，達(dá)極顯著差異。CK的氣孔指數(shù)為21.58%，AAS的為20.63%, 無顯著差異(表1)。

CK保衛(wèi)細(xì)胞的長度、寬度、周長和面積分別是23.31、8.95、52.88m和160.35m2，AAS分別為20.46、8.60、48.28m和144.00m2，分別是CK的87.77%、96.09%、91.30%和89.80%，差異均達(dá)極顯著或顯著水平。AAS保衛(wèi)細(xì)胞周長和面積的變異系數(shù)分別為15.76%和29.93%，是CK的2.89和2.87倍(表2)。這表明光合色素缺失會使AAS的氣孔器和保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)育異常，導(dǎo)致氣孔器和保衛(wèi)細(xì)胞大小懸殊，分布不均。

AAS形態(tài)異常氣孔器的比例為6.19%；而CK則沒有(表1)，表明光合色素缺失使部分氣孔器的形態(tài)異常。

2.3 MAP65家族基因分析

為探究基因表達(dá)對AAS表皮細(xì)胞的影響，選擇與微管蛋白相關(guān)的MAP65家族進(jìn)行分析。本研究與MAP65家族相關(guān)基因在菠蘿蜜中共有20個(gè)，其編碼的蛋白中CL1677.C5、CL1677.C14、CL1677.C13、CL1677.C4、CL1677.C2、CL1677.C12、CL1677.C7、CL1677.C10與AtMAP65-8、AtMAP65-5聚于一支，基因在AAS中下調(diào)表達(dá)(圖5)。CL1465.C1、CL1465.C3、CL1465.C4與AtMAP65-2為直系同源蛋白。在AAS中下調(diào)表達(dá)，而和上調(diào)表達(dá)。CL205.C4、CL205.C3、CL205.C5、CL205.C6、CL205.C8、CL205.C7、CL205.C1與AtMAP65-6、AtMAP65-7聚于一大支。除、和在AAS中上調(diào)表達(dá)，其余均下調(diào)表達(dá)。與為直系同源基因，UG41335與AtMAP65-4的親緣關(guān)系較近, 且其基因均在AAS中上調(diào)表達(dá)。這表明菠蘿蜜MAP65家族成員大部分基因在AAS中下調(diào)表達(dá)。

表1 氣孔器的形態(tài)

*:<0.05; **:<0.01。

表2 保衛(wèi)細(xì)胞比較

*:<0.05; **:<0.01.

圖5 MAP65家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(左)及基因表達(dá)分析(右)。數(shù)值表示分支的置信度，藍(lán)色圓點(diǎn)為菠蘿蜜蛋白。

3 結(jié)論和討論

對于雙子葉植物而言，表皮細(xì)胞的發(fā)育經(jīng)歷了3個(gè)階段，即多邊形細(xì)胞的產(chǎn)生、細(xì)胞壁的延伸以及凸出的形成[20]。在這個(gè)過程中，細(xì)胞面積的增大依賴于細(xì)胞的膨脹和凸出的延伸[19]。本研究中, AAS的上下表皮細(xì)胞在大小、形態(tài)上均與CK有顯著差異，表現(xiàn)為細(xì)胞的周長和面積減小，細(xì)胞密度增大，細(xì)胞壁的凸出數(shù)減少，相鄰2個(gè)細(xì)胞交界點(diǎn)的直線距離和細(xì)胞壁長度較短，表明AAS的上、下表皮細(xì)胞間的嵌合程度降低。由此可見，AAS表皮細(xì)胞的生長和發(fā)育受到了抑制。韓冰等[21]研究的擬南芥突變體表皮細(xì)胞形態(tài)與本研究結(jié)果相似。其認(rèn)為植物免疫反應(yīng)可以調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞的形態(tài)建成，因此可進(jìn)一步研究AAS和CK免疫反應(yīng)的異同。

無論是單子葉還是雙子葉植物，通常氣孔排布時(shí)兩個(gè)氣孔器間至少間隔1個(gè)表皮細(xì)胞，稱為“單細(xì)胞間距規(guī)則”[22]。排布異常的氣孔器會出現(xiàn)2個(gè)或多個(gè)氣孔直接接觸的情況，中間無表皮細(xì)胞間隔，稱為氣孔簇[23]。付影等[24]使用光學(xué)顯微鏡對白化菠蘿蜜的葉表皮細(xì)胞及氣孔器臨時(shí)裝片進(jìn)行觀察，由于圖像解析度的限制，2個(gè)氣孔器直接接觸被誤認(rèn)為氣孔簇，但本研究在電子顯微鏡下觀察2個(gè)氣孔器并未直接接觸，并不構(gòu)成氣孔簇。

植物的細(xì)胞形態(tài)建成需要微管微絲的參與[25–26], 其中微絲與凸出的延伸有關(guān)，微管與細(xì)胞生長點(diǎn)的構(gòu)建有關(guān)，微絲形成受阻會導(dǎo)致細(xì)胞壁變得平滑, 凸出減少；微管的異常則會導(dǎo)致細(xì)胞不正常膨脹, 趨近于圓形[21]，由此推測，葉色白化植株微管微絲的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了改變。MAP65對維持微管穩(wěn)定起關(guān)鍵作用[27]，有研究表明AtMAP65-1和AtMAP65- 5蛋白能促進(jìn)微管捆綁成束[28]。微管聚集成束會抑制表皮細(xì)胞局部生長，形成細(xì)胞凹陷[12]。菠蘿蜜中與AtMAP65-1聚于同一分支的3個(gè)蛋白，對應(yīng)的有2個(gè)基因在AAS中上調(diào)表達(dá)，1個(gè)下調(diào)表達(dá)；與AtMAP65-5聚于同一分支的8個(gè)蛋白，其基因在AAS中下調(diào)表達(dá)，由此推測，AAS中這些基因的表達(dá)變化可能是造成菠蘿蜜葉上、下表皮細(xì)胞凸出數(shù)量降低的原因。

AAS的氣孔器和保衛(wèi)細(xì)胞形態(tài)與CK有較大差異，AAS氣孔器和保衛(wèi)細(xì)胞的長、寬、周長和面積均較小，氣孔器密度增大，且AAS的氣孔器大小不一，而CK相對均一。Kim等[29]首次報(bào)道油菜素甾醇(brassinosteroid, BR)突變體中植物的氣孔密度增加，而用BR處理發(fā)育葉片后氣孔密度降低，由此推測，可能是由于AAS的BR合成異常導(dǎo)致氣孔的密度增加。同時(shí)，AAS中小細(xì)胞密度和形態(tài)異常氣孔器比例均與CK呈極顯著差異。有研究表明, 甾醇合成異常會導(dǎo)致表皮細(xì)胞及氣孔器的發(fā)育改變[30]，因此，對甾醇相關(guān)合成酶基因的表達(dá)情況還有待于深入研究。

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Leaf Epidermal Morphology of Albino Mutant of

WANG Zixuan1, XU Zhihui1, HUANG Xiaowei1, YU Xudong1, CAI Zeping1*, LUO Jiajia2,3, LI Shidong1

(1.Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants, Ministry of Education, College of Forestry, Hainan University,Haikou 570228, China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101, China; 3. College of Tropical Crops, Hainan University,Haikou 570228, China)

To investigate the changes of leaf epidermal morphology in albino mutants of woody plants, the epidermis cells and stomatal apparatus on leaves of albino mutant (AAS) and normal (CK)seedlings were observed under scanning electron microscopy. The phylogenetic tree was constructed based on MAP65 family proteins, and the expression ofwas analyzed. The results showed that the size and morphology of epidermal cells and stomatal apparatus of AAS were changed greatly. Compared with CK, epidermal cells of AAS had smaller perimeter and area, higher density, less lobe number, shorter lobe length and smaller stomatal apparatus. The number of small cells and abnormal stomatal apparatus in lower epidermis increased significantly in AAS. Most genes of MAP65 family members were down regulated in AAS. Therefore, it was speculated that the occurrence of AAS might be related to the expression ofgene.

; Albino mutant; Leaf; Epidermal cell; Stomatal apparatus; Gene expression

10.11926/jtsb.4447

2021-05-12

2021-06-12

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(319MS017); 海南大學(xué)科研啟動基金項(xiàng)目(kyqd1620); 海南大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(SA2000008501, SA2100001230)資助

This work was supported by the Project for Natural Science in Hainan (Grant No. 319MS017); the Project for Scientific Research Startup of Hainan University (Grant No. kyqd1620), and the Project for National Innovation and Entrepreneurship Training of Hainan University (Grant No. SA2000008501, SA2100001230).

王紫璇(2000～ )，女，本科，研究方向?yàn)榱謱W(xué)、森林培育。E-mail: 18005505432@126.com

. E-mail: 992995@hainanu.edu.cn