尹廣鹍，辛霞，張金梅，陳曉玲，劉運(yùn)霞，何娟娟，黃雪琦，盧新雄

種質(zhì)庫種質(zhì)安全保存理論研究的進(jìn)展與展望

尹廣鹍，辛霞，張金梅，陳曉玲，劉運(yùn)霞，何娟娟，黃雪琦，盧新雄

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081

安全保存是作物種質(zhì)資源高水平保護(hù)的核心和可持續(xù)利用的前提。低溫種質(zhì)庫是作物種質(zhì)資源最主要的保存方式。延長種質(zhì)保存壽命、維持種質(zhì)遺傳完整性和防止種質(zhì)生活力意外喪失一直是種質(zhì)安全保存的研究難點(diǎn)和熱點(diǎn)。文中對近百年來種質(zhì)庫保存種質(zhì)的研究歷史進(jìn)行了系統(tǒng)整理，指出：（1）種子低含水量和低貯藏溫度是延長種子保存壽命的關(guān)鍵因素，由此形成的雙低理論是種質(zhì)庫保存種質(zhì)的理論基礎(chǔ)；（2）庫存種子生活力下降存在衰老拐點(diǎn)特性，拐點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)是維持種質(zhì)遺傳完整性的低限，拐點(diǎn)理論是種質(zhì)安全保存的理論基礎(chǔ)；（3）已保存的種質(zhì)在物理空間或保存方式上再備份保存一份，形成資源復(fù)份保存機(jī)制，復(fù)份保存機(jī)制是防止意外事故而導(dǎo)致資源無法挽回?fù)p失的保障措施。本文重點(diǎn)闡述了雙低理論、拐點(diǎn)理論和資源復(fù)份保存機(jī)制的內(nèi)涵、意義及其實(shí)踐指導(dǎo)作用，以期進(jìn)一步推動(dòng)種質(zhì)資源安全保存理論的發(fā)展。

種質(zhì)庫、安全保存、雙低理論、拐點(diǎn)理論、復(fù)份保存機(jī)制

0 引言

前蘇聯(lián)作物育種學(xué)家瓦維洛夫和美國一些科學(xué)家的先驅(qū)性工作[1]，使人們認(rèn)識(shí)到豐富的種質(zhì)材料對于育種和科學(xué)研究的重要性，并從世界范圍內(nèi)收集了大量的種子類作物種質(zhì)資源。當(dāng)時(shí)的全蘇作物栽培研究所（現(xiàn)稱瓦維洛夫全俄植物科學(xué)研究所）和美國的4個(gè)區(qū)域作物引種站，均收集到成千上萬份種質(zhì)材料。但由于在室溫條件下保存，種子生活力下降很快，導(dǎo)致當(dāng)時(shí)收集到的資源損失嚴(yán)重。如在20世紀(jì)40年代，美國區(qū)域作物引種站發(fā)現(xiàn)其收集貯藏的16萬余份種子樣品，僅有5%—10%樣品能在田間出苗，為此引種站利用空調(diào)降溫技術(shù)建設(shè)低溫庫保存種子樣品[2]。1958年美國在科羅拉多州的柯林斯堡建成了世界上第一座國家級低溫種質(zhì)庫。20世紀(jì)70年代以后，俄羅斯、中國、印度、德國、日本、韓國、巴西等相繼建立了國家級低溫種質(zhì)庫，保存收集到的作物種質(zhì)資源。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，全球非原生境保護(hù)的740萬份資源中，90%是以種子方式保存在1 300余座低溫種質(zhì)庫中[3]。至2020年底，以種子形式收集保存資源最多的國家是美國、中國和印度，保存資源分別為56萬、45.3萬和43萬份。

種質(zhì)庫保存種質(zhì)資源是目前最主要的保存方式，可顯著延長種子壽命，減少監(jiān)測和更新次數(shù)，避免頻繁更新而導(dǎo)致遺傳完整性的喪失。但資源入種質(zhì)庫保存并不是一勞永逸，隨著保存的作物種質(zhì)資源種類和數(shù)量劇增，以及保存時(shí)間延長，保存種質(zhì)的安全性問題日益突出。一是庫存種質(zhì)生活力下降，中國國家?guī)旆N子生活力監(jiān)測結(jié)果表明，保存10—12年，種子發(fā)芽率降至70%以下占比0.51%，而保存20—23年該比例增加到1.1%[4-5]。二是缺乏對庫存種子生活力喪失特性的了解和有效的監(jiān)測預(yù)警技術(shù)，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)生活力過低的種質(zhì)材料。美國國家?guī)鞕z測了保存16—81年的4.2萬份種子的生活力，發(fā)現(xiàn)其平均發(fā)芽率從初始的91%降低到58%。其中，保存34—36年的大豆和花生種子平均發(fā)芽率已從初始的90%以上降至21%以下[6]。甚至有報(bào)道指出，個(gè)別種質(zhì)庫多達(dá)50%的原始種質(zhì)樣品已喪失生活力或更新后發(fā)生了遺傳漂變[7]。

因此，探究延長種質(zhì)保存壽命、維持種質(zhì)遺傳完整性和防止種質(zhì)生活力意外喪失一直是種質(zhì)安全保存的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。經(jīng)過近百年的發(fā)展，延長種質(zhì)壽命的雙低理論、安全保存拐點(diǎn)理論和資源復(fù)份保存機(jī)制，成為低溫庫種質(zhì)資源安全保存的科學(xué)基礎(chǔ)理論。本文中將重點(diǎn)闡述其理論內(nèi)涵、意義及其實(shí)踐指導(dǎo)作用，以期進(jìn)一步推動(dòng)種質(zhì)資源安全保存理論和技術(shù)的發(fā)展。

1 延長種質(zhì)壽命的雙低理論

1.1 雙低理論的內(nèi)涵

著名種子生理學(xué)家HARRINGTON[8]首次提出延長種子壽命的雙低理論：即種子含水量每降低1%（含水量適應(yīng)范圍4%—14%）或貯藏溫度每降低5℃（貯藏溫度適應(yīng)范圍0—50℃），種子壽命可延長1倍。其實(shí)古代保存良種時(shí)，會(huì)把種子貯藏在壇罐中，壇罐的底部和上部鋪上石灰并存放于地窖中，其原理是利用相對低的種子含水量和貯藏溫度以延長種子保存壽命。20世紀(jì)40年代，美國區(qū)域作物引種站開始建設(shè)低溫冷庫以保存種質(zhì)材料，取得了良好的保存效果。隨后美國等國家采用這一技術(shù)建設(shè)國家級低溫種質(zhì)庫以保存大批量收集的種質(zhì)資源[1]。在保存溫度恒定的條件下，只有在適宜的含水量下，種子壽命才能得到最大程度的延長。ROBERTS[9]和Ellis等[10]依據(jù)種子貯藏習(xí)性將種子劃分為正常性、頑拗性和中間性等不同類型，雙低理論只適應(yīng)于正常性種子，而大多數(shù)農(nóng)作物種子的貯藏習(xí)性是正常性的，因此，低溫種質(zhì)庫能夠成為這類種質(zhì)資源的保存主體。椰子、芒果等熱帶經(jīng)濟(jì)作物種子屬于頑拗性種子，具有不耐干燥脫水和不耐低溫的貯藏習(xí)性，不適于采用低溫種質(zhì)庫方式進(jìn)行保存。VERTUCCI等[11-12]提出“種子適宜含水量”保存，進(jìn)一步完善了雙低理論，主要包括每種作物或物種種子的適宜含水量是在溫度20℃、相對濕度10%—15%的條件下達(dá)到的平衡含水量，換算重量百分比的含水量為3%—9%；在種子含水量恒定的條件下，種子壽命與貯藏溫度在一定范圍內(nèi)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即在含水量得到控制的情況下，降低貯藏溫度是延長種子貯藏壽命的關(guān)鍵因素。但當(dāng)溫度低至一定程度時(shí)，若進(jìn)一步降低種子貯藏溫度，則其對種子壽命的影響程度逐漸降低。

FAO/IPGRI依據(jù)雙低理論，提出了種質(zhì)庫長期貯藏標(biāo)準(zhǔn)：種子含水量3%—7%（依作物而定），貯藏溫度為-18℃（可接受最低貯藏溫度為＜0℃），同時(shí)也對每份種質(zhì)保存粒數(shù)、監(jiān)測、更新等指標(biāo)，以及供電、防火等安全措施做出了規(guī)定[13]。該標(biāo)準(zhǔn)的制定有力地推動(dòng)了種質(zhì)庫的建設(shè)，使種質(zhì)庫及其保存種質(zhì)的數(shù)量顯著增加。從20世紀(jì)70年代初期種質(zhì)庫數(shù)量不足10個(gè)、貯存的種質(zhì)數(shù)量50萬份，到1996年全世界1 300多座種質(zhì)庫、保存610萬份種質(zhì)資源（含重復(fù)），其中低溫種質(zhì)庫達(dá)550萬份。

該理論后來繼續(xù)得到不斷完善，即含水量不是越低越好。FAO在2014年制定的《種質(zhì)庫標(biāo)準(zhǔn)》[14]中，推薦種子保存含水量為在溫度5—20℃、相對濕度10%—25%條件下達(dá)到的平衡含水量（含水量一般為3%—9%），而不再推薦以重量百分比表示的含水量。適宜含水量下限值就是干燥極限。因此，沒有必要再進(jìn)一步干燥脫水。干燥脫水過度，對種子貯藏反而有害[10, 15]。在此適宜含水量范圍內(nèi)，降低貯藏溫度則是延長種子貯藏壽命的關(guān)鍵，但并不是越低越好，國際上推薦-18℃和3%—7%含水量作為種子長期貯藏的標(biāo)準(zhǔn)，這是一個(gè)折中的方案，主要原因是難有試驗(yàn)數(shù)據(jù)來證明種子在-30℃或更低溫度下的貯藏壽命比-20℃條件下延長多少，且獲得-20℃貯藏條件的制冷工藝較易實(shí)現(xiàn)且運(yùn)行成本相對較低[10]。

1.2 雙低理論的物理生化基礎(chǔ)

種子含水量和貯藏溫度是影響種子保存壽命的2個(gè)關(guān)鍵因素，當(dāng)種子干燥脫水至相對低的適宜含水量時(shí)，細(xì)胞內(nèi)游離水幾乎被完全去除，細(xì)胞質(zhì)呈一種無定型不平衡的高度黏滯態(tài)，即玻璃態(tài)[16]，此時(shí)分子運(yùn)動(dòng)幾乎停止。對溫度誘導(dǎo)的玻璃化，其發(fā)生點(diǎn)的溫度稱為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（glass transition temperature，g）[17]。低含水量和低溫條件下，細(xì)胞內(nèi)的自由水體積減小，生物組織容易形成很高黏度的玻璃態(tài)，抑制了細(xì)胞內(nèi)有害化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生[18-19]。許多研究證實(shí)種子形成玻璃態(tài)是抑制種子劣變、延長種子壽命的生物物理學(xué)基礎(chǔ)。例如，在高溫高濕條件下，玉米、大豆種子細(xì)胞質(zhì)玻璃態(tài)的消失，導(dǎo)致種子劣變速率急劇增加[20-21]。進(jìn)一步模擬分析表明，種子在含水量為5%— 8%狀態(tài)下長期貯藏時(shí)，玉米、大豆和豌豆種子所需求的長期貯藏臨界溫度均接近或低于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，即在長期庫貯藏條件下（溫度-18℃，含水量5%— 8%），種子的細(xì)胞質(zhì)呈玻璃態(tài)[21]。

種子含水量和貯藏溫度也影響著種子細(xì)胞的分子移動(dòng)性。分子移動(dòng)性是生物組織貯藏穩(wěn)定性的關(guān)鍵因子，分子移動(dòng)性越大，有害反應(yīng)速率越大[22-23]。采用電子順磁共振和動(dòng)態(tài)力學(xué)分析，從力學(xué)角度研究貯藏溫度和種子含水量與種子壽命的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)種子壽命與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分子移動(dòng)性負(fù)相關(guān)，即分子移動(dòng)性最小時(shí)的含水量與種子壽命達(dá)到最大值時(shí)的含水量接近[24-26]。分子遷移率與種子老化速率密切相關(guān)[22-23]，分子遷移動(dòng)力驅(qū)動(dòng)了種子的劣變反應(yīng)，從而導(dǎo)致了種子生活力喪失。利用動(dòng)態(tài)力學(xué)分析研究不同含水量和貯藏溫度條件下種子細(xì)胞的分子移動(dòng)性與種子老化速率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與g相似的α弛豫和種子的老化不相關(guān)（除非在高熱或高濕條件下），但β弛豫與種子的老化相關(guān)，表明通過分析β弛豫，可用來研究探討減緩種子老化的貯藏條件[26]。通過差示掃描量熱法驗(yàn)證溫度對分子移動(dòng)性的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)種子含水量為7%時(shí)，g為28℃[27]，因此，對于低溫庫種質(zhì)保存，當(dāng)保存溫度為-18—4℃時(shí)，種子的含水量沒必要過低[27-28]。種子含水量每降低1%，g值則升高5—10℃。但一些種子含水量降低到一定值后，其生活力反而會(huì)降低[9, 29]。這可能是因?yàn)榧?xì)胞玻璃態(tài)的水屬于結(jié)合水，這些結(jié)合水是細(xì)胞內(nèi)生物結(jié)構(gòu)關(guān)鍵的組成部分[30-31]，移除這些結(jié)合水會(huì)損傷細(xì)胞組成物質(zhì)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)，因而威脅到種子存活，降低了種子生活力[16]。另外，含水量過低時(shí)會(huì)加劇種子老化，其原因可能是細(xì)胞結(jié)合水的脫水傷害抵消了玻璃態(tài)所產(chǎn)生的保護(hù)作用。雖然干燥脫水作用會(huì)使g值上升而形成玻璃態(tài)，從而增強(qiáng)保護(hù)作用；但過度脫水會(huì)引起結(jié)合水的喪失而降低大分子的穩(wěn)定性。對于一些淀粉類作物，過度脫水會(huì)造成種子干燥損傷，導(dǎo)致生活力下降、壽命縮短[32]。種子細(xì)胞質(zhì)玻璃態(tài)中的水是一種可塑劑，可影響g、細(xì)胞質(zhì)黏度和細(xì)胞內(nèi)分子移動(dòng)性[15]。根據(jù)優(yōu)化后的Williams-Landel-Ferry方程，當(dāng)保存溫度＞g時(shí)，種子生活力與-g的關(guān)系可以用來代表種子含水量對種子存活環(huán)境穩(wěn)定性的影響，含水量降低可引起g增加，從而延長種子壽命[21]。

低含水量和低溫條件使酶代謝活動(dòng)處于鈍化狀態(tài)。酶由蛋白質(zhì)組成，具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)。一方面，許多酶（尤其是變構(gòu)酶）的分子結(jié)構(gòu)會(huì)因含水量降低而鈍化或失活；另一方面，種子含水量降低到一定程度時(shí)，底物和輔酶就難以運(yùn)轉(zhuǎn)到酶附近，同時(shí)輔助因子Mg2+、Ca2+、K+、Na+等也不能運(yùn)轉(zhuǎn)到相應(yīng)的部位，即使有催化產(chǎn)物生成，也會(huì)因缺水而影響擴(kuò)散，使后續(xù)反應(yīng)無法進(jìn)行。萵苣種子含水量＞5.7%時(shí)，種子處于非玻璃態(tài)，當(dāng)含水量降低到2.9%—4.8%時(shí)則處于玻璃態(tài)，玻璃態(tài)種子的保存壽命比非玻璃態(tài)種子長。檢測種子代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，玻璃態(tài)種子中依賴酶的代謝活動(dòng)處于鈍化狀態(tài)，其代謝以非酶促反應(yīng)“阿馬道里-美拉德反應(yīng)”為主，終產(chǎn)物主要是醇類、醛類、烷類和酮類等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物；而非玻璃態(tài)種子因細(xì)胞質(zhì)處于液態(tài)，生化反應(yīng)強(qiáng)烈，以糖酵解為主，其終產(chǎn)物主要是甲醇和乙醇等。相對于非玻璃態(tài)，玻璃態(tài)為維持種子生活力創(chuàng)造了最佳生存環(huán)境，既形成了一個(gè)防御系統(tǒng)以防止或減緩氧化損傷，又避免了貯藏蛋白、淀粉、糖類等物質(zhì)的降解，確保種子在吸脹萌發(fā)時(shí)具備能利用的貯藏蛋白，以維持供應(yīng)能量代謝系統(tǒng)的穩(wěn)定，從而使其壽命得到延長。

FAO/IPGRI提出了種質(zhì)貯藏的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，長期貯藏溫度為-18℃，種子含水量為5%—7%，其中大豆為8%[11]。在此保存條件下，種子達(dá)到玻璃化狀態(tài)，分子流動(dòng)性最小，大多數(shù)酶處于鈍化狀態(tài)，生化反應(yīng)進(jìn)行緩慢，因此，可有效延長種子保存壽命。

2 安全保存拐點(diǎn)理論

在低含水量和低溫保存的條件下，種子生活力仍會(huì)喪失，最終導(dǎo)致發(fā)芽能力下降。例如，保存36年的3 635份大豆種子，平均發(fā)芽率從初始的92%降低到21%，保存34年的780份花生種子，平均發(fā)芽率從初始的89%降低到6%，且有部分種質(zhì)資源的種子發(fā)芽率已經(jīng)降至零[6]。中國國家?guī)旆N子生活力監(jiān)測結(jié)果也表明，1.4萬余份種子貯藏20年后，發(fā)芽率降至70%以下的種子占到被監(jiān)測種子的1.1%[5]。此外，種子生活力下降導(dǎo)致種質(zhì)資源的遺傳完整性喪失，甚至有報(bào)道指出個(gè)別種質(zhì)庫經(jīng)更新后，多達(dá)50%的原始種質(zhì)樣品喪失了發(fā)芽能力或發(fā)生了遺傳漂變[7, 33]。因此，如何確保庫存種質(zhì)的安全，即如何避免庫存種質(zhì)出現(xiàn)發(fā)芽率降至過低或?qū)е路N質(zhì)遺傳完整性喪失，是種質(zhì)庫管理者面臨首要課題。盧新雄等[34-35]經(jīng)過30多年研究和實(shí)踐，創(chuàng)立了種質(zhì)安全保存拐點(diǎn)理論，實(shí)現(xiàn)了保存理論的重要突破，為安全保存技術(shù)體系的構(gòu)建提供了重要理論支撐。

2.1 拐點(diǎn)理論的內(nèi)涵

要確保庫存種子的安全保存，首先要了解庫存種子在保存過程中的生活力喪失（存活）規(guī)律。盧新雄等[36]首次報(bào)道在低溫庫的貯藏條件下，小麥種子生活力曲線表現(xiàn)為反“S”型，即在貯藏的前11年，種子處于高生活力平臺(tái)期，生活力幾乎沒有明顯下降，貯藏11年的種子發(fā)芽率仍高達(dá)90.4%，而在隨后3年間（貯藏年限12—15年），種子發(fā)芽率從83%快速下降至20.1%，貯藏年限16—20年發(fā)芽率下降又相對緩慢，因此，貯藏12—15年為生活力驟降期階段。種子生活力由平臺(tái)期轉(zhuǎn)向驟降期的過渡區(qū)，稱為種子衰老拐點(diǎn)。同一作物種子在不同保存條件下，其生活力喪失的拐點(diǎn)基本相近，發(fā)芽率范圍為70%—85%[34-40]。換言之，種子貯藏過程中的存活曲線呈反“S”型且存在衰老拐點(diǎn)的特性是作物種子的共有特性，其不受保存條件、種子含水量、初始發(fā)芽率等影響。當(dāng)水稻、小麥、玉米、大豆、蠶豆等作物種質(zhì)發(fā)芽率低于衰老拐點(diǎn)后更新，群體遺傳完整性喪失[41-44]，尤其是異質(zhì)群體的地方品種表現(xiàn)更明顯。明確了當(dāng)各作物的種子生活力下降至衰老拐點(diǎn)時(shí)，就應(yīng)當(dāng)進(jìn)行更新，以維持種質(zhì)的遺傳完整性。這一發(fā)現(xiàn)為各作物確定種質(zhì)更新臨界值提供了依據(jù)，也明確了種質(zhì)安全保存年限是生活力從起始降至拐點(diǎn)的年限（高生活力平臺(tái)期）。由此，提出了維持生活力高于拐點(diǎn)以保障遺傳完整性的安全保存拐點(diǎn)理論（圖1）。其內(nèi)涵為：在種質(zhì)資源保存環(huán)節(jié)，一方面盡可能延緩衰老拐點(diǎn)出現(xiàn)，即延長種質(zhì)保存壽命，另一方面更為關(guān)鍵的是需要預(yù)警出生活力降至拐點(diǎn)的種質(zhì)；在種質(zhì)繁殖更新環(huán)節(jié)中，需安全更新臨近拐點(diǎn)的種質(zhì)；在種質(zhì)入庫的初始環(huán)節(jié)，其起始生活力需高于拐點(diǎn)。

圖1 作物種質(zhì)資源安全保存的拐點(diǎn)理論

Fig. 1 The critical node theory of the safe conservation of crop germplasm resources

2.2 拐點(diǎn)理論的生理生化基礎(chǔ)

基于種質(zhì)衰老拐點(diǎn)的活性氧積累、氧化還原態(tài)紊亂、蛋白羰基化修飾等研究，探明種質(zhì)衰老拐點(diǎn)出現(xiàn)的生理生化基礎(chǔ)是氧化損傷加劇導(dǎo)致脂質(zhì)、線粒體能量等代謝功能劇降。種子生活力降至衰老拐點(diǎn)，種子的蛋白、核酸、膜脂等大分子物質(zhì)發(fā)生了嚴(yán)重的氧化損傷。在衰老拐點(diǎn)，超氧陰離子自由基（O2-·）和過氧化氫（H2O2）含量增加，活性氧積累，抗氧化系統(tǒng)活性下降，脂質(zhì)過氧化損傷，引起膜系統(tǒng)完整性降低，同時(shí)生成活性羰基小分子或者揮發(fā)性物質(zhì)?；钚贼驶》肿庸舻鞍踪|(zhì)，發(fā)生羰基化修飾，是導(dǎo)致蛋白功能下降的主要因素。在衰老拐點(diǎn)，種子蛋白的羰基化水平顯著提高，糖酵解、戊糖磷酸途徑和TCA循環(huán)等代謝相關(guān)蛋白和APX等抗氧化酶，參與能量代謝和逆境脅迫響應(yīng)等相關(guān)蛋白呈下調(diào)表達(dá)，且被羰基化修飾；貯藏蛋白呈上調(diào)表達(dá)，且也發(fā)生羰基化修飾[40, 45-49]。種子生活力降至拐點(diǎn)時(shí)，線粒體相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)水平發(fā)生了較大的改變：（1）線粒體在吸脹后較難修復(fù)其結(jié)構(gòu)，線粒體數(shù)量明顯減少，膜結(jié)構(gòu)不完整，生理活性顯著降低；（2）線粒體電子傳遞途徑功能活性下降，抑制了線粒體細(xì)胞色素途徑，誘導(dǎo)了以及交替NADH脫氫酶、解偶聯(lián)蛋白和交替氧化酶組成的交替途徑的表達(dá)，彌補(bǔ)ATP的供應(yīng)；（3）抑制了線粒體中參與碳代謝、氮代謝、能量代謝和抗氧化系統(tǒng)蛋白的表達(dá)，嚴(yán)重?fù)p傷ATP生成和中間物質(zhì)生成，并可能導(dǎo)致細(xì)胞色素c和活性氧等因素誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[39,50-52]。當(dāng)種子生活力低于拐點(diǎn)時(shí)，結(jié)構(gòu)和功能完整的線粒體數(shù)量極少，且無法提供種子萌發(fā)所需的能量，且氧化損傷進(jìn)一步加劇，生理功能發(fā)生嚴(yán)重紊亂，從而促進(jìn)種子生活力喪失進(jìn)入驟降期。

基于拐點(diǎn)理論的生理生化基礎(chǔ)，發(fā)掘出可作為種子生活力拐點(diǎn)的預(yù)警指標(biāo)，包括氧化損傷指標(biāo)，如醇、醛、酮等揮發(fā)性物質(zhì)組分含量，抗氧化酶的蛋白表達(dá)量（APX和過氧化氫酶），羰基小分子醛（4-羥基-E-2-壬烯醛和丁烯醛）含量，關(guān)鍵蛋白（MnSOD、HSP70、APX等）羰基化修飾水平；線粒體損傷指標(biāo)，包括線粒體膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、耗氧呼吸水平、電子傳遞途徑關(guān)鍵蛋白（細(xì)胞色素c和交替氧化酶）表達(dá)量等，以及在驟降期無法分離純化出線粒體。種子衰老拐點(diǎn)的生物學(xué)機(jī)制及其特征指標(biāo)的揭示，為研發(fā)種子生活力監(jiān)測預(yù)警技術(shù)提供了重要理論依據(jù)。

3 復(fù)份安全保存機(jī)制

復(fù)份安全保存是指已保存的種質(zhì)在物理空間或保存方式上再備份保存一份，以防止意外事故而導(dǎo)致資源無法挽回的損失。復(fù)份保存即選擇另一種質(zhì)庫作為原種質(zhì)庫資源保存的備份庫，而這兩個(gè)種質(zhì)庫之間應(yīng)有一定的空間距離，以避免戰(zhàn)爭或自然災(zāi)害可能給種質(zhì)資源造成的毀滅性損失。備份保存不僅包括種子實(shí)物的復(fù)份安全保存，也應(yīng)包括相對應(yīng)資源信息的復(fù)份安全保存。備份種質(zhì)庫應(yīng)選擇在貯藏條件較好，且受地震、洪水、泥石流等自然災(zāi)害危害可能性最低的地區(qū)。國際上認(rèn)為理想的途徑是選擇國外一個(gè)種質(zhì)庫作為備份保存庫。因此，F(xiàn)AO資助挪威政府在Svalbard群島上建設(shè)了容量為450萬份的保存庫，取名為“全球種質(zhì)庫”（Svalbard Global Seed Vault），作為國際上的種質(zhì)資源備份保存庫[14]。

復(fù)份保存資源主要是長期庫保存的種質(zhì)材料，主要采用黑箱（black-box）方式，即將準(zhǔn)備進(jìn)行復(fù)份保存的種子樣品裝在箱子里，外加密封條。未經(jīng)種質(zhì)寄存人的允許，復(fù)份庫保管人不允許開箱動(dòng)用復(fù)份保存的種質(zhì)材料。對于復(fù)份保存的種子，裝箱包裝前同樣要進(jìn)行種子入庫前處理加工，如生活力檢測和干燥包裝。此外，作為復(fù)份保存的黑箱應(yīng)選擇耐低溫且結(jié)實(shí)的材料制作，如鐵皮箱，要確保在運(yùn)輸和貯藏過程中不易被撞裂。

4 展望

雙低理論和拐點(diǎn)理論是種質(zhì)安全保存延長保存壽命和維持遺傳完整性的理論基礎(chǔ)。因此，仍需進(jìn)一步加強(qiáng)安全保存理論的基礎(chǔ)研究，為構(gòu)建延長種子安全保存壽命技術(shù)、生活力監(jiān)測預(yù)警技術(shù)、繁殖更新技術(shù)等安全保存關(guān)鍵技術(shù)提供更好的科學(xué)依據(jù)。

4.1 加強(qiáng)貯藏前種子質(zhì)量對延長種質(zhì)保存壽命的生理生化基礎(chǔ)研究

利用低溫庫保存種質(zhì)的重要目標(biāo)之一是最大限度地延長種子保存壽命。在保存條件（溫度、含水量和包裝方式）已經(jīng)確定的情況下，提高貯藏前的種子質(zhì)量是進(jìn)一步延長保存壽命的關(guān)鍵要素。因此，有必要加強(qiáng)對田間繁殖環(huán)境（栽培密度、水肥管理）和成熟收獲氣候環(huán)境（適宜繁殖地區(qū)和季節(jié)）等影響貯藏前種子質(zhì)量的因素及其延長保存壽命的種子生理生化機(jī)制開展深入研究，進(jìn)一步構(gòu)建可延長種質(zhì)保存壽命的貯藏前種子質(zhì)量指標(biāo)和生理生化指標(biāo)。

4.2 加強(qiáng)種質(zhì)衰老拐點(diǎn)生物學(xué)機(jī)制研究

低溫庫種子生活力喪失存在驟降的特性，但影響生活力喪失特性的因素十分復(fù)雜，各類型（育成品種和地方品種，國內(nèi)收集和國外引進(jìn)、種子收獲的成熟度和批次）作物種子生活力喪失和衰老拐點(diǎn)出現(xiàn)的生物學(xué)機(jī)制研究較少。因此，有必要加強(qiáng)各類型種質(zhì)衰老拐點(diǎn)的生物學(xué)機(jī)制研究，構(gòu)建可預(yù)示和預(yù)警衰老拐點(diǎn)的生物學(xué)指標(biāo)。

4.3 加強(qiáng)遺傳原真的維持機(jī)制研究

種質(zhì)保存的重要目標(biāo)是保持種質(zhì)的遺傳完整性，即一份材料內(nèi)遺傳變異的總和。由于一份種質(zhì)內(nèi)不同種質(zhì)型材料的耐貯性可能不同，地方品種（混合群體）尤甚，因此，為了維持后代種子的群體遺傳組成不變，繁殖地、群體量、授粉方式、更新次數(shù)等是維持遺傳原真的關(guān)鍵繁殖更新指標(biāo)。然而，目前上述繁殖更新指標(biāo)對遺傳完整性的影響機(jī)制研究較為薄弱，導(dǎo)致各種質(zhì)庫采用的繁殖更新指標(biāo)和技術(shù)沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因此，有必要加強(qiáng)種質(zhì)類型、更新群體量、更新次數(shù)對群體遺傳組成影響的機(jī)制研究，構(gòu)建遺傳原真的繁殖更新指標(biāo)體系。

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The Progress and Prospects of the Theoretical Research on the Safe Conservation of Germplasm resources in Genebank

YIN GuangKun, XIN Xia, ZHANG JinMei, CHEN XiaoLing, LIU YunXia, HE JuanJuan, HUANG XueQi, LU XinXiong

Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081

The safe conservation of germplasm resources is the core of high-level protection and a prerequisite for sustainable utilization. Low-temperature genebank is the most important way to conserve crop germplasm resources. These aims, extending the conservation longevity, maintaining the genetic integrity and preventing the accidental loss, always were the research difficulties and hotspots in the safe conservation. This review systematically sorted out the research history of germplasm resources in genebanks in the past 100 years, and pointed out: (1) Low moisture content and low storage temperature are key factors for prolonging seed longevity, forming the low temperature and moisture theory, which is the theoretical basis for safe conservation in genebanks; (2) The declining viability of seeds in genebanks has the characteristic of the critical node, which is the lower limit for maintaining genetic integrity, forming the critical node theory, which is the theoretical basis for the safe conservation of germplasm resources; (3) The conserved germplasm should be backed up by the physical space or storage method, forming the back up conservation mechanism, which is the a safeguard measure to prevent the irreversible loss of resources caused by accidents. This review focused on the connotation, significance and practical guidance of the double-low theory, the critical node theory and the duplication conservation mechanism, in order to further promoting the development of the safe conservation of germplasm resources.

genebank; safe conservation; low temperature and moisture theory; critical node theory; back up conservation mechanism

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.07.001

2021-10-14；

2021-11-25

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程

尹廣鹍，E-mail：yinguangkun@caas.cn。通信作者盧新雄，E-mail：luxinxiong@caas.cn

（責(zé)任編輯 李莉）