許 真 張 洋 劉宏偉

（1.鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南 鶴壁 458030；2.鶴壁市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗中心，河南 鶴壁 458030）

0 引言

活性肽（Active Peptide）又稱生物活性肽，由2 個或2 個以上氨基酸通過肽鍵相連而成，分子結(jié)構(gòu)不同于氨基酸和蛋白質(zhì)，復(fù)雜程度不盡相同［1］?；钚噪脑跇O低的濃度條件下，即可對生物體的整個生命活動發(fā)揮有益作用或特殊的生理功能，具有較強的抗氧化、抗菌、促生長等功能，可直接被吸收利用，且吸收速度較快，也可作為載體發(fā)揮作用［2］。

植物的抗病性與其體內(nèi)的防御酶系有極其密切的關(guān)系［3］。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、 多 酚 氧 化 酶（Polyphenol Oxidase，PPO）和苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia Lyase，PAL）是植物體內(nèi)重要的防御酶，通過參與清除活性氧，降低活性氧及氧自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，促進(jìn)酚類、植保素和木質(zhì)素等抗病相關(guān)物質(zhì)的合成，起到增強植物抗病性的作用。

近年來，人們對多種植物感病后防御酶活性的變化規(guī)律進(jìn)行了深入研究［4］，但有關(guān)活性肽對植物體內(nèi)防御酶活性的影響的研究較少。筆者以受病蟲害嚴(yán)重、使用農(nóng)藥較多的韭菜為研究對象，葉片噴施黑霉菌源多肽，對其葉片中具有抗病性的相關(guān)酶活性進(jìn)行測定，以期開發(fā)出經(jīng)濟、高效、毒性小、無殘留的活性肽植物保護(hù)制劑，為活性肽在植物保護(hù)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試韭菜品種為大葉韭菜，蔬菜試驗田大棚栽培。黑霉菌源多肽，鶴壁興旺生物科技有限公司生產(chǎn)；愈創(chuàng)木酚、磷酸鹽緩沖液、鄰苯二酚，上海躍騰生物科技有限公司生產(chǎn)；雙氧水（H2O2，分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；植物苯丙氨酸解氨酶試劑盒，上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2000 型紫外分光光度計，上海尤尼可儀器有限公司生產(chǎn)；TP-114 電子分析天平，賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn)；TGL-16gR 型臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 韭菜栽培。韭菜在大棚內(nèi)盆栽。培育壯苗后，選取長勢一致（高20 cm 左右）、健壯無損傷的韭菜移植于種植盆中，每盆定植3 株（每株3 棵），采取如下4 種處理：①清水處理（CK1）；②接種灰霉病菌（CK2）；③接種灰霉病菌并噴施50%多菌靈粉劑300 倍液（CT1）；④接種灰霉病菌并噴施10 mg/L 多肽溶液（CT2）。每個處理9 株，3 次平均試驗。噴施程度以葉面均勻布滿霧狀溶液為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 防御性酶活性測定方法。參照CHEN［5］等的方法稍做修改，提取植物組織內(nèi)防御酶粗酶液。稱取同一葉位處的葉片1.0 g，放入預(yù)冷的研缽中，加8 mL 預(yù)冷的磷酸緩沖液在冰浴條件下研磨成漿，轉(zhuǎn)移至 10 mL 離心管，4 ℃、13 000 r/min 離心 30 min，上清液即為粗酶液。采用吸光光度法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性［6］、過氧化氫酶（CAT）活性［7］、過氧化物酶（POD）活性［7］、多酚氧化酶（PPO）活性［8］，參考試劑盒說明書測定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Origin 9.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Microsoft Excel 2007 繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對SOD 活性的影響

病原菌侵染植物體后，最初的防御反應(yīng)與活性氧（Reactive Oxygen，ROS）積累密切相關(guān)，多余的活性氧會影響植物正常的生理活動。SOD 是第一個參與活性氧清除反應(yīng)的酶，處于抗氧化反應(yīng)的核心地位，可將O2?轉(zhuǎn)化為H2O2，H2O2是誘導(dǎo)植物抗病機制的激發(fā)分子［9］。

CK1處理后，韭菜葉片中SOD 活性隨時間延長無明顯變化，但其他3 個處理均顯著提高了SOD 活性，見圖1。這表明SOD 活性的變化與灰霉病菌的侵染有關(guān)。CK2處理2.0 d 后，SOD 活性達(dá)到最大值，為170.03 U/g（FW），隨后酶活性快速降低；CT1處理 12 h 后，SOD 活性顯著升高，1.0 d 后達(dá)到峰值 230.14 U/g（FW），是 CK1的 2.31 倍，是 CK2的 1.9 倍；CT2處理第 2.0 d，SOD 活性達(dá)到最高值232.69 U/g（FW），略高于CT1處理，隨后逐漸下降，但仍高于CK1和CK2，說明活性肽和多菌靈處理都能誘導(dǎo)提高韭菜葉片中SOD 活性，但活性肽誘導(dǎo)達(dá)峰值時間較多菌靈處理晚，具體機制還有待進(jìn)一步研究。

圖1 黑霉菌源多肽處理對韭菜葉片中SOD 活性的影響

2.2 不同處理對CAT 活性的影響

CAT 可將 H2O2還原為水（H2O）和氧氣（O2），在清除H2O2和維持H2O2正常水平中起重要作用，是植物體內(nèi)重要的活性氧清除劑。由圖2 可知，無菌水處理后CAT 活性無明顯變化；CK2處理后，CAT 活性逐漸增強，3.0 d 達(dá)到最大值 11.90 U/（g·min）（FW）；CT1處理后，CAT 活性迅速增加，2.0 d 達(dá)到峰值22.54 U/（g·min）（FW），是 CK2的 1.89 倍，之后降低，4.0 d 時有所回升，隨后降低；CT2處理后第 3.0 d，CAT 活性達(dá)到最大值 21.63 U/（g·min）（FW），是CK2的1.81 倍，比 CT1少 0.91 個活性單位，隨后降低，但仍高于CK2，說明活性肽對CAT 具有積極的誘導(dǎo)作用。

圖2 黑霉菌源多肽處理對韭菜葉片中CAT 活性的影響

2.3 不同處理對POD 活性的影響

POD 除具有清除活性氧的作用外，還能促進(jìn)酚類物質(zhì)的氧化和木質(zhì)素的形成，可有效抑制病原菌的侵染。由圖3 可知，與CK1處理相比，其他3 個處理均顯著提高了葉片內(nèi)POD 的活性，并在第3.0 d 分別達(dá)到最大值，CT2最高值為 92.93 U/（g·min）（FW），CT1最 高 值 為 76.63 U/（g·min）（FW），CK2最 高值為 71.68 U/（g·min）（FW），CT2最高值分別比CT1、CK2、CK1高出 1.21、1.29、1.76 倍，隨后 POD活性逐漸降低，但CT2處理的酶活性仍然高于其他處理，說明活性肽對POD 的誘導(dǎo)力高于其他處理。

圖3 黑霉菌源多肽處理對韭菜葉片中POD 活性的影響

2.4 不同處理對PPO 活性的影響

PPO 可促進(jìn)細(xì)胞壁木質(zhì)化，降低病原菌侵染對植物造成的損傷，是酚類物質(zhì)被氧化、木質(zhì)素積累、植保素合成等過程的關(guān)鍵性酶，在植物的防御機制中發(fā)揮著重要作用。圖4 表明，韭菜葉片受到灰霉病菌侵染后，PPO 活性在第 3.0 d 最高，為 5.83 U/（g·min）（FW）；CT1處理后，PPO 活性也在第3.0 d 達(dá)到峰值，為 7.66 U/（g·min）（FW）；CT2處理在第 2.0 d 達(dá)最高值，為7.68 U/（g·min）（FW）。這說明活性肽對 PPO活性具有一定的誘導(dǎo)作用。

圖4 黑霉菌源多肽處理對韭菜葉片中PPO 活性的影響

2.5 不同處理對PAL 活性的影響

PAL 是苯丙烷類代謝途徑中的第一關(guān)鍵酶和限速酶，在植物抗病性酚類物質(zhì)、木質(zhì)素和植保素等物質(zhì)的合成中發(fā)揮著重要作用。結(jié)果顯示，灰霉病菌侵染導(dǎo)致韭菜葉片中PAL 活性顯著上升，可能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的酚類和植保素，從而抑制灰霉病菌的生長繁殖。活性肽處理在1.0 d 和3.0 d 出現(xiàn)了2 個峰值，最高值為4.24 U/g（FW），高于其他處理，表明活性肽在誘導(dǎo)PAL 活性上具有積極作用（見圖5）。

圖5 黑霉菌源多肽處理對韭菜葉片中PAL 活性的影響

3 結(jié)論

筆者對活性肽誘導(dǎo)韭菜葉片中防御性酶活性的變化進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)韭菜葉片受到灰霉病菌侵染后（CK2），葉片中的SOD、CAT、POD、PAL和PPO 活性均比無菌水（CK1）處理顯著增強；施用多肽后這5 種防御性酶活性比CK2處理有不同程度升高，說明多肽與防御性酶活性誘導(dǎo)具有正相關(guān)性，在提高植物抗病能力上有積極作用。活性肽在生物防治真菌性病害中具有一定的應(yīng)用前景，但具體誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性反應(yīng)的機制有待進(jìn)一步研究。