陳寶玲 楊開(kāi)太 黃 森 龔建英 李秋荔 汪小玉 蘇莉花

（1. 廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002；2. 廣西國(guó)有欽廉林場(chǎng)，廣西 欽州 535099）

兜蘭屬（Paphiopedilum）是蘭科（Orchidaceae）名貴花卉，全世界約有80～85種，中國(guó)多達(dá)27種，是世界上兜蘭種類最為豐富的國(guó)家之一，主要分布在廣西、貴州和云南等地[1-4]。兜蘭屬于蘭科植物中瀕危程度最高的類群，不僅自然分布區(qū)域狹窄，而且大多數(shù)種類自然居群小，個(gè)體分布不集中。近年來(lái)，由于人類活動(dòng)的干擾及野生生境的破壞，野生兜蘭居群數(shù)量急劇減少，因此，兜蘭屬的所有種均被納入野生動(dòng)植物瀕危物種國(guó)際貿(mào)易公約（CITES）附錄I的保護(hù)范圍[1,5]。由于兜蘭自然繁殖力低，人工繁殖效率不高，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，兜蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展進(jìn)程緩慢。兜蘭屬是蘭科中的地生或半附生植物[1]，在自然生長(zhǎng)中整個(gè)生活史都與菌根真菌有著密不可分的關(guān)系，二者之間獨(dú)特的生態(tài)功能構(gòu)成了偏好與蘭科植物一方的復(fù)雜的共生關(guān)系，菌根真菌能促進(jìn)蘭花種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)發(fā)生，有助于蘭花的生態(tài)入侵，影響生物群落的組成，有利于生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)、恢復(fù)或重建等方面[6]。此外，兜蘭植物根際具有復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，除了病原菌、益生菌和宿主植物三者在相互作用中形成穩(wěn)固的微生態(tài)平衡外，不同微生物在物理結(jié)構(gòu)、活性成分代謝、功能發(fā)揮等方面也密切相關(guān)，彼此間相互影響，相互作用[7]。目前，微生物相互作用已成為菌根研究中最活躍和最具應(yīng)用前景的領(lǐng)域之一[8]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者在部分松屬（Pinus）、楊屬（Populus）及降香黃檀（Dalbergia odorifera）等種類上對(duì)微生物互作機(jī)理進(jìn)行了研究[9-12]。蘭花菌根的研究已經(jīng)覆蓋了包括蘭屬（Cymbidium）、五唇蘭屬（Doriti）、兜蘭屬及杓蘭屬（Cypripedium）等多數(shù)珍稀瀕危種類[13-23]，然而，關(guān)于多種多樣的菌根真菌在蘭科植物生長(zhǎng)中的相互作用，尤其是菌根真菌混合接種對(duì)兜蘭生長(zhǎng)及生理效應(yīng)的系統(tǒng)研究報(bào)道較少。本研究以前期研究中從野生兜蘭分離篩選出3個(gè)有益菌根菌種為研究材料，采用7種不同的接種方式回接到帶葉兜蘭組培苗上，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下揭示了菌根真菌對(duì)兜蘭生長(zhǎng)和生理的影響，從而提高菌根的生長(zhǎng)與合成效率，最大限度地發(fā)揮菌根真菌對(duì)宿主植物的有益效果。研究結(jié)果不僅具有重要的生態(tài)價(jià)值，促進(jìn)瀕危兜蘭植物的科學(xué)保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)，而且具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有助于建立兜蘭高效栽培技術(shù)體系，縮短栽培周期，節(jié)約成本，促進(jìn)兜蘭產(chǎn)業(yè)向生態(tài)環(huán)保產(chǎn)業(yè)的方向高效、快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試植株

選取繼代3次以上，根系2～3條，葉片3～4片，長(zhǎng)勢(shì)一致、植株健壯且無(wú)變異的帶葉兜蘭無(wú)菌組培苗為供試植株。

1.1.2供試菌種

供試菌種為廣西野生兜蘭營(yíng)養(yǎng)根中分離、篩選出的3種有益菌根真菌，編號(hào)分別為PF02、PF06、PF07，經(jīng)篩選均為帶葉兜蘭幼苗的不致病菌株。經(jīng)16S rDNA序列測(cè)定與分析，PF02為Kirschsteiniothelia tectonae、PF06為瓶霉Phialophorasp.、PF07為杯梗孢Cyphellophorasp.，3種真菌均在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC NO. 21 051、21 052、21 053）進(jìn)行超低溫凍結(jié)保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌株活化

將供試菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，人工氣候箱25 ℃培養(yǎng)7～10 d，作為備用菌株。

1.2.2組培苗菌根化

1） 共生培養(yǎng)基。試驗(yàn)中共生培養(yǎng)基采用DE培養(yǎng)基[16]。

2）共生培養(yǎng)方法。在超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌水沖洗無(wú)菌組培苗根部殘留的培養(yǎng)基，無(wú)菌濾紙吸干水分，稱量組培苗的鮮質(zhì)量，葉片數(shù)和根數(shù)，然后移入DE培養(yǎng)基中，每瓶接種6株組培苗，然后用打孔器（孔直徑為0.5 cm）從已活化菌種的PDA平板菌落邊緣打孔單個(gè)菌塊，再用接種針挑取該菌塊接入相應(yīng)的位置（方法見(jiàn)表1），接菌量為每個(gè)菌種1個(gè)菌塊。單菌接種設(shè)3個(gè)處理，重復(fù)3次，每瓶6株苗；混合接種試驗(yàn)采用雙菌混合接種和三菌混合接種方式，共設(shè)4個(gè)處理，重復(fù)3次，每瓶6株苗。對(duì)照組不接種真菌。接種后瓶口用保鮮膜密封，移入25 ℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照時(shí)長(zhǎng)12 h/d、光照強(qiáng)度25 μmol/(m2·s)，在共生培養(yǎng)45 d內(nèi)每隔3 d觀察1次。

表 1 實(shí)驗(yàn)處理Table 1 Experimental treatments

1.2.3測(cè)定方法

1）生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定。共生培養(yǎng)120 d后將收獲的菌根苗除去培養(yǎng)基，測(cè)定苗的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉片數(shù)、根數(shù)及根系長(zhǎng)度等生長(zhǎng)指標(biāo)，在80 ℃恒溫烘干箱中干燥至恒質(zhì)量，測(cè)定干質(zhì)量。計(jì)算鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率及與對(duì)照鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率[16]。

2）生理指標(biāo)測(cè)定。共生培養(yǎng)120 d后，采集菌根苗新鮮葉片測(cè)定POD、CAT、SOD等葉片保護(hù)酶活性和葉綠素含量等生理指標(biāo)，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）活性以及葉綠素含量的測(cè)定采用李合生[24]的方法，每個(gè)處理各項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)3次測(cè)定。

1.2.4蘭科菌根真菌的重分離

取帶葉兜蘭單菌接種菌株的植株和不接種的對(duì)照植株若干，挑選新生根系。經(jīng)0.1%的HgCl2溶液表面消毒1 min后，用無(wú)菌水清洗4次；然后采用組織塊分離法進(jìn)行菌根真菌的重分離。置于含1 μL/mL慶大霉素的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫暗培養(yǎng)7～10 d，觀察各處理根段長(zhǎng)菌的情況。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.05分析各處理組所增加的組培物生長(zhǎng)指標(biāo)及生理指標(biāo)，并分別進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan新極復(fù)差法進(jìn)行多重比較，篩選最佳菌根真菌及其互作方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 共生關(guān)系的建立

培養(yǎng)120 d后，在接種菌株對(duì)應(yīng)的植株根部進(jìn)行真菌重分離（表2），研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種處理均能分離得到對(duì)應(yīng)的3個(gè)原接種菌株，而無(wú)菌苗對(duì)照則未分離到任何菌株。說(shuō)明原接種菌株均與帶葉兜蘭幼苗形成了共生關(guān)系，確定為帶葉兜蘭的蘭科菌根真菌。

表 2 菌根真菌重分離情況Table 2 Re-isolation of mycrrhizal fungi of P. hirsutissimum seedling

2.2 3種菌根真菌對(duì)帶葉兜蘭組培苗生長(zhǎng)的影響

采用單菌根接種法研究了3種蘭花菌根真菌對(duì)兜蘭生長(zhǎng)的影響（圖1）。經(jīng)過(guò)120 d的培養(yǎng)，數(shù)據(jù)和分析結(jié)果表明，3種菌根真菌均能不同程度地提高兜蘭組培苗的生物量，促進(jìn)植株干物質(zhì)積累和生長(zhǎng)發(fā)育（表3）。其中PF02和PF07兩個(gè)菌株對(duì)組培苗植株鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率具有顯著（P<0.05）作用，較對(duì)照分別增長(zhǎng)了90.0%、105.2%，較PF06分別增長(zhǎng)了37.2%、48.2%。同時(shí)PF02和PF07兩個(gè)菌株對(duì)組培苗的干物質(zhì)積累提高顯著，干質(zhì)量比對(duì)照增加40.0%、60.0%，差異極顯著（P<0.01），較PF06分別增長(zhǎng)了16.7%、33.3%，差異顯著。3種真菌均能較好的侵染和定殖組培苗的根系，發(fā)揮了蘭科菌根的功效，促進(jìn)根系萌發(fā)和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。值得一提的是PF07菌株，它體現(xiàn)了較好的促生功能，不僅有利于促進(jìn)植株干物質(zhì)的積累，而且加快了植株新葉的生長(zhǎng)和新根的發(fā)育，平均新增葉片數(shù)2.69片，與對(duì)照相比差異顯著，平均新根萌發(fā)數(shù)量多達(dá)2.72條，但與對(duì)照差異不顯著。

表 3 3種菌根真菌對(duì)帶葉兜蘭植株生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of 3 beneficial symbiotic fungi on growth of P. hirsutissimum

圖 1 帶葉兜蘭單菌接種育苗Fig. 1 P. hirsutissimum seedling in vitro with mycrrhizal fungi single inoculation and CK

2.3 菌根真菌混合接種對(duì)帶葉兜蘭組培苗生長(zhǎng)的影響

將3個(gè)菌株分別通過(guò)雙菌混合接種及三菌混合接種方式接種帶葉兜蘭組培苗（圖2），結(jié)果表明，3種菌根真菌的不同混合接種方式對(duì)植株生長(zhǎng)產(chǎn)生了不同程度的促進(jìn)作用，與CK相比具有顯著或極顯著的正向互作效應(yīng)，但雙菌混合接種比單菌接種及三菌混合接種方式對(duì)植株的生長(zhǎng)更有效。由表4可知，4種混合接種方式對(duì)組培苗各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)的影響程度不同，特別是PF02×PF06雙菌組合。菌株P(guān)F06單菌接種的植株總體促生效果處于中等水平，但混合接種了菌株P(guān)F02后，雙菌組合的總體促生效果明顯提高，鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率、新葉數(shù)和新根數(shù)增長(zhǎng)極顯著。接種PF02×PF06雙菌組合的組培苗鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率為220.78%，干質(zhì)量為0.09g，新葉數(shù)為3.2片，新根數(shù)為4.4條，其中，鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率較PF02×PF07、PF02×PF06×PF07及CK差異極顯著，分別提高了51.4%、74.7%、258.6%，新葉數(shù)較CK差異極顯著，增加了42.7%，新根數(shù)較PF06×PF07、PF02×PF06×PF07及CK差異極顯著，分別提高了50.5%、41.3%、

表 4 菌根真菌及其互作對(duì)帶葉兜蘭植株生物量增長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of mycorrhizal fungi interaction on biomass growth of P. hirsutissimum

圖 2 帶葉兜蘭混合接種育苗Fig. 2 P. hirsutissimum seedling in vitro with mycorrhizal fungi mixed inoculation and CK

150.3%。

其次是PF02×PF07，鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率為145.9%，干質(zhì)量為0.10 g，新根數(shù)為4.8條，新葉數(shù)為3.0片，各生長(zhǎng)指標(biāo)較CK差異極顯著，特別是可較好的促進(jìn)干質(zhì)量和新根數(shù)的增加。PF02×PF07干質(zhì)量較PF02×PF06×PF07及CK差異極顯著，分別高出42.9%與100%，新根數(shù)較PF06×PF07、PF02×PF06×PF07及CK差異極顯著，分別提高了54.2%、64.3%、173.1%。

PF06×PF07各生長(zhǎng)指標(biāo)較CK差異顯著或極顯著，鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率較PF02×PF06×PF07差異極顯著，提高了51.9%。

由此可見(jiàn)，不同功效的菌株相互組合后產(chǎn)生了不同程度上的菌根真菌互作效應(yīng)，在3組雙菌接種方式中，PF02×PF06及PF06×PF07通過(guò)強(qiáng)-弱菌株組合相互作用，相互促進(jìn)，體現(xiàn)了互作協(xié)同效應(yīng)；PF02×PF07通過(guò)強(qiáng)-強(qiáng)菌株組合相互制約，在接種勢(shì)、生長(zhǎng)空間及養(yǎng)分等方面產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，互作效應(yīng)減弱，促進(jìn)植株生長(zhǎng)緩慢，體現(xiàn)了菌根真菌互作弱協(xié)同效應(yīng)。同理，三菌混合接種的組培苗各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)增加效果也不及雙菌混合接種方式，說(shuō)明菌株的種類、數(shù)量和接種量在一定程度上削弱了互作效應(yīng)。在生產(chǎn)中，應(yīng)重點(diǎn)尋找微生物相互作用增強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)。

2.4 菌根真菌混合接種對(duì)帶葉兜蘭組培苗生理的影響

將3個(gè)菌株雙菌混合接種及3菌混合接種并共生培養(yǎng)120 d后，比較各處理葉片的保護(hù)性酶活性及葉綠素含量等生理指標(biāo)差異，結(jié)果表明，經(jīng)菌株處理的植株，尤其是部分混合接種的植株，其生理指標(biāo)與CK相比均有不同程度上的提高（表5），效果比較突出的是PF02×PF06處理。其中，PF02×PF06的SOD與POD酶活性最高，分別為2472.8、129.4 U/g，與其他處理相比差異顯著或極顯著；PF02×PF06×PF07的CAT酶活性與葉綠素總量最大，分別為108.2、0.8 mg/g，與其他處理相比差異顯著或極顯著。PF02×PF07的SOD酶活性最高，為136.8 U/g，與其他處理相比差異顯著或極顯著。因此，微生物互作對(duì)植株生理指標(biāo)有較好的促進(jìn)作用，但不同的微生物互作組合產(chǎn)生了不同程度的生理效應(yīng)，PF02×PF06是較好的互作組合，該處理能較好的提高植株保護(hù)性酶和葉綠素總量，同時(shí)又對(duì)植株生長(zhǎng)指標(biāo)具有極強(qiáng)的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，篩選出最優(yōu)的菌根真菌及最佳的微生物互作組合，將快速提高植株的生長(zhǎng)速度和生理響應(yīng)，有效地發(fā)揮菌根真菌之間的協(xié)同作用。

表 5 菌根真菌及其互作對(duì)帶葉兜蘭植株生理指標(biāo)的影響Table 5 Effects of mycorrhizal fungi interaction on physiological indexes of P. hirsutissimum

綜上所述，PF02×PF06、PF02×PF07、PF06×PF07等是較適合帶葉兜蘭組培苗生長(zhǎng)的菌根真菌互作組合。

3 結(jié)論與討論

菌根-植物共生體與根際微生物之間存在著密切的相互作用模式[7]，同時(shí)，根際微生物在菌根定殖過(guò)程中起著積極地調(diào)控作用，促進(jìn)菌根合成和植物生長(zhǎng)。目前微生物互作在一些木本植物在研究較深入。多種外生菌根混合接種能顯著促進(jìn)尾葉桉（Eucalyptus urophylla）、馬尾松（P. mas-soniana）幼苗生長(zhǎng)[25-27]；雙接種幼套球囊霉（Glomus etunicatum）與慢生根瘤菌（Bradyrhzobium japonicum）有利于降香黃檀植株生長(zhǎng)和必需養(yǎng)分的吸收及AMF侵染率提高[28]。樟子松（Pinus sylvestrisvar.mongolica）復(fù)合接種研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)根際微生物數(shù)量增加，抗氧化酶活性顯著提高[29]。黃秋良等采用芳樟（Cinnamomum camphora）苗高、地徑建立回歸方程，以針對(duì)性的微生物菌劑方案促進(jìn)苗木不同生長(zhǎng)指標(biāo)達(dá)到最大值[30]。

應(yīng)用微生物互作開(kāi)展菌根化育苗技術(shù)繁育種苗，是解決兜蘭產(chǎn)業(yè)瓶頸的關(guān)鍵。近年來(lái)，蘭科植物有關(guān)微生物互作方面的研究鮮少報(bào)道，特別兜蘭的相關(guān)研究尚未發(fā)現(xiàn)。已有的研究證實(shí)，菌根真菌雙菌及三菌混合接種促進(jìn)美花石斛（D.loddigesii）生物量高效積累[31]。絲核菌屬（Rhizoctonia）和角菌根菌屬（Ceratorhiza）混合接種促進(jìn)美花蘭（Cymbidium insigne）組培苗的鮮質(zhì)量及葉綠素凈a、b含量增加[32]。菌根真菌和內(nèi)生細(xì)菌混合接種促進(jìn)五唇蘭（Doritis pulcherrima）鮮質(zhì)量和干質(zhì)量提高[33]。王曉鳴研究發(fā)現(xiàn)“真菌與細(xì)菌”互作組合促進(jìn)華石斛（D. sinense）礦質(zhì)元素的吸收，光合性能及抗旱性，調(diào)節(jié)內(nèi)源激素[34]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和枯草芽孢桿菌ZJU（Bacillus Subtilis）混合接種顯著抑制蘭花莖腐病[35]。因此，微生物相互對(duì)蘭花生產(chǎn)具有較廣泛的適用性和應(yīng)用前景。

在本研究中原接種菌株均與帶葉兜蘭幼苗形成了共生關(guān)系，確定為帶葉兜蘭的蘭科菌根真菌。PF07是單菌接種促生功能顯著的菌株，可與兜蘭形成有效的菌根以延伸水分吸收范圍，提供必需的養(yǎng)分，促進(jìn)植株鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率的提高與干物質(zhì)的積累，加快了植株新葉的生長(zhǎng)，促進(jìn)植株的生長(zhǎng)發(fā)育并參與植物生理代謝。不同功效的菌株相互組合后產(chǎn)生了不同程度的互作效應(yīng)，但雙菌混合接種比單菌接種及三菌混合接種方式對(duì)植株的生長(zhǎng)更有效。其中，PF02×PF06雙菌組合的總體促生效果最好，有利于植株鮮質(zhì)量、新葉和新根的增長(zhǎng)，PF02×PF07次之，促進(jìn)干質(zhì)量增加和新根的生長(zhǎng)發(fā)育。PF02×PF06及PF06×PF07通過(guò)強(qiáng)-弱菌株組合出現(xiàn)了強(qiáng)協(xié)同互作效應(yīng)，PF02×PF07的強(qiáng)-強(qiáng)菌株組合受接種勢(shì)、生長(zhǎng)空間及養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)等影響，共生效應(yīng)弱化，緩慢促進(jìn)植株生長(zhǎng)，呈現(xiàn)弱協(xié)同互作效應(yīng)。受菌株的種類、數(shù)量和接種量影響，三菌混合接種效果不及雙菌混合接種方式互作效應(yīng)減弱。PF02×PF06是較好的互作組合，對(duì)植株生長(zhǎng)指標(biāo)具有極強(qiáng)的促進(jìn)作用，同時(shí)能較好的提高植株保護(hù)性酶和葉綠素總量。生產(chǎn)中應(yīng)重點(diǎn)篩選促使微生物相互作用增強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)，快速提高植株的生長(zhǎng)速度和生理響應(yīng)。

本研究結(jié)果與前人結(jié)論一致，雙菌混合接種明顯優(yōu)于單菌或三菌混合接種，仲凱研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)速快的真菌優(yōu)先入侵根部并形成侵染通道，利于生長(zhǎng)慢的真菌快速獲得侵染方位，同時(shí)，生長(zhǎng)慢的真菌的入侵改善了根部微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)相互侵染和植物協(xié)同生長(zhǎng)[32]。雖然PF06單菌接種緩慢促進(jìn)植株鮮質(zhì)量增長(zhǎng)，但是聯(lián)合PF02共同侵染后則顯著提高植株生物量，但三菌同時(shí)侵染根部后，產(chǎn)生一定程度的抑制作用，說(shuō)明共生平衡與協(xié)同效應(yīng)是有條件的，隨著菌根真菌種類和數(shù)量的增加，不同真菌種類在侵染潛力、菌絲發(fā)育、菌根分泌物、根系生理變化、營(yíng)養(yǎng)元素及空間競(jìng)爭(zhēng)等方面產(chǎn)生影響[26]，證明并非所有的混合接種效果都較單菌接種具有積極作用[27]。篩選優(yōu)勢(shì)微生物種類、數(shù)量及相互作用方式，可最大程度上發(fā)揮拮抗性和兼容性的統(tǒng)一[36-39]，最大限度發(fā)揮菌根對(duì)宿主植物的有益作用，這將是一個(gè)提高提高蘭花栽培效率、節(jié)約成本、提高產(chǎn)量、改善花卉品質(zhì)的有效途徑。此外，植株的生理指標(biāo)尤其是保護(hù)酶活性與根系中菌根侵染的不同時(shí)期有關(guān)，呈動(dòng)態(tài)變化，因此，今后的研究將側(cè)重于菌根苗生理指標(biāo)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與互作機(jī)理深入分析方面。