王 博，安 昊，張婷婷，張 君，武生財，李煥春

（1.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院資源環(huán)境與檢測技術研究所，內蒙古呼和浩特 010031；2.五原縣農牧業(yè)推廣中心，內蒙古五原 015100）

早在公元前202年，我國就已經有了畜糞和農業(yè)廢棄物進行發(fā)酵并用于農業(yè)生產的文字記載[1]，我國農村地區(qū)也有將秸稈、落葉、野草、動物糞便及墊圈料等農業(yè)廢棄物通過堆漚的方式制成有機肥料的習慣[2]。但是，農業(yè)生產過程中偏施化肥會導致有機肥料施用比例逐年下降。偏施化肥不僅帶來了眾多環(huán)境污染問題，還導致耕地肥力不斷下降[3-7]。發(fā)達國家采取了很多技術措施與政策鼓勵將農業(yè)廢棄物進行處理后用于農業(yè)生產，以解決化肥過量施用帶來的環(huán)境污染問題[8]，其中好氧堆肥技術被廣泛應用于農業(yè)廢棄物高效處理與資源化利用領域。近年來，我國也不斷出臺關于耕地質量提升的相關政策，有機肥施用量在未來一段時間內將不斷增加。據統(tǒng)計，我國每年產生各類農業(yè)廢棄物約38 億t[9]，有相當比例的農業(yè)廢棄物僅采用了簡單的晾曬、堆漚等方法進行處理。這些處理方法普遍發(fā)酵不徹底、發(fā)酵周期長，且處理后的產品存在質量不穩(wěn)定、無害化程度低等問題[10]。中國農業(yè)大學2017年組織編撰的《中國有機肥企業(yè)調研報告》表明，目前，我國有機肥企業(yè)存在規(guī)模小、設施相對簡陋、原料摻雜現(xiàn)象嚴重、產品質量低等問題。然而受限于我國有機肥行業(yè)的標準體系仍不完善及技術瓶頸難以突破，工廠化堆肥技術的產量與處理效率在短時間內無法迅速提高。因此，在未來的一段時間內，傳統(tǒng)堆漚方式仍然是就近處理有機廢棄物的主要技術與途徑之一，改進傳統(tǒng)堆漚技術與提高傳統(tǒng)堆漚產品質量已成為急需解決的農業(yè)廢棄物處理問題，目前關于堆肥工藝研究多集中于反應器或槽式堆肥工藝方面，針對傳統(tǒng)堆漚技術與微生物種群的研究較少。本研究進行了在傳統(tǒng)堆漚技術中增加翻堆措施的試驗，旨在優(yōu)化傳統(tǒng)堆漚技術，提高傳統(tǒng)堆漚肥料質量，為促進農村廢棄物高效處理提供技術支撐，為耕地質量提升提供物質基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗原料

試驗周期60 d，采用奶牛糞與小麥秸稈為供試原料，原料性質見表1。

表1 試驗原料性質

1.2 試驗設計

將奶牛糞與小麥秸稈按3∶1 比例混合，初始含水率約為66%，堆體尺寸為5.0 m 長×2.0 m 寬×1.4 m高（圖1），試驗設4 個處理，詳細設計見表2，所有處理設3 次重復。采用鏟車進行物料混合與翻堆。

表2 試驗處理設置

圖1 堆體尺寸與堆肥現(xiàn)場俯視圖

1.3 取樣

堆肥發(fā)酵過程中進行取樣檢測，取樣時間為堆肥第0、3、6、9、12、15、18、21、24、30、40、50、60 天；取樣方法與測溫方式見圖2；取樣時先將樣品混合，然后采用四分法多次分取樣品，共2 kg。樣品分為3 份，1 份保存在4 ℃冰箱用于DNA 提取，測序樣品保存于-80 ℃冰箱；1 份進行自然風干，粉碎后用于理化性質測定；1 份保存于-80 ℃冰箱待用。

圖2 取樣與測溫方法

1.4 測定方法

溫度采用感應探頭（PT100，USA）測定；pH 值采用pH 測定儀（PHS-3C，中國）測定；EC 值采用電導儀（DDSJ-319L，中國）測定；全氮（TN）、有機質、水分及發(fā)芽指數指標參考《有機肥料》（NY/T 525—2021）方法測定。雜草種子滅活采用雜草種子發(fā)芽率測定：選用奶牛養(yǎng)殖飼料中常用的5 種牧草種子紫花苜蓿（豆科），菊苣（菊科），蘇丹草（禾本科），黑麥草（禾本科，青貯飼料），籽粒莧（莧科）；耕地常見雜草種子1種：狗尾草（禾本科）。將上述6 種種子約500 粒裝進孔度為0.15 mm 的尼龍網袋，將網袋放進肥堆的中心，并在網袋的扎口處系一條尼龍繩并引至在堆體外以方便種子采樣。對照組（T1 與T2）在堆肥開始前將裝有雜草種子的尼龍袋放入堆體中心，在第1、2、3、4、6、9、12、15、18、21、24、30 天取種子樣品；試驗組（T3 與T4）在堆體溫度上升至40 ℃時，將裝有雜草種子的尼龍袋放入堆體中心。在堆體溫度達到40 ℃后的第12、24、36、48、60、72 小時取種子樣品。每次取出35～40 粒種子測定發(fā)芽率[11]。堆肥樣品總DNA 采用Soil Fast DNA 快速試劑盒提?。∕P，Biomedicals，Santa Ana，Carlsbad，CA，United States），并進行Illumina HiSeq 高通量測序[12]。

1.5 數據分析

數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行數據分析，微生物種群豐度、多樣性通過Galaxy 平臺（http：//www.freebioinfo.org/）進行數據分析與作圖（結果分析的序列要求為長度＞300 bp，沒有不明確的堿基“N”，平均堿基質量得分＞30，最后生成每個樣品的OTU 用于結果分析[13]）。

2 結果與分析

2.1 翻堆措施對堆肥過程理化指標的影響

在堆肥過程中，溫度是反映有機物分解和微生物生長的重要因素。由圖3a 可知，在采用翻堆措施后，試驗組T3、T4 處理在第3 天至第21 天的溫度均與對照組（T1 與T2）呈極顯著差異（P＜0.01），T4 與T3 處理在第3 天至第21 天的溫度無顯著差異（P＞0.05）。T4 處理的堆體最高溫度與升溫速度高于對照組（T1 和T2），且高溫期（≥55 ℃）持續(xù)時間得到延長。T4 處理最高溫度可達到61.33 ℃，而T3 處理最高溫度為56.67 ℃，對照組（T1 和T2）的最高溫度僅為23.00 ℃和36.67 ℃。T4 和T3 處理的高溫期（≥55 ℃）持續(xù)時間分別為9 d 和3 d，說明較高的翻堆頻率能夠提高堆體的最高溫度與延長高溫期持續(xù)時間。由圖3b 可知，試驗組（T3 和T4）的水分去除率分別達到33.84%和37.48%。對照組（T1 和T2）由于堆體溫度較低，水分去除率僅為5.62%和20.64%。堆肥過程中所有處理的全氮含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢，由圖3c 可知，試驗組（T3 和T4）的全氮含量呈現(xiàn)下降趨勢，對照組（T2）的全氮含量呈現(xiàn)上升趨勢。由圖3d 可知，堆肥過程中的有機質含量整體處于下降趨勢，其中，T4 處理的有機質含量下降幅度最大，降幅達到39.81%；其次是T3 處理，降幅為31.15%；對照組（T1 和T2）的有機質含量沒有明顯降低，降幅僅為2.52%和2.96%。相關研究表明，EC 值高于4 ms/cm時，堆肥產物有可能具有植物毒性，并對作物生長產生影響，因此該堆肥產物不適用于制作成有機肥產品并進行農田施用[14]。由圖3e 可知，經過60 d 發(fā)酵后，所有處理堆肥產物的EC 值未超過4 ms/cm，說明所有處理的堆肥產物不存在影響農業(yè)生產的隱患，T2 處理堆肥產物的EC 值顯著（P<0.05）高于T1、T3 和T4 處理；與對照組相比，試驗組的產物EC 值較低。堆肥過程中所有處理的pH 值變化規(guī)律相似，由圖3f 可知，在堆肥開始的前9 d pH 值增加，然后開始下降，到堆肥第25 天左右開始波動。所有處理的堆肥產物pH 值均為7.8～8.3，T4 處理的最終pH 值為8.15。上述結果表明，翻堆措施能夠提高堆體的最高溫度，延長高溫期持續(xù)時間，有效降低堆體水分含量，對大分子有機物具有良好的降解效果。

圖3 堆肥過程中溫度（a）、水分（b）、全氮（c）、有機質（d）、EC 值（e）及pH 值（f）變化規(guī)律

2.2 翻堆措施對堆肥過程腐熟度的影響

腐熟度是評價堆肥產物是否完成好氧發(fā)酵的重要指標，目前評價堆肥產物的腐熟度一般采用碳氮比與種子發(fā)芽指數兩項指標[15-16]。由圖4a 可知，經過60 d 發(fā)酵后，堆肥物料的C/N 整體呈下降趨勢，試驗組（T3 和T4）C/N 分別由初始的19.07 和15.50 下降至13.51 和10.55，基本達到了堆肥腐熟標準；而對照組T1 處理的C/N 下降較慢，堆肥結束后C/N為15.44。由圖4b 可知，與對照組相比，試驗組的發(fā)芽指數顯著（P<0.05）提高，對照組（T1 和T2）的發(fā)芽指數相對較低，堆肥60 d 后發(fā)芽指數仍低于70%；而采用翻堆措施的試驗組（T3 和T4）在發(fā)酵第30 天的發(fā)芽指數分別達到84.90%和73.32%。因此，翻堆措施對堆肥產品的腐熟度有積極影響。

圖4 堆肥過程中C/N（a）和發(fā)芽指數（b）變化規(guī)律

2.3 翻堆措施對堆肥過程無害化程度的影響

雜草種子滅活率是衡量堆肥成品的安全限定指標，而堆體溫度是降低雜草種子發(fā)芽率的有效措施[16]。研究表明，當堆體溫度達到50 ℃并保持5 d 以上時，可以有效殺滅各種類型的雜草種子[11]。為了研究堆體溫度在≥40 ℃條件時對雜草種子的滅活效果，本次試驗設置了＜40 ℃（圖5a）及≥40 ℃（圖5b）兩種堆體溫度條件。由圖5a 可知，在對照組（T1 與T2）中，由于堆體最高溫度均未超過40 ℃，雜草種子在堆體溫度＜40 ℃條件下未能實現(xiàn)100%的滅活，在堆體發(fā)酵進行到第28 天時，籽粒莧的發(fā)芽率仍然達到67.5%，狗尾草發(fā)芽率為9.2%，表明傳統(tǒng)堆肥存在將雜草種子帶入土壤的隱患[17]。由圖5b 可知，與對照組相比，試驗組的堆體溫度在堆肥開始后第3 天即可達到≥40 ℃，在第6 天才達到50 ℃以上，而試驗組在試驗第5 天雜草種子發(fā)芽率為0。試驗結果表明，翻堆措施能夠通過提高堆體溫度從而實現(xiàn)對堆體中雜草種子的滅活，且當堆體溫度達到40 ℃以上并持續(xù)2 d 時，即可實現(xiàn)對雜草種子的全部滅活。

圖5 不同溫度條件下雜草種子發(fā)芽率

2.4 翻堆措施對堆肥過程微生物種群豐度及多樣性的影響

堆肥中的微生物群落在調節(jié)堆肥過程與堆肥產品質量方面起到了重要作用[18]。對所有的堆肥樣品進行16S rRNA 高通量測序得到微生物組數據。從156 個樣本中共獲得27 582 125 條16S rRNA 序列，每個樣本有21 954 到789 581 個序列。這些序列分為3 254 184 個OTU（＞97%同一性）。由圖6 可知，堆肥樣品中大多數微生物物種在門水平上屬于Bacteroidetes（擬桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Chloroflexi（綠灣菌門）、Euryarchaeota（廣古菌門）和Deinococcus-Thermus（異常球菌-棲熱菌門）。與對照組（T1）相比，翻堆措施能夠提升Deinococcus-Thermus 的相對豐度，采用翻堆措施的條件下，T3 和T4 處理的相對豐度分別從1.52%和1.33% 提升到11.54%和12.48%，在堆肥開始后的第6 天，T4 處理的相對豐度提升至8.35%，而同期沒有進行翻堆措施的對照組（T2）相對豐度僅為2.89%。Chloroflexi 的相對豐度也得到有效提高，T3 和T4 處理的相對豐度分別從1.98%和2.54% 提升到24.35%和19.54%。結果表明，采取翻堆措施的堆體中Deinococcus-Thermus 和Chloroflexi 的相對豐度較高。Chloroflexi的相對豐度增加，表明堆體中Chloroflexi 的微生物代謝活性持續(xù)增強，能夠在堆肥升溫期對不同類型的碳源進行降解，從而實現(xiàn)堆體的快速升溫[19]。而Deinococcus-Thermus 能夠在堆體進入高溫期后繼續(xù)對大分子有機物進行降解[20]。

圖6 不同處理微生物種群豐度（門水平）

大多數微生物物種在綱水平上屬于Gammaproteobacteria（γ 變形桿菌綱）、Actinobacteria（放線菌綱）、Bacteroidia（擬桿菌綱）、Flavobacteriia（黃小桿菌綱）、Clostridia（梭菌綱）、Anaerolineae（厭氧繩菌綱）、Bacilli（桿菌綱）、Deinococci（異常球菌綱）、Alphaproteobacteria（α 變形桿菌綱）和Methanomicrobia（甲烷微菌綱）等。由圖7 可知，翻堆措施能夠提高Deinococci 的相對豐度，T3 處理由1.12%提升至4.85%、T4 處理由0.89%提升至7.18%，而沒有采用翻堆措施的T2 處理僅從0.38% 提升至2.14%。對照組T2 處理堆體中Methanomicrobia 的相對豐度較高，說明堆體內部出現(xiàn)了厭氧發(fā)酵，堆體會產生甲烷。上述結果表明，翻堆措施能夠促進堆體中土著微生物的活性，從而促進土著微生物對大分子有機物的降解。

圖7 不同處理微生物種群豐度（綱水平）

α 多樣性指數通過比較不同處理的Shannon-Wiener、Inverted Simpson 和Pielous Eveness 指數確定堆體中土著微生物多樣性[21]。由圖8 可知，翻堆措施能夠顯著影響堆體中細菌α 多樣性，4 個處理的細菌群落豐度、多樣性和均勻度在整個堆肥周期中呈現(xiàn)出相同的趨勢。添加輔料但不采取翻堆措施（T2）處理的微生物種群多樣性和均勻度在堆肥過程中最高。在添加輔料的基礎上采取翻堆措施（T3 和T4），會導致微生物細菌群落多樣性有所下降，這是因為堆體溫度的升高會降低中溫與低溫微生物的相對豐度，但與T1 處理相比，堆體中細菌微生物種群豐度、多樣性和均勻度仍然得到提高。

圖8 微生物細菌α 多樣性

3 結論與討論

本研究表明，在堆肥過程中采用原料配比與翻堆措施，對堆體的升溫速度、高溫持續(xù)時間、水分含量、全氮、有機質及發(fā)芽指數均產生了影響，與相關研究結果一致。堆肥開始時需調節(jié)初始物料C/N，適宜的C/N 能夠有利于堆肥，一般情況下適宜的C/N范圍為25∶1～30∶1[22]。但相關研究也表明，低C/N 物料（15∶1～20∶1）的堆體溫度也可以達到60 ℃以上[23-25]，本研究物料的初始C/N 較低，通過在堆肥過程中采用翻堆措施實現(xiàn)對堆體的氧氣補充，能夠滿足堆體內土著微生物對氧氣的需求。堆體中土著微生物在對大分子有機物降解過程中會產生更多代謝熱量，從而使低C/N 物料也能夠快速升溫與延長高溫期持續(xù)時間[26]。翻堆措施還能夠促進堆體的生物熱能效率[27]，使堆體通過微生物代謝熱快速去除水分[28]。同時，翻堆措施會提高堆體內微生物對不同類型有機物的降解能力，并消耗更多的氮源物質，從而導致堆肥過程中的全氮與有機質含量降低[29-30]。同時，堆肥產物實現(xiàn)腐熟是由于堆體內有機物經過微生物礦化和腐殖化達到穩(wěn)定的結果，因此腐熟度較高的堆肥產物會提高發(fā)芽指數[31]。而傳統(tǒng)堆漚由于堆體結構較差，并且沒有為堆體補充氧氣，導致堆體內微生物活性較低，從而使堆體無法升溫、水分去除效率低、全氮含量較高、有機質降解效率及發(fā)芽指數較低。

研究表明，好氧發(fā)酵在不同階段的優(yōu)勢微生物種群是不同的，隨著堆體進入高溫期，Deinococci 的相對豐度得到增加，這類微生物通常在堆肥的高溫階段發(fā)現(xiàn)[32]，高溫期堆體提高了嗜熱微生物的豐度與活性，增強了嗜熱微生物代謝功能，減少了低溫或中溫微生物的相對豐度，使堆體在高溫期能夠繼續(xù)對有機物進行降解，但堆體中細菌多樣性也會降低[33]。然而，采用翻堆措施的堆體中仍然存在Anaerolineae，說明即使采取了原料配比與翻堆措施，堆體中仍存在局部厭氧發(fā)酵的現(xiàn)象。

本研究表明，目前對照組沒有高溫發(fā)酵過程，發(fā)芽指數較低，同時微生物組成中厭氧微生物相對豐度較高。而采用較高翻堆頻率的試驗組能夠提高堆體的最高溫度并延長高溫期持續(xù)時間，有利于去除堆體中的水分，降低堆肥成品中全氮和有機質含量，提高堆肥成品的腐熟度（發(fā)芽指數為77.11%，C/N 降低至10.55）及無害化程度（雜草種子發(fā)芽率為0），以及改變堆體中細菌種群組成，降低堆體中細菌種群多樣性，增加嗜熱菌的相對豐度，使堆肥產品能夠滿足《畜禽糞便堆肥技術規(guī)范》（NY/T 3442—2019）的要求。