崔麗娟 薛 潔 彭志美

(河北省邯鄲市第一醫(yī)院產(chǎn)科，邯鄲市 056000，電子郵箱：gapah_310112845@163.com)

鐵是人體重要的微量元素之一，是合成血紅蛋白的重要成分，所以鐵缺乏極易造成缺鐵性貧血(iron deficiency anemia，IDA)。IDA是妊娠期女性最常見的營養(yǎng)缺乏性疾病，會造成早產(chǎn)、新生兒低出生體重等不良后果[1]。有研究顯示，妊娠期鐵缺乏會嚴重影響子代的生長發(fā)育和神經(jīng)功能，而及時外源性補充鐵可以有效地改善妊娠結(jié)局[2]。

維生素A在維持機體生長發(fā)育、鐵代謝平衡等方面均發(fā)揮重要作用[3]。生長激素(growth hormone，GH)由垂體分泌，受生長激素釋放激素和生長抑素的調(diào)節(jié)，可通過促進肝臟分泌胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)調(diào)控生長和發(fā)育[4]。此外，GH/IGF-1軸還對貧血的發(fā)生有一定的影響[5]。因此，本研究觀察補充維生素A對IDA雌鼠妊娠期貧血狀況和子代生長、發(fā)育與鐵代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級Wistar雌性大鼠30只，6周齡，體重140～160 g；雄性大鼠15只，6周齡，體重150～170 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2018-0001。本實驗經(jīng)邯鄲市第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批(審批號：HDSDYYY20190152)。

1.2 試劑和儀器 維生素A購自美國Sigma公司(批號：5.00849)；標準飼料和低鐵飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司(貨號：TP0306C、TP0306)；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司(批號：10296010、K1622)；RIPA裂解液和二喹啉甲酸試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司(批號：P0013；P0011)；可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(soluble transferrin receptor，sTfR)、血清鐵蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自上海仁捷生物科技有限公司(批號：RJ13215、RJ-16112)；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1，TfR1)、鐵蛋白輕鏈(ferritin light chain，F(xiàn)TL)、鐵調(diào)素及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體購自美國Abcam公司(批號：ab269513、ab69090、ab187778、ab8245)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自北京索萊寶生物科技有限公司(批號：SE132)。全自動血細胞分析儀購自廣東省深圳邁瑞生物公司(型號：BC-5390CRP)；實時定量PCR儀購自北京六一生物科技有限公司(型號：WD-9402A)；多功能酶標儀購自美國Bio-Rad公司(型號：1681130A)。

1.3 IDA孕鼠模型制備及維生素A補充治療 適應性飼養(yǎng)1周后，將30只雌性大鼠隨機分為對照組(10只)和缺鐵組(20只)。分別給予對照組、缺鐵組標準飼料、低鐵飼料喂養(yǎng)，其中低鐵飼料的主要成分為全脂奶粉(68.0%)、葡萄糖(22.0%)、酪蛋白(6.0%)、混合鹽(4.0%)、混合維生素(0.3 g/kg)(包括維生素A、維生素C、維生素D、維生素E、維生素K、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12和煙酸、泛酸、葉酸，其中維生素A含量≥14 000 IU/kg，維生素D和維生素E分別≥1 500 IU/kg和120 IU/kg)。4周后，將30只雌性大鼠與15只雄性大鼠以2 ∶1的比例合籠飼養(yǎng)；次日清晨觀察雌鼠陰道口，若出現(xiàn)陰栓，則為成功受孕，記為孕第0天。本研究中所有雌鼠均成功受孕。將受孕后的雌鼠分籠飼養(yǎng)，缺鐵組孕鼠仍用低鐵飼料喂養(yǎng)，對照組孕鼠仍用標準飼料喂養(yǎng)，直至分娩。在孕第0天將缺鐵組20只雌性大鼠隨機分為模型組和治療組，每組10只。從孕第1天開始，治療組大鼠灌胃維生素A[200 μg/(kg·d)，溶于油溶液]5 mL/(kg·d)，對照組和模型組僅灌胃油溶液5 mL/(kg·d)，均1次/d，直至分娩。

1.4 血液學指標的檢測 分別在分組喂養(yǎng)前和分組喂養(yǎng)4周后及孕末期(孕17 d)3個時間點，采集各組雌鼠眼內(nèi)眥靜脈血2 mL，使用全自動血細胞分析儀檢測血紅蛋白、血細胞比容(hematocrit，HCT)、平均紅細胞體積(mean corpuscular volume，MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)、紅細胞分布寬度(red blood cell distribution width，RDW)。

1.5 仔鼠一般資料的收集 統(tǒng)計各組存活仔鼠出生體重、活胎數(shù)、死胎數(shù)，計算仔鼠存活率。

1.6 雌鼠和仔鼠血清鐵蛋白和sTfR水平的測定 分組喂養(yǎng)前、分組喂養(yǎng)4周后及孕末期3個時間點，采集雌鼠眼內(nèi)眥靜脈血2 mL；根據(jù)隨機數(shù)字表法，從每組存活的仔鼠中取10只，出生后頸椎脫臼法處死(本研究全部用此方法處死)，采集主動脈血2 mL。常溫環(huán)境下，將血標本離心10 min(3 000 r/min，離心半徑為8 cm)，收集上清液。ELISA法檢測血清鐵蛋白和sTfR含量。分別設置空白孔、標準孔和樣品孔。經(jīng)酶標包被的96孔板空白孔加50 μL 磷酸緩沖鹽溶液，標準孔加50 μL標準品，樣品孔加40 μL樣品稀釋液，再加10 μL待測樣品。錫紙封板后37℃孵育30 min，洗滌液洗板5次，30 s/次。除空白孔外，其余孔加50 μL酶標試劑，37℃孵育30 min，洗滌液洗板5次，30 s/次。各孔先加A顯色劑50 μL，再加B顯色劑50 μL，振蕩混勻后封板，37℃避光孵育10 min。加入50 μL終止液終止反應，5 min后置于酶標儀上測定波長450 nm處吸光度值。

1.7 雌鼠垂體中GH和肝臟中IGF-1 mRNA相對表達水平的檢測 雌鼠自然分娩后，各取10只處死，無菌條件下取雌鼠垂體和部分肝組織，采用實時定量PCR法檢測垂體中GH和肝臟中IGF-1 的mRNA相對表達水平。根據(jù)RNA提取試劑盒說明書步驟，提取垂體和肝組織中總RNA，以500 ng總RNA作為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。配制PCR反應體系，包括10 μL SYBR GreenⅠ、正反向引物各1.4 μL、2 μL cDNA模板、6.6 μL無酶水。反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃延伸10 s，共40個循環(huán)，所有樣品均重復操作3次。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△CT法計算GH和IGF-1 mRNA相對表達水平。GH和IGF-1的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 仔鼠肝組織中TfR1、FTL、鐵調(diào)素的蛋白相對表達水平的檢測 無菌條件下取仔鼠10只處死后取部分肝組織，液氮中研磨，加入RIPA裂解液1 mL冰上靜置30 min。根據(jù)二喹啉甲酸試劑盒說明書測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10 min使蛋白質(zhì)變性。配制濃縮膠和分離膠，蛋白上樣20 μL，120 V恒壓電泳2 h，0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)2 h，結(jié)束濕轉(zhuǎn)。室溫封閉1 h，TfR1、FTL、鐵調(diào)素和GAPDH一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，5 min/次，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，5 min/次。采用化學發(fā)光法顯色，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析 用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料均以(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)前后對比采用配對t檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組雌鼠的血液學指標的比較 分組喂養(yǎng)前，對照組和缺鐵組大鼠血液學指標差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；分組喂養(yǎng)4周后，對照組各個指標與分組喂養(yǎng)前比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，但缺鐵組血紅蛋白、HCT、MCV、MCH和MCHC均低于分組喂養(yǎng)前和對照組，RDW高于分組喂養(yǎng)前和對照組(均P<0.05)。見表2。

在孕末期，對照組、模型組和治療組大鼠血液學指標差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。對照組、治療組、模型組血紅蛋白、HCT、MCV、MCH和MCHC均依次降低，RDW依次升高(均P<0.05)。見表3。

表2 分組喂養(yǎng)前后對照組和缺鐵組大鼠血液學指標的比較 (x±s)

組別nMCV(fL)分組喂養(yǎng)前分組喂養(yǎng)4周后t值P值MCH(pg)分組喂養(yǎng)前分組喂養(yǎng)4周后t值P值對照組1058.27±2.1256.33±2.641.8120.08724.14±2.5825.82±2.531.4700.159缺鐵組2059.06±2.3331.50±2.2737.889<0.00123.50±2.5513.17±2.4812.987<0.001 t值0.90126.7670.64613.085P值0.375<0.0010.524<0.001

組別nMCHC(g/L)分組喂養(yǎng)前分組喂養(yǎng)4周后t值P值RDW(%)分組喂養(yǎng)前分組喂養(yǎng)4周后t值P值對照組10326.17±15.80331.64±15.400.7840.44314.22±1.5315.30±2.041.3390.197缺鐵組20325.44±16.69301.47±16.384.584<0.00114.15±2.0228.70±3.1117.546<0.001 t值0.1154.8470.09612.309P值0.909<0.0010.924<0.001

表3 孕末期對照組、模型組和治療組大鼠血液學指標的比較 (x±s)

2.2 各組雌鼠血清鐵蛋白和sTfR水平的比較 分組喂養(yǎng)前，對照組和缺鐵組大鼠血清鐵蛋白和sTfR水平差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；分組喂養(yǎng)4周后，對照組大鼠血清鐵蛋白和sTfR水平與分組喂養(yǎng)前比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，但缺鐵組大鼠血清鐵蛋白水平低于分組喂養(yǎng)前和對照組，sTfR水平高于分組喂養(yǎng)前和對照組(均P<0.05)。見表4。

孕末期，3組大鼠血清鐵蛋白和sTfR水平差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。對照組、治療組、模型組血清鐵蛋白水平依次降低，而血清sTfR水平依次升高(均P<0.05)。見表5。

表4 分組喂養(yǎng)前后對照組和缺鐵組大鼠血清鐵蛋白和sTfR水平的比較 (x±s)

表5 孕末期對照組、模型組和治療組大鼠血清鐵蛋白和sTfR水平的比較(x±s)

2.3 對照組、模型組和治療組仔鼠一般情況的比較 對照組、治療組、模型組仔鼠的存活率、存活仔鼠出生體重均依次降低(均P<0.05)，見表6。

表6 對照組、模型組和治療組仔鼠一般情況的比較

2.4 對照組、模型組和治療組仔鼠的血清鐵蛋白和sTfR水平的比較 對照組、治療組、模型組仔鼠的血清鐵蛋白水平依次降低，而sTfR水平依次升高(均P<0.05)，見表7。

表7 對照組、模型組和治療組仔鼠血清鐵蛋白和sTfR含量的比較 (x±s)

2.5 對照組、模型組和治療組雌鼠GH和IGF-1的mRNA相對表達水平的比較 對照組、治療組、模型組雌鼠垂體組織中GH和肝組織中IGF-1的mRNA相對表達水平均依次降低(均P<0.05)，見表8。

表8 對照組、模型組和治療組雌鼠GH和IGF-1的mRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.6 對照組、模型組和治療組仔鼠肝組織中TfR1、FTL和鐵調(diào)素的蛋白相對表達水平的比較 對照組、治療組、模型組仔鼠肝組織中FTL、鐵調(diào)素的蛋白相對表達水平依次降低，而TfR1的蛋白相對表達量依次升高(均P<0.05)，見表9和圖1。

表9 對照組、模型組和治療組仔鼠肝臟組織中TfR1、FTL、鐵調(diào)素的蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖1 肝臟中各蛋白表達

3 討 論

IDA是目前發(fā)病率最高的微量元素缺乏癥之一[6]，是造成不良妊娠結(jié)局的重要原因之一，同時可嚴重影響子代的生長發(fā)育。維生素A是一種脂溶性維生素，是促進機體生長發(fā)育必需的微量營養(yǎng)物質(zhì)，其可影響機體的鐵代謝平衡[3]。一項涉及488對母親-新生兒的調(diào)查研究顯示，維生素A缺乏可導致孕婦血紅蛋白水平降低，增加孕婦發(fā)生貧血的風險，而且新生兒出生體重偏低[7]。由此可見，維生素A缺乏可影響鐵代謝，導致孕婦出現(xiàn)貧血，并影響子代的生長發(fā)育。臨床研究表明，補充維生素A還可調(diào)節(jié)孕婦和哺乳期婦女的鐵代謝平衡[8]。而動物實驗表明，在飼料中添加維生素A可增加幼鵝肝組織中維生素A的水平，促進其生長與發(fā)育[9]；在妊娠后期補充維生素A可以增加子代牛的出生體重和促進子代牛肌肉的發(fā)育[10]。但是補充維生素A對IDA患者妊娠期貧血狀況和對其子代的影響仍需進一步探討。

血紅蛋白、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW是檢測貧血的常用指標，血清鐵蛋白和sTfR常用于評價機體鐵營養(yǎng)狀況。本研究分組喂養(yǎng)雌鼠4周后，缺鐵組雌鼠血液中血紅蛋白、HCT、MCV、MCH、MCHC和血清鐵蛋白水平均低于分組喂養(yǎng)前和對照組，RDW和血清sTfR含量高于分組喂養(yǎng)前水平和對照組(P<0.05)，說明成功建立IDA雌鼠模型。在雌鼠受孕后，給予部分IDA雌鼠灌胃維生素A治療，結(jié)果顯示，治療組雌鼠的血紅蛋白、HCT、MCV、MCH、MCHC和血清鐵蛋白水平均高于模型組，RDW和血清sTfR水平低于模型組(P<0.05)，提示外源性補充維生素A可提高IDA雌鼠妊娠期機體的鐵含量，從而改善其貧血狀況。

GH是一種具有多種生理功能的生長調(diào)節(jié)激素。研究表明，母體或新生兒暴露于二噁英環(huán)境時GH分泌降低，導致生長遲緩，引起生長發(fā)育障礙，而補充GH可以改善二噁英造成的毒性反應[11]。IGF-1是一種肽類激素，主要在肝臟合成，受垂體分泌的GH調(diào)節(jié)；IGF-1通過與其受體結(jié)合，調(diào)控細胞的增殖、分化和機體的生長、發(fā)育。因此，GH/IGF-1軸在促進機體生長與發(fā)育方面具有重要作用。此外，還有研究表明，GH水平的降低與紅細胞、血紅蛋白和HCT的降低密切相關(guān)，GH缺乏嚴重影響兒童造血功能[12]。IGF-1水平也與血紅蛋白水平呈正相關(guān)[13]。由此可見，GH、IGF-1水平降低還與貧血密切相關(guān)。有學者發(fā)現(xiàn)，與使用標準飼料喂養(yǎng)的大鼠比較，使用維生素A缺乏的飼料喂養(yǎng)生長期大鼠10周后血清GH和IGF-1水平明顯降低，認為維生素A可顯著地影響血清GH和IGF-1的表達[14]。因此，我們推測維生素A改善IDA的作用可能與調(diào)控GH/IGF-1軸有關(guān)?；诖?，本研究檢測雌鼠垂體和肝臟組織中GH和IGF-1的mRNA相對表達水平，結(jié)果顯示，模型組雌鼠垂體和肝臟組織中GH和肝臟組織中IGF-1的mRNA相對表達水平與治療組和對照組相比降低，而補充維生素A的治療組雌鼠GH和IGF-1的mRNA相對表達水平與模型組相比升高(P<0.05)，這表明維生素A可能通過調(diào)節(jié)GH/IGF-1軸促進機體造血，改善妊娠雌鼠的IDA。

本研究中，我們還觀察了各組仔鼠存活率，以及存活仔鼠的出生體重、血清鐵蛋白和sTfR含量，結(jié)果顯示，與對照組和治療組相比，模型組仔鼠存活率、出生體重降低，血清鐵蛋白水平降低而sTfR水平升高(均P<0.05)，這說明雌鼠發(fā)生IDA可導致子代的低存活率和低出生體重；而與模型組相比，補充維生素A的治療組仔鼠存活率、出生體重均升高，血清鐵蛋白水平升高、sTfR水平降低(均P<0.05)，這提示補充維生素A可以提高IDA孕鼠的子代存活率，調(diào)節(jié)子代機體的鐵平衡，保證其正常的生長發(fā)育。

鐵調(diào)素是調(diào)節(jié)腸道鐵吸收的重要因子；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在鐵的運輸、轉(zhuǎn)化和利用過程中起關(guān)鍵作用；鐵蛋白有重鏈和輕鏈兩種亞基，重鏈發(fā)揮氧化鐵離子的作用，具有亞鐵氧化酶活性，輕鏈在鐵離子核化中具有重要作用，可以維持鐵蛋白穩(wěn)定性。研究顯示，TfR1通過介導不同轉(zhuǎn)鐵蛋白的內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)運鐵，而且TfR1特異性敲除小鼠的死亡率明顯增高，TfR1缺陷會阻礙造血前體細胞的增殖和分化，降低造血干細胞的再生潛能[15]。肝細胞中TfR1缺乏會降低肝細胞從轉(zhuǎn)鐵蛋白中對鐵的吸收率，同時TfR1通過微調(diào)鐵調(diào)素，調(diào)節(jié)肝細胞鐵負荷，維持機體鐵穩(wěn)定[16]。鐵調(diào)素可以降低鐵轉(zhuǎn)運蛋白的表達，抑制腦出血后鐵積累介導的神經(jīng)毒性，還可以降低2型糖尿病大鼠海馬鐵沉積，從而改善大鼠認知功能障礙[17-18]。由此可見，TfR1、FTL和鐵調(diào)素是調(diào)節(jié)機體和細胞鐵代謝的重要因子，可以維持鐵元素處于穩(wěn)定狀態(tài)。本研究取仔鼠肝臟，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測TfR1、FTL和鐵調(diào)素的蛋白相對表達水平，結(jié)果顯示模型組FTL和鐵調(diào)素的蛋白相對表達水平降低，TfR1的蛋白相對表達水平較對照組和治療組升高，而治療組FTL和鐵調(diào)素的蛋白相對表達水平較模型組升高，TfR1的蛋白相對表達水平降低(均P<0.05)。這提示給予IDA雌鼠補充維生素A，有利于調(diào)節(jié)仔鼠體內(nèi)鐵代謝相關(guān)蛋白的表達，從而維持仔鼠的鐵代謝平衡，以促進其正常的生長發(fā)育。

綜上所述，補充維生素A可改善IDA大鼠妊娠期的貧血狀況，這可能與其通過調(diào)節(jié)GH/IGF-1軸改善機體造血功能有關(guān)；同時，給予孕鼠補充外源性維生素A還可通過調(diào)節(jié)子代體內(nèi)鐵代謝相關(guān)蛋白的表達維持鐵代謝平衡，從而促進子代生長發(fā)育。這或可為IDA孕婦或妊娠期IDA的臨床干預提供一定的依據(jù)。