王 芳，包怡紅，陳 忱

1 北大荒完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司質(zhì)檢中心，黑龍江哈爾濱 150078

2 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150000

0 引言

葉黃素是一種脂溶性維生素，又叫“植物黃體素”，是人體所需的營養(yǎng)元素之一。在人體內(nèi)，葉黃素大多數(shù)存在于眼睛的黃斑區(qū)和血漿中，是人眼中僅存在的兩種胡蘿卜素之一，能保護光成分，有效地預(yù)防視網(wǎng)膜損傷，防止視力退化，促進嬰幼兒視力發(fā)育。除此之外，葉黃素還可以抗氧化、抗衰老，對于多種疾病有很好的預(yù)防作用，例如心腦血管疾病及肺癌等。故葉黃素是嬰幼兒成長及人體預(yù)防疾病的重要營養(yǎng)素[1～4]。

母乳是嬰幼兒最理想的營養(yǎng)食物。倡導(dǎo)寶寶出生后母乳喂養(yǎng)，可確保嬰兒的健康成長發(fā)育。嬰兒時期，其視力發(fā)育離不開葉黃素。葉黃素的攝入來源主要包括母乳或嬰幼兒配方奶粉[5，6]。經(jīng)過對母乳的研究發(fā)現(xiàn)，每100 g母乳中含有幾十微克葉黃素，并且能夠被嬰幼兒100%吸收。但在沒有母乳或母乳缺乏時，嬰幼兒配方奶粉中的葉黃素則顯得尤為重要。因此，葉黃素含量能否滿足嬰幼兒的需求成為對嬰幼兒配方奶粉全面營養(yǎng)的要求[7～10]。

本文通過對比嬰幼兒配方奶粉中葉黃素在不同處理條件下的含量情況，分析影響葉黃素含量的因素，為深入研究提高葉黃素提取率的方法提供方向。

1 材料與試驗方法

1.1 儀器設(shè)備與標(biāo)準(zhǔn)品

1.1.1 儀器設(shè)備

液相色譜儀（紫外檢測器），美國Perkin Elmer股份有限公司；紫外可見分光光度計，島津（中國）有限公司；電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；旋渦振蕩器，德國IKA集團；離心機，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液

購買經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：127-40-2），葉黃素儲備液：濃度c=50.000 0 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)工作液：從葉黃素標(biāo)準(zhǔn)貯備液中準(zhǔn)確移取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液到25.00 mL棕色容量瓶中，0.1% 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）乙醇溶液定容后，從而得到濃度為0.100 μg/mL、0.200 0 μg/mL、0.400 0 μg/mL、0.800 0 μg/mL、2.000 0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 試劑

10.0%和20.0%氫氧化鉀溶液。提取萃取溶劑：稱取質(zhì)量1.00 g BHT，環(huán)己烷200.00 mL溶解，與400.00 mL乙醚和400.00 mL正己烷，混合均勻。0.1%BHT乙醇溶液：稱取0.10 g BHT，以100.00 mL乙醇溶解，混勻。

1.3 試驗方法

隨機選取超市一種品牌的嬰兒配方奶粉（0～6月），較大嬰兒配方奶粉（6～12月），幼兒配方奶粉（12～36月），通過改變前處理過程中室溫避光處理條件、皂化時間、離心轉(zhuǎn)速3 個條件，其他前處理條件不變，比較葉黃素含量變化。

1.4 樣品前處理與測定

1.4.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取質(zhì)量2.00 g（精確至0.01g）均勻樣品于50.00 mL離心管中，與0.20 g BHT和10.00 mL乙醇混合均勻，再加入10.00 mL10.0%氫氧化鉀溶液，振蕩混勻1.0 min，分別室溫避光、低溫避光、高溫避光振蕩皂化時間30.0 min、20.0 min、40.0 min，并與10.00 mL萃取溶劑避光振蕩混合提取3.0 min，轉(zhuǎn)速分別為4 500 r/min、2 500 r/min、5 500 r/min，離心3.0 min，提取重復(fù)2 次。合并提取液，以10.00 mL一級水洗滌，轉(zhuǎn)速分別為4 500 r/min、2 500 r/min、5 500 r/min離心3.0 min至分層，重復(fù)洗滌1 次，合并有機相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀室溫減壓濃縮，以0.1% BHT 乙醇溶液振蕩溶解殘渣，定容至5.00 mL，過濾膜供上機液相色譜測定。

因葉黃素對光敏感，見光易分解，所有試驗過程應(yīng)在無500 nm以下紫外光的黃色光源或紅色光源試驗環(huán)境中進行。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：C30色譜柱，5 μm，250 mm×4.6 mm（內(nèi)徑）或相當(dāng)者；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇/水（88∶12，體積比，0.1% BHT）-甲基叔丁基醚（0.1% BHT），梯度洗脫時間，0.0～18.0 min，甲醇/水由100.0%變換為10.0%；18.1 min，甲醇/水由10.0%變換為100.0%，保留時間10.00 min；流動相流速：1.0 mL/min；檢測波長值：445 nm；進樣體積：10 μL。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線制作

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別注入液相色譜儀中，測定上機所得峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作液曲線。

1.4.4 試樣測定

標(biāo)準(zhǔn)工作液與待測樣品溶液等體積進樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜峰的保留時間和峰值面積，對試樣色譜峰依據(jù)保留時間進行定性（待測定樣品中色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液相比變化范圍值應(yīng)在±2.5%之內(nèi)），應(yīng)用外標(biāo)法定量。平行測定次數(shù)至少2 次。

1.5 分析結(jié)果的表述

試樣中葉黃素含量按式（1）計算。

式中：X——試樣中葉黃素的含量，單位為微克每百克（μg/100g）；c——由標(biāo)準(zhǔn)曲線而得的樣液中標(biāo)準(zhǔn)品的含量，單位為微克每毫升（μg/mL）；V——樣品最終定容體積，單位為毫升（mL）；m——稱樣量，單位為克（g）；F——校正系數(shù)。F可通過以下方式獲得：用液相色譜分析試樣溶液，將順式與反式葉黃素色譜峰面積加合作為總峰面積，其中反式葉黃素峰面積除以總峰面積所得值為校正系數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量重復(fù)性

根據(jù)國標(biāo)《GB5009.248—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉黃素的含量的測定》的測定要求，測量范圍需要覆蓋國標(biāo)方法的最低濃度水平，即定量限（LOQ）和最低濃度水平，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為0.333 7 μg/mL，0.667 4 μg/mL，1.334 9 μg/mL，2.002 3 μg/mL，2.669 8 μg/mL，3.337 2 μg/mL，所有溶度需用分光光度計校正，測定標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（規(guī)定包含0點但不強制過0點），每濃度點需測3 次，3 次數(shù)據(jù)擬合得到線性參數(shù)，溶液濃度與對應(yīng)峰面積見表1。

表1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與對應(yīng)峰面積

從試驗結(jié)果可見，最終得出葉黃素的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為Y=0.7108X+0.018，R2=0.9990。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性回歸方程相關(guān)系數(shù)值大于0.99，曲線濃度范圍覆蓋關(guān)注濃度的0.0%～150.0%，滿足《GB/T 27417—2017 合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》的要求。

采取標(biāo)準(zhǔn)偏差法，選取陰性樣品（即樣品本身不含有葉黃素），稱取10 份，每份稱取2.0 g左右然后加入210 μL濃度為1.329 6 μg/mL的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按標(biāo)準(zhǔn)方法進行檢測，檢測限（LOD）的表示方法為3 s（表2），LOQ為3 倍的LOD。

表2 方法檢出限與定量限結(jié)果分析表

圖1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線

從試驗結(jié)果可見，奶粉稱樣量為2.0 g，定容體積為5.00 mL時，方法檢出限為1.08 μg/100 g，方法定量限為3.24 μg/100 g。稱樣量2.0 g，定容體積5.00 mL時，方法檢出限為3.00 μg/100 g，方法定量限為10.00 μg/100 g，低于方法規(guī)定的檢出限和定量限。

圖2 葉黃素含量擬合結(jié)果圖

2.2 前處理條件對葉黃素含量的影響

2.2.1 皂化時間對葉黃素含量的影響

由圖3可知，皂化時間為30.0 min時，葉黃素含量為最高，1段、2段、3段含量分別為85.00 μg/100 g、190.00 μg/100 g、202.00 μg/100 g。說明皂化時間對葉黃素含量影響較大，皂化時間過短和過長都影響葉黃素含量，主要由于皂化時間可充分皂化提取更多的游離葉黃素。

圖3 皂化時間對葉黃素含量的影響

2.2.2 皂化環(huán)境對葉黃素含量的影響

由圖4可知，低溫4 ℃和高溫40 ℃都不利于葉黃素的提取，在室溫25 ℃避光最有利于皂化環(huán)境，說明皂化環(huán)境改變不利于葉黃素的提取。注意試驗全程應(yīng)在避光條件下，防止葉黃素見光分解。

圖4 皂化環(huán)境對葉黃素含量的影響

2.2.3 離心轉(zhuǎn)速對葉黃素含量的影響

由圖5可知當(dāng)離心轉(zhuǎn)速低于4 500 r/min時，離心效果不顯著，葉黃素含量略低；當(dāng)離心轉(zhuǎn)速達(dá)到4 500 r/min以上時，葉黃素含量無顯著變化，說明離心轉(zhuǎn)速對葉黃素含量影響不大。

圖5 離心轉(zhuǎn)速對葉黃素含量的影響

3 討論

本試驗通過改變前處理皂化時間、皂化環(huán)境和離心轉(zhuǎn)速條件改變，研究葉黃素含量的變化。結(jié)果表明，皂化時間和環(huán)境變化對葉黃素含量影響最大，皂化時間過短和過長都影響葉黃素含量；低溫4 ℃和高溫40 ℃都不利于葉黃素的提取，離心轉(zhuǎn)速對葉黃素含量影響較小。

葉黃素的功能主要為抗氧化和緩解視疲勞，是嬰幼兒不可缺少的主要營養(yǎng)元素之一。為了更好的滿足嬰幼兒視力發(fā)育所需，嬰幼兒配方奶粉中葉黃素的添加必不可少，并盡可能使嬰幼兒配方奶粉與母乳養(yǎng)分成分的吸收率更為接近。葉黃素提取率在近幾年仍將是備受矚目的研究領(lǐng)域及方向[10～15]。