林靈超，黃 燕

(浙江福立分析儀器股份有限公司，浙江 臺州 317500)

近年來，我國糖尿病患病率顯著增加，根據(jù)2015至2017年中華醫(yī)學會內(nèi)分泌學會對于糖尿病的流行病學調(diào)查顯示，我國18歲及以上人群糖尿病患病率為11.2%[1].作為糖尿病防治指南[2]的推薦用藥，參芪降糖膠囊可聯(lián)合其他常用降糖藥物改善和治療因氣陰兩虛導致的相關癥狀[3-4]，具有較為重要的臨床使用價值.

目前在參芪降糖膠囊的質(zhì)量研究中，主要采用高效液相色譜法[5-6]和超高效液相色譜法[7-9]測定人參皂苷的含量.受到常規(guī)高效液相色譜系統(tǒng)的性能限制，高效液相色譜法常常采用5 μm全多孔填料，在檢測參芪降糖膠囊中人參皂苷的含量時，普遍存在分析時間過長(含平衡時間至少在120 min以上)、消耗有機溶劑過多、無法滿足復雜樣品對分離和分析等缺點.超高效液相色譜法則充分發(fā)揮了小粒徑全多孔填料(sub-2 μm)的性能，具有較高的分析通量，但需要超高效色譜系統(tǒng)的硬件性能與之匹配才行[10-11]，包括高壓溶劑輸送單元、低死體積的色譜系統(tǒng)、快速的檢測器和自動進樣器以及高速的數(shù)據(jù)采集和控制系統(tǒng)，所以超高效色譜系統(tǒng)的硬件成本、維修成本非常高.同時系統(tǒng)常常面臨堵塞、故障率高的風險，客戶操作體驗感急劇下降.在方法轉(zhuǎn)移時也會引入其他諸多問題[12-13].所以超高效色譜法的推廣受到了極大地限制，始終無法有效普及到中藥材以及中藥制劑企業(yè)中去.

近年來，核殼型分離填料在快速分析行業(yè)中的應用逐漸引起關注.與5 μm全多孔填料相比，核殼型分離填料可顯著縮短分析時間、改善分離效果、提高靈敏度和分辨率.與小粒徑全多孔填料(sub-2 μm)相比，核殼型分離填料具有上樣量大、色譜柱通透性好、背壓低等優(yōu)勢[14-17].但相關的研究均是以2.6 μm核殼型分離填料為主，此時也只有超高效液相色譜系統(tǒng)才能滿足對其柱外譜帶展寬的要求[18].另外也偶見2 μm以下的核殼型分離填料的分析報道[19]，但至今未出現(xiàn)商品化的超高效液相色譜系統(tǒng)與之兼容.

3.5 μm核殼型分離填料是由2.3 μm直徑的超純實心硅膠核以及外層的厚度為0.6 μm的多孔層組成，同樣可縮短待分析物質(zhì)在填料顆粒內(nèi)的擴散路徑，加快其傳質(zhì)速度，從而實現(xiàn)高柱效和快速分析[20].因此本研究基于3.5 μm Coreshell C18核殼型分離填料(3.0 mm×150 mm)進行參芪降糖膠囊中人參皂苷含量的測定，在現(xiàn)有常規(guī)高效液相色譜系統(tǒng)的基礎上，即可實現(xiàn)人參皂苷的高柱效、高通量等分析，可以為參芪降糖膠囊的質(zhì)量控制提供更易被接受和普及的方法.

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC5190型高效液相色譜系統(tǒng)(浙江福立分析儀器股份有限公司)；SQP型電子天平(賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品)；Coreshell C18型色譜分析柱(3.5 μm，3.0 mm×150 mm，ChromaNik Technologies).

人參皂苷Rg1標準物質(zhì)(純度為94.0%，批號為110703-202034)，人參皂苷Re標準物質(zhì)(純度為96.0%，批號為110754-202129)，人參皂苷Rd標準物質(zhì)(純度為97.3%，批號為111818-202104)，均購自于中國食品藥品檢定研究所；參芪降糖膠囊(每粒裝0.35 g，批號為1907051，河南羚銳制藥股份有限公司)；純乙腈，色譜純；水，Millipore超純水.

1.2 試驗方法

1.2.1 混合標準溶液制備

精密稱取人參皂苷Rg1標準物質(zhì)、人參皂苷Re標準物質(zhì)以及人參皂苷Rd標準物質(zhì)適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg10.2 mg、人參皂苷Re 0.4 mg、人參皂苷Rd 0.2 mg的混合溶液，即得.

1.2.2 供試品溶液制備

取研細后的參芪降糖膠囊囊芯物約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇50 mL，密塞，稱定重量，搖勻，超聲處理1 h，取出，放冷，再稱定重量，使用水飽和正丁醇補足減少的重量，搖勻，離心，精密吸取上清液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取過濾溶液，即得.

1.2.3 高效液相色譜條件

Coreshell C18色譜柱(3.5 μm，3.0 mm×150 mm)；流動相A為純乙腈，流動相B為純水，進行梯度淋洗(0～20 min，83% B，20～22.5 min，83%～76% B，22.5～35 min，76%～60% B)；流量0.43 mL/min；柱箱溫度25 ℃；檢測波長203 nm；進樣量1.0 μL.

CA125血清檢測可用來指導治療，如果囊腫是良性（非癌癥）的且超聲波與血清CA125檢驗結(jié)果都正常，就可采用腹腔鏡作進一步檢驗。在癌癥治療中血清CA125值升高意味著腫瘤已發(fā)生3～4個月，可作為腫瘤復發(fā)指標，一旦升高可指導改變化療方案[5]。我國多使用B超協(xié)助診斷，可在肌層中見到種植內(nèi)膜所引起的不規(guī)則回聲增強。CA125測定對子宮腺肌癥有診斷價值，但其特異性有待提高。故目前仍需通過詢問病史，結(jié)合臨床癥狀、體征，輔助B超檢查進行診斷[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性試驗

精密移取混合標準溶液、供試品溶液適量，在“1.2.3”項下色譜條件進樣1.0 μL，結(jié)果如圖1所示.在供試品溶液色譜圖中，3種人參皂苷Rg1的保留時間分別為26.55、26.76、35.53 min.人參皂苷Re和人參皂苷Rd的分離度分別為1.9、1.7，所以兩者的分離度符合基線分離要求.3種人參皂苷的拖尾因子均在0.95～1.15之間，峰形對稱.經(jīng)光譜掃描得到3種人參皂苷的峰純度均較高.因此方法專屬性良好.

圖1 混合標準溶液、供試品溶液色譜圖

2.1.2 精密度

按“1.2.2”項下分別制備供試品溶液4組，按“1.2.3”項下色譜條件各進樣測定6次，測得人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的峰面積的相對標準偏差分別為2.21%、3.05%、2.93%.表明儀器精密度良好.

2.1.3 重復性

按“1.2.2”項下平行制備供試品溶液6份，依次按“1.2.3”項下色譜條件進樣，測得人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的峰面積的相對標準偏差分別為0.64%、0.78%、0.91%.表明方法重復性良好.

2.1.4 線性關系

取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd標準物質(zhì)適量，以甲醇分別配制成質(zhì)量濃度為5、20、50、100、200、400 μg/mL的溶液.取人參皂苷Re標準物質(zhì)適量，以甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為20、50、100、200、400、800 μg/mL的溶液.以混合標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，不同濃度下的峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸計算，得到3種人參皂苷的線性關系，如表1所列.表1結(jié)果表明3種人參皂苷在一定的濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.999 6.

表1 3種人參皂苷的線性關系

2.1.5 穩(wěn)定性考察

取同一份供試品溶液，分別在配制0、2、6、12、24、48 h后按“1.2.3”項下色譜條件進樣，測得人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的峰面積的相對標準偏差分別為1.34%、1.51%、1.79%.表明方法穩(wěn)定性良好.

2.1.6 加標回收率考察

取同一批次參芪降糖膠囊若干份，每份加入低、中、高3個濃度的對照品溶液，按“1.2.2”項制備供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件進樣測定，結(jié)果如表2所列.由表2可見，在不同的加標水平下，3種人參皂苷的回收率為95.89%～100.67%，相對標準偏差為1.04%～3.39%.表明方法具有較高的準確度.

表2 3種人參皂苷的加標回收率試驗數(shù)據(jù)

2.1.7 樣品含量測定

取平行配制的6份參芪降糖膠囊供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件進樣測定，根據(jù)峰面積外標法計算3種人參皂苷的含量.結(jié)果顯示人參皂苷Rg1平均含量為1.14 mg/粒，相對標準偏差為0.93%.人參皂苷Re平均含量為3.45 mg/粒，相對標準偏差為0.94%.人參皂苷Rd平均含量為1.69 mg/粒，相對標準偏差為0.88%.

2.2 討論

本試驗中，檢測波長、流動相組成以及梯度洗脫程序均沿用中國藥典[7]中參芪降糖膠囊的條件，其余的色譜條件由試驗確定得到.

2.2.1 進樣體積的確定

隨著色譜柱尺寸的減少，進樣體積也需隨之降低，以避免柱外效應的增加和色譜柱過載，對色譜分離效果產(chǎn)生影響[21].因此基于所采用3.0 mm為色譜柱的尺寸規(guī)格，考察了0.5、1.0、5.0、10.0 μL等不同進樣體積的色譜效果.試驗發(fā)現(xiàn)隨著進樣體積的增加，3種人參皂苷的理論塔板數(shù)、拖尾因子均出現(xiàn)先保持不變，再小幅度的降低的現(xiàn)象,而儀器精密度相對標準偏差卻有所提高.因此綜合系統(tǒng)適應性參數(shù)、儀器精密度、樣品的節(jié)省量考慮，確定色譜方法中進樣體積為1.0 μL.

2.2.2 流量的確定

圖2 供試品溶液在不同流速下的色譜圖

3 結(jié)論

雖已有超高效液相色譜法測定參芪降糖制劑的應用報道，但大多基于sub-2 μm色譜填料與質(zhì)譜檢測器聯(lián)用為主.一方面儀器設備昂貴，常規(guī)中醫(yī)藥企業(yè)無法承擔.另一方面sub-2 μm色譜填料所導致的非常高的系統(tǒng)壓力會引起很多副作用，比如高壓會相對容易造成系統(tǒng)和色譜柱性能的下降.高壓時，流動相與色譜填料之間產(chǎn)生的摩擦熱會造成色譜柱內(nèi)部溫控失衡、色譜峰形的變化、檢測器噪聲的增加、關鍵目標峰分離度的變化等，對參芪降糖膠囊的分離分析數(shù)據(jù)可能會造成顯而易見的影響.

因此本研究采用3.5 μm Coreshell C18色譜填料，在常規(guī)高效液相色譜系統(tǒng)上，建立了高效液相色譜方法進行參芪降糖膠囊中人參皂苷含量的快速分析，既發(fā)揮了超高效液相色譜高效、高通量的特點，又避免出現(xiàn)超高效液相色譜價格昂貴、系統(tǒng)易堵、體驗感差、方法轉(zhuǎn)移難等問題.同時該方法的準確性、精密度高，操作也簡單，極易被廣大中醫(yī)藥企業(yè)所認可和接受，可為今后進一步提高參芪降糖膠囊的分析標準提供參考依據(jù).