楊 潔 姚晨之, 嚴 方, 王 杰 孟麗君

1.中國日用化學工業(yè)研究院，山西太原，030001；2.中輕日用化學檢驗認證有限公司，山西太原，030001

香皂是日常生活中不可缺少的衛(wèi)生清潔用品。隨著科學技術(shù)的進步、人民生活水平的提高以及公共衛(wèi)生理念的不斷完善，消費者希望香皂除了基本的去污功效，還能具有除菌功效。生產(chǎn)商為了適應市場的需求，紛紛推出各種具有除菌功效的產(chǎn)品[1-3]。

目前，“除菌”對于衛(wèi)生清潔用品僅是個概念宣傳，事實上，日化行業(yè)對于衛(wèi)生清潔用品尚沒有統(tǒng)一明確的關(guān)于“除菌”的定義和評價標準?，F(xiàn)有涉及產(chǎn)品微生物功效作用方面，有明確定義的是“抗/殺菌”“抑菌”，如行業(yè)標準QB/T 2738—2012《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法》[4]?？咕蛞志侵覆捎没瘜W或物理的方法殺滅/抑制或妨礙細菌生長繁殖及其活性的過程，“除菌”概念最先由業(yè)內(nèi)部分生產(chǎn)企業(yè)提出，根據(jù)字面含義，可以認為是指采用物理化學的方法洗去載體表面上附著的細菌并妨礙其生長繁殖的過程。產(chǎn)品洗去細菌的效果可以通過模擬實際洗滌過程檢驗。國外已有與手部衛(wèi)生用品除菌效果相關(guān)的標準方法，如美國材料測試協(xié)會的標準ASTM E117413[5]和ASTM E289712[6]，前者規(guī)定了通過人體試驗法評價除菌洗手液在洗手過程中除菌效果的測試方法，后者為通過體外模擬法評價手部衛(wèi)生用品除菌效果的測試方法。ASTM E117413中人體試驗法的實際操作難度較大，且會對受試者帶來一定的風險；ASTM E289712中尚未對體外模擬法的具體試驗條件進行規(guī)定。此兩項國外標準中推薦的試驗菌種為黏質(zhì)沙雷菌和大腸埃希菌，缺少國內(nèi)日化行業(yè)抗抑菌常用的推薦測試菌種金黃色葡萄球菌。本文以市面上常見的香皂產(chǎn)品為例，對香皂產(chǎn)品的除菌測試方法進行了探索，研究了試驗菌種、洗脫條件對除菌效果的影響，最終建立了一種香皂產(chǎn)品除菌效果的測試評價方法，并使用該方法評價不同香皂產(chǎn)品的除菌效果。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

菌種（金黃色葡萄球菌ATCC 6538、大腸埃希菌ATCC 8099），山西省疾病預防控制中心；無菌新鮮豬皮，自制；氯化鈣（CaCl2）、六水合氯化鎂（MgCl2·6H2O），無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4），磷酸二氫鉀（KH2PO4），均為分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；吐溫80，化學純，天津科密歐化學試劑有限公司；營養(yǎng)瓊脂（NA）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA），北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

高壓蒸汽滅菌鍋YXQ-50S11，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；WGZ-2XJ細菌濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；渦旋振蕩器G560E，上海滬西分析儀器廠有限公司；生化培養(yǎng)箱LRH-250A，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的準備

取第3～6代試驗菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物，參照QB/T 2738—2012《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法》制備菌懸液，用0.03mol/L PBS溶液將試驗菌懸液稀釋，通過濁度儀調(diào)節(jié)菌懸液濃度至(1.0～5.0)×108cfu/ml備用。

1.2.2 測試載體的處理

以無菌新鮮豬皮作為測試載體，新鮮豬皮預先經(jīng)物理方法進行無菌處理（可采用鈷-60輻射滅菌）。用無菌剪刀將豬皮裁剪至5 cm×5 cm，平鋪于培養(yǎng)皿內(nèi)，每兩塊豬皮為一組，擦干豬皮表面多余水分，在每塊豬皮上接種0.10 ml菌懸液，使用一次性接種環(huán)將菌液涂抹均勻，避免接觸豬皮邊緣部位，于室溫下靜置20 min備用。將人工污染后的豬皮放入含60 ml PBS采樣溶液的密封袋內(nèi)中均勻搓揉皮膚1 min進行基線回收。

1.2.3 操作步驟

稱取0.25 g的待測試樣，置于一塊豬皮的中央，再滴加1.00 ml無菌硬水，另取一塊豬皮覆蓋在試樣上，固定底層的豬皮，手持攝子以中等力度揉搓上層豬皮15 s至試樣完全溶解；待試樣完全溶解并起泡后再以中等力度將兩塊皮沿上下左右的方向?qū)Υ?0 s；用鑷子夾住豬皮一端，左右移動豬皮，依靠水的自然下流沖洗15s，保持豬皮與水流的夾角約為120°，用無菌紙巾輕拍吸干豬皮上多余水分；清洗后的1 min內(nèi)，將兩塊豬皮分別置于無菌密封袋內(nèi)，加入60 ml的PBS采樣溶液，均勻搓揉皮膚1 min。無菌操作回收密封袋內(nèi)0.5 ml的洗脫液進行梯度稀釋。以無菌硬水代替試樣，重復上述操作作為空白對照組。采用標準細菌學檢測技術(shù)，澆注TSA平板的方式對洗脫液中的活菌進行計數(shù)。

1.2.4 活菌計數(shù)

將試驗組和空白對照組的平板倒置于（36±1）℃的生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)（48±4）h，計數(shù)菌落數(shù)。計算不同試樣的相對除菌率。

式中：Ⅰ.空白對照組回收菌落數(shù)；Ⅱ.試驗組回收菌落數(shù)。

1.3 可靠性評價

使用此方法對5種市售香皂的除菌效果進行評價，其中試樣A、B、D為具有除菌宣傳的香皂產(chǎn)品，試樣C、E為普通型香皂產(chǎn)品，產(chǎn)品的配方信息見表1。對每個樣品進行3次獨立重復試驗，每次試驗中每個樣品做3組平行。對比3次試驗結(jié)果，通過每組數(shù)據(jù)的均值、標準偏差等指標評價該方法的重復性和區(qū)分度。

表1 不同香皂產(chǎn)品的配方信息

1.4 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)均用Microsoft Office Excel進行數(shù)據(jù)錄入，使用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，對多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One Way ANOVA）檢驗方法進行比較，對多組數(shù)據(jù)間的兩兩比較通過等方差假設(shè)選項下的LSD方法進行比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗菌種的選擇

國內(nèi)日化行業(yè)抗抑菌相關(guān)行業(yè)標準中常見的推薦菌種有金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）和大腸埃希菌（ATCC 8099）分別作為革蘭氏陽性代表菌和革蘭氏陰性代表菌。分別以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌作為試驗菌，測試了僅使用硬水清洗豬皮的除菌率；表2數(shù)據(jù)說明，對豬皮上金黃色葡萄球菌的水洗除菌率約為50%，表3數(shù)據(jù)說明，對豬皮上大腸埃希菌的水洗除菌率約為65%；僅通過清水沖洗只能除去載體表面的部分細菌，日常生活中仍需要使用具有除菌功效的洗滌產(chǎn)品，因此，本方法中香皂產(chǎn)品的除菌方法中以金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）作為革蘭氏陽性菌的代表試驗菌，以大腸埃希菌（ATCC 8099）作為革蘭氏陰性菌的代表試驗菌。

表2 以金黃色葡萄球菌作為試驗菌時無菌硬水的除菌效果

表3 以大腸埃希菌作為試驗菌時無菌硬水的除菌效果

2.2 試驗載體的選擇

體外模擬法的關(guān)鍵是需要找到一種可以替代人體皮膚的離體皮膚模型。在不同的動物皮膚中，豬的皮膚厚度與人體皮膚厚度相似，豬皮膚角質(zhì)層含有與人體皮膚角質(zhì)層相似的蛋白質(zhì)成分，以及真皮層血管的數(shù)量、大小、分布都與人體皮膚相似，豬的體表面積大，可同時采集多個樣本[7-8]，國外標準ASTM E289712中也推薦以離體豬皮作為載體進行試驗。因此本方法中以無菌豬皮作為染菌載體，每兩塊豬皮為一組。試驗前需要將豬皮裁剪至5 cm×5 cm，以便于將兩塊豬皮進行對搓。

2.3 菌懸液及待測試樣的添加量

每塊豬皮上試驗菌懸液及待測試樣的添加量參考標準ASTM E289712的附錄進行計算，具體是根據(jù)在豬皮上的使用體積與臨床研究中在手上的使用體積成比例進行估算。試驗中所用的豬皮大小為5 cm×5 cm，已知男性的平均手表面積為1070cm2，女性的平均手表面積為890 cm2，男性和女性的近似平均值為980 cm2，ASTM E117413中推薦每位受試者手上使用4.50 ml的試驗菌懸液，等價于每對豬皮上添加0.230 ml的試驗菌懸液，結(jié)合實際情況，在每塊5 cm×5 cm豬皮上添加0.10 ml的試驗菌懸液時，剛好可以涂抹均勻而不會過量；ASTM E117413中推薦每位受試者手上使用5.00 ml的待測試樣，等價于每對豬皮上添加0.255 ml的待測試樣，結(jié)合實際情況，本方法中每對豬皮使用0.25 ml的待測試樣。計算公式如下：Vh＝手上待測試樣（或微生物懸浮液）的體積；Ap＝豬皮的表面積；Ah＝手的表面積。

2.4 洗脫方式

2.4.1 洗脫液成分

各標準中采用的洗脫液成分有所不同，《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版） 2.1.8.8中以0.03 mol/L PBS作為洗脫液回收織物上的殘留活菌；ASTM E117413中以含0.1%AEO9的0.03 mol/L PBS溶液作為通過人體試驗法評價除菌洗手液除菌效果方法的洗脫液。本方法中對洗脫液的種類進行了研究，由表4數(shù)據(jù)可知，使用不同的洗脫液對染菌載體的洗脫效果有所不同，0.5%吐溫80（PBS配制）的洗脫效果較差，洗脫率約為80%；0.03 mol/L PBS和0.3%卵磷脂+1%吐溫80（PBS配制）的洗脫效果較好，洗脫率均在90%以上；0.3%卵磷脂+1%吐溫80（PBS配制）的配制較PBS復雜，而這兩種洗脫液對無菌豬皮的洗脫效果差別不大。因此本方法中以PBS作為洗脫液。

表4 洗脫液成分對豬皮洗脫效果的影響

2.4.2 洗脫液體積

為了研究洗脫液體積對洗脫效果的影響，分別使用40 ml、60 ml、80 ml、100 ml的洗脫液將細菌從人工污染的豬皮上洗脫。從表5中數(shù)據(jù)可以看出，當洗脫液體積為60ml時，洗脫下來的細菌含量最多，對于無菌豬皮上的細菌洗脫效果最好。當洗脫液體積較少時，無法完全浸沒豬皮，洗脫不充分；當洗脫液體積較多時，可以完全浸沒豬皮，但細菌在洗脫液中可能分布不夠均勻，細菌回收率也較低，因此，本方法中以60ml作為回收人工污染后豬皮上細菌的洗脫液用量。

表5 洗脫液體積對豬皮洗脫效果的影響

2.4.3 洗脫時間

為了研究洗脫時間對洗脫效果的影響，分別測試了在30s、60s、90s、120s四個洗脫時間下對人工污染的豬皮上細菌的洗脫效果（表6）。圖1可知，隨著洗脫時間的增加，細菌回收率也越高，當洗脫時間為60s時，洗脫下來的細菌數(shù)達到拐點，再隨著洗脫時間增加，回收菌數(shù)的增幅較小。因此本方法中將60s作為回收染菌豬皮上活菌數(shù)的洗脫時間。

圖1 洗脫時間對豬皮洗脫效果的影響

表6 洗脫時間對豬皮洗脫效果的影響

2.5 不同試樣的除菌效果

為了進一步驗證使用該方法評價不同香皂產(chǎn)品除菌效果的重復性及區(qū)分度，隨機選取5種市售香皂產(chǎn)品，分別以金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）和大腸埃希菌（ATCC 8099）作為試驗菌，測試不同產(chǎn)品的相對除菌率，并對結(jié)果通過單因素方差分析檢驗方法進行比較。

以金黃色葡萄球菌作為試驗菌時，表7為3種除菌香皂和2種普通香皂的三次重復試驗的相對除菌率結(jié)果。數(shù)據(jù)表明，除菌香皂與普通香皂之間的相對除菌率差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且不同產(chǎn)品試驗結(jié)果的重復性與除菌率的高低有關(guān)，除菌率越高，重復試驗的方差值越小，試驗結(jié)果的重復性越好。

表7 不同香皂產(chǎn)品對金黃色葡萄球菌的相對除菌率

在此基礎(chǔ)上，進一步對3種除菌香皂和2種普通香皂兩兩之間的相對除菌率分布差異通過等方差假定選項下的LSD方法進行比較（表8），結(jié)果顯示，在3種除菌香皂中，試樣D-試樣A、試樣A-試樣B的兩兩之間相對除菌率平均值差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），試樣D-試樣B的兩兩之間相對除菌率平均值差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），可見，不同產(chǎn)品配方中添加的除菌有效成分不同，會進一步影響產(chǎn)品的除菌效果；除菌香皂B-普通香皂C的兩兩之間相對除菌率平均值差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），可見，產(chǎn)品配方中是否添加有效除菌成分，會影響產(chǎn)品的除菌效果；普通香皂C-普通香皂E的兩兩之間相對除菌率平均值差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），可見，當產(chǎn)品配方中不含有效除菌成分時，其余成分對產(chǎn)品的除菌效果也具有一定的影響，但普通香皂的除菌效果均明顯低于除菌型香皂，是否添加有效除菌成分仍是香皂產(chǎn)品除菌效果高低的主要影響因素。

表8 不同香皂產(chǎn)品對金黃色葡萄球菌的相對除菌率的兩兩比較

以大腸埃希菌作為試驗菌時，表9為3種除菌香皂和2種普通香皂的三次重復試驗的相對除菌率結(jié)果。數(shù)據(jù)表明，除菌香皂與普通香皂之間的相對除菌率差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且不同產(chǎn)品試驗結(jié)果的重復性與除菌率的高低有關(guān)，除菌率越高，重復試驗的方差值越小，試驗結(jié)果的重復性越好。此外，與金黃色葡萄球菌作為試樣菌相比，同一試樣對大腸埃希菌的除菌效果均優(yōu)于對金黃色葡萄球菌的除菌效果。

表9 不同香皂產(chǎn)品對大腸埃希菌的除菌量

在此基礎(chǔ)上，進一步對3種除菌香皂和2種普通香皂兩兩之間的相對除菌率分布差異通過等方差假定選項下的LSD檢驗方法進行比較（表10），結(jié)果顯示，在3種除菌香皂中，試樣D-試樣A的兩兩之間相對除菌率平均值差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），試樣D-試樣B、試樣A-試樣B的兩兩之間相對除菌率平均值差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），可見，不同產(chǎn)品配方中添加的有效除菌成分不同，會進一步影響產(chǎn)品的除菌效果；除菌香皂B-普通香皂C的兩兩之間相對除菌率平均值差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），可見，產(chǎn)品配方中是否添加有效除菌成分，會影響產(chǎn)品的除菌效果；普通香皂C-普通香皂E的兩兩之間相對除菌率平均值差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），可見，當產(chǎn)品配方中不含有效除菌成分時，其余成分對產(chǎn)品的除菌效果也具有一定的影響，但普通香皂的除菌效果均明顯低于除菌型香皂，是否添加有效除菌成分仍是香皂產(chǎn)品除菌效果高低的主要影響因素。

表10 不同香皂產(chǎn)品對大腸埃希菌的相對除菌率的兩兩比較

3 結(jié)論

市面上的香皂產(chǎn)品多種多樣，有不少產(chǎn)品都宣傳其具有除菌效果，但是現(xiàn)有的國家和行業(yè)標準中尚未建立除菌性能的測試評價方法[4-5]。本研究中，通過對試驗條件進行探索，確定了以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌作為試驗菌，5 cm×5 cm的無菌豬皮作為載體，每兩塊為一組，試驗中，每塊豬皮上添加0.10 ml的試驗菌懸液，待測試樣的使用量為0.25 g，清洗過程結(jié)束后，將每塊豬皮置于含60 ml PBS溶液的無菌密封袋內(nèi)均勻揉搓60 s以回收豬皮表明的殘留活菌，建立了一種香皂產(chǎn)品除菌效果的試驗方法，用于評價香皂產(chǎn)品的除菌效果。

在此試驗條件下，選取5種市售的香皂產(chǎn)品進行了三次重復試驗，結(jié)果表明該除菌方法具有較好的重復性及區(qū)分度，同一試樣對大腸埃希菌的除菌效果優(yōu)于金黃色葡萄球菌，不同試樣相對除菌率的重復性與除菌效果有關(guān)，除菌效果越好的試樣，除菌率的重復性越高。此外，試驗結(jié)果表明，除菌香皂試樣A、B、D通過該方法測得相對除菌率均高于普通香皂試樣C、E，香皂產(chǎn)品配方中是否添加有效除菌成分是產(chǎn)品除菌效果高低的主要影響因素，而配方中不同的除菌成分以及其余成分也會進一步影響產(chǎn)品的除菌效果。因此，此除菌方法可用于評價不同香皂產(chǎn)品的除菌效果，同時也可作為日化產(chǎn)品除菌行業(yè)標準的制定基礎(chǔ)。