張澤鑫， 林瑞婷， 劉雪婷， 李菁， 林麗珠

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410000；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

放射性腸炎（radiation enteritis，RE）是盆腹腔及腹膜后惡性腫瘤患者，接受放射線治療后，最常出現(xiàn)的并發(fā)癥之一。其臨床表現(xiàn)為腹痛腹瀉、惡心嘔吐、黏液膿血樣便等，嚴(yán)重者可見腸腔狹窄、局部膿腫、穿孔、出血、瘺管形成等[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球約有30萬名盆腔惡性腫瘤患者接受放療[2]，高達(dá)90%的患者接受腹盆腔放射治療后，會出現(xiàn)胃腸道癥狀，排便習(xí)慣發(fā)生改變，生活質(zhì)量顯著下降[3]。其中，3%～10%左右的患者出現(xiàn)嚴(yán)重放射性腸損傷[4]，1/3的病人需進(jìn)行外科手術(shù)治療，死亡率高達(dá)10%～22%[5]。目前放射性腸炎治療較為棘手，中醫(yī)藥基于辨證論治原則，通過長期的臨床實(shí)踐，探索出一大批有效方劑，日益成為研究的重點(diǎn)[6]。

放射性腸炎按其癥狀，可歸屬于中醫(yī)“泄瀉”“痢疾”“腸澼”等范疇。癌瘤之毒，內(nèi)伏機(jī)體，正氣不足，外受放射線輻射肌腠，而致濕熱內(nèi)蘊(yùn)，日久生瘀。放射線屬“火”“熱”“毒”邪。本病治當(dāng)以清熱解毒、利濕化瘀為主[7]。祛瘀解毒方（Qu Yu Jie Du Formula，QYJDF）為林麗珠教授治療放射性腸炎的有效驗方，已獲得國家發(fā)明專利（專利號ZL 2014 1 0216376.6），并取得廣州市科技計劃立項支持。祛瘀解毒方的功效為清熱利濕，祛瘀解毒，主要用于濕熱毒瘀型放射性腸炎及腸癌的治療。該方由8味中藥組成，分別為土鱉蟲、桃仁、苦參、地榆、槐花、薏苡仁、土茯苓、蒲公英。其中土鱉蟲與桃仁是林麗珠教授治療放射性腸炎的常用藥對，取《金匱要略》下瘀血湯之義，土鱉蟲破血入絡(luò)，桃仁強(qiáng)化其活血之效。地榆、槐花兩藥相合，共奏清肝瀉火、涼血止血之功。土茯苓、薏苡仁、苦參，清熱祛濕解毒。蒲公英擅清熱解毒，消腫散結(jié)，止瀉痢、除腸垢，兼攻癌毒。諸藥合用，可治療癌毒及放射線邪引起的腹痛泄瀉、便血、黏液膿血便等癥狀?，F(xiàn)代研究表明，運(yùn)用活血化瘀藥，可提高機(jī)體對放射治療的敏感性，提高免疫力和減少機(jī)體的纖維化，從而降低放療的毒副反應(yīng)。其中土鱉蟲、桃仁含有效成分苦杏仁苷、尿嘧啶，具有抗炎及保護(hù)腸道黏膜功能[8]。地榆、槐花中含有多種天然活性物質(zhì)，被開發(fā)用于抗腫瘤、止血、保護(hù)胃腸及增強(qiáng)免疫等[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)揭示了本方潛在有效成分，然而中藥復(fù)方含有多個有效成分，其篩選十分復(fù)雜。且該方治療放射性腸炎的療效機(jī)制尚未闡明，涉及多靶點(diǎn)、多通路，仍需進(jìn)一步的研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可詮釋藥物“成分—靶點(diǎn)—通路”的整體調(diào)節(jié)機(jī)制，能對藥物與疾病的相關(guān)性進(jìn)行預(yù)測，對研究中藥的多角度作用機(jī)制意義重大。基于上述問題，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，充分挖掘本方潛在的分子靶點(diǎn)和機(jī)制，探究其靶向的器官，以及完善相關(guān)中醫(yī)的診斷證候。

1 材料與方法

1.1 QYJDF中藥活性成分和靶點(diǎn)篩選

QYJDF組成：地榆，槐花，苦參，蒲公英，桃仁，土鱉蟲，土茯苓，薏苡仁；限定篩選條件：口服生物有效度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18；通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選QYJDF中藥有效活性成分和靶點(diǎn)。其中土鱉蟲，蒲公英在TCMSP數(shù)據(jù)庫沒有收錄，使用BATMAN數(shù)據(jù)庫，搜集一批土鱉蟲和蒲公英的中藥成分，在PUBCHEM數(shù)據(jù)庫獲取其化合物的3D結(jié)構(gòu)，使用PharmMapper數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測。

1.2 QYJDF靶點(diǎn)篩選

在Genecards和OMIM數(shù)據(jù)庫，以“Radiation enteritis”為關(guān)鍵詞，篩選獲取QYJDF的疾病靶點(diǎn)。

1.3 QYJDF治療RE靶點(diǎn)篩選

使用R語言的"VennDiagram"包和“Upset”包，分別導(dǎo)入QYJDF和RE的疾病靶點(diǎn)，通過兩者相互映射，獲取QYJDF治療RE靶點(diǎn)。

1.4 QYJDF治療RE分子靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將QYJDF治療RE的有效活性成分和靶點(diǎn)導(dǎo)入cytoscape3.7.2，構(gòu)建QYJDF治療RE分子靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，尋找重要的候選成分。

1.5 QYJDF治療RE蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將QYJDF治療RE的靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為Homo sapiens，相互作用參數(shù)設(shè)置為0.400，導(dǎo)出為.tsv文件，利用cytoscape3.7.2軟件，通過計算degree值大小，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.6 QYJDF治療RE靶點(diǎn)的GO和KEGG富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫，將QYJDF治療RE的靶點(diǎn)注釋，進(jìn)行GO和KEGG富集分析，設(shè)置P＜0.05，根據(jù)靶點(diǎn)富集數(shù)目多少進(jìn)行排序，使用R語言進(jìn)行可視化。

1.7 QYJDF治療RE的中藥-成分-靶點(diǎn)-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀-中醫(yī)證候網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在SymMap數(shù)據(jù)庫檢索QYJDF治療RE的中藥成分，獲取其相對應(yīng)的靶點(diǎn)，疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀和中醫(yī)證候，保留在以上5種選項中有連線的部分，構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀-中醫(yī)證候網(wǎng)絡(luò)，達(dá)到以證測方，以方測證，相互驗證的效果。

1.8 QYJDF治療RE的器官定位

利用BioGPS數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的前20個核心靶點(diǎn)（步驟1.5），分析其在各個器官中的表達(dá)量，單個靶點(diǎn)存在于多個探針中，通過計算均值的方式進(jìn)行降序處理，從而篩選出排名在前5的器官，并且這些器官在中醫(yī)系統(tǒng)中都存在相對應(yīng)的內(nèi)容。

1.9 QYJDF治療RE的分子對接驗證

使用AutoDock4.2對分子靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（1.4）結(jié)果的重要化合物以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（1.5）排名靠前的3個核心基因進(jìn)行對接，使用分子可視化工具Pymol對其對接結(jié)果進(jìn)行處理，并以圖片形式展現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 QYJDF中藥活性成分和靶點(diǎn)篩選

共篩選得到QYJDF治療RE的71個有效中藥成分（見表1，其中地榆9個，槐花5個，苦參23個，蒲公英3個，桃仁12個，土鱉蟲2個，土茯苓12個，薏苡仁5個），以及QYJDF靶點(diǎn)4 506個，RE靶點(diǎn)176個，QYJDF治療RE靶點(diǎn)129個（見圖 1）。

表1 祛瘀解毒方中藥活性成分Table 1 Traditional Chinese medicine active ingredients of QYJDF

（續(xù)表1）

圖1 QYJDF治療RE疾病的靶點(diǎn)Figure 1 QYJDF targets for treatment of RE disease

2.2 QYJDF治療RE分子靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在Cytoscape3.7.2中導(dǎo)入QYJDF治療RE的有效中藥成分和靶點(diǎn)，構(gòu)建分子靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）。此網(wǎng)絡(luò)包括了個209節(jié)點(diǎn)，672條邊。其中紅色表示“放射性腸炎”，綠色表示組成QYJDF的中藥，天藍(lán)色表示QYJDF治療RE的有效中藥成分，黃色表示QYJDF治療RE的靶點(diǎn)。由圖可以看出，MOL000006（木犀草素）、MOL000098（槲皮素）對應(yīng)RE的大部分靶點(diǎn)，可認(rèn)為是QYJDF治療RE的主要中藥成分。

2.3 QYJDF治療RE蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)degree值大小進(jìn)行靶點(diǎn)排序，得到了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（見圖3），其中圓形的大小代表互作關(guān)系的多少，代表該靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)的互作關(guān)系越多，在網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位。其中IL6、VEGFA、MAPK8 degree值位居前三，故可認(rèn)為是QYJDF治療RE的核心靶點(diǎn)。

圖3 QYJDF治療RE的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of QYJDF treatment of RE

2.4 QYJDF治療RE靶點(diǎn)GO富集分析

根據(jù)顯著性和靶點(diǎn)富集數(shù)目，篩選出了主要的15條GO過程（見圖4），其中nucleus是靶點(diǎn)富集數(shù)目最多，顯著性最明顯的GO細(xì)胞成分，提示QYJDF治療RE發(fā)揮作用的部位可能位于細(xì)胞核中。RNA聚合酶Ⅱ（positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡpromoter）是靶點(diǎn)富集數(shù)目最多，顯著性最明顯的GO生物過程，提示QYJDF治療RE發(fā)揮作用可能通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控。Transcription factor activity，sequencespecific DNA binding是靶點(diǎn)富集數(shù)目最多、顯著性最明顯的GO分子功能，提示QYJDF治療RE發(fā)揮作用可能通過轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA結(jié)合。

圖4 QYJDF治療RE的GO富集分析（BP；CC；MF）Figure 4 QYJDF treatment of GO enrichment analysis（BP；CC；MF）

2.5 QYJDF治療RE靶點(diǎn)的KEGG富集分析

根據(jù)顯著性和靶點(diǎn)富集數(shù)目，篩選出了主要的10條KEGG通路（見圖5），QYJDF藥物成分相關(guān)靶點(diǎn)富集結(jié)果最多的為PI3K-Akt信號通路，提示QYJDF可能是參與通過該通路的調(diào)節(jié)從而起到治療RE的作用。

圖5 QYJDF治療RE的KEGG富集分析Figure 5 KEGG enrichment analysis of QYJDF treatment of RE

2.6 QYJDF治療RE的中藥-成分-靶點(diǎn)-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀-中醫(yī)證候網(wǎng)絡(luò)

QYJDF治療RE的中藥-成分-靶點(diǎn)-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀-中醫(yī)證候網(wǎng)絡(luò)提示了，患者以腹痛、腹瀉、便血、便秘、便痛、里急后重等為主要癥狀，可能出現(xiàn)瘡毒、濕疹、癢等皮膚癥狀，眩暈、頭痛等頭面部癥狀，見圖6（天藍(lán)色代表QYJDF，紫色代表藥物組成，黃色代表中藥成分，綠色代表靶點(diǎn)，粉色代表現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀，紅色代表中醫(yī)證候特征）。

圖6 QYJDF治療RE的中藥-成分-靶點(diǎn)-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀-中醫(yī)證候網(wǎng)絡(luò)Figure 6 QYJDF treatment of RE in traditional Chinese medicine-ingredients-targets-modern medical symptoms-TCM syndrome network

2.7 QYJDF治療RE靶點(diǎn)的器官定位

如圖7所示，紅色代表心臟靶點(diǎn)，綠色代表肝臟靶點(diǎn)，灰色代表大腸、小腸靶點(diǎn)，黑色代表腎臟靶點(diǎn)，粉紅色代表子宮靶點(diǎn)，白色代表前列腺靶點(diǎn)。上標(biāo)“1-4”代表靶點(diǎn)存在于器官的數(shù)目。由圖7可以看出，QYJDF治療RE的靶點(diǎn)大多數(shù)分布在“大腸”“小腸”“肝”“前列腺”“子宮”，這印證了QYJDF治療RE具有靶向性，其中病位主要在下焦。

圖7 QYJDF治療RE靶點(diǎn)的器官定位Figure 7 QYJDF treatment of RE target organ location

2.8 QYJDF治療RE主要候選化合物和核心靶點(diǎn)的分子對接

從PDB數(shù)據(jù)庫下載了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中（圖3）的前三位核心靶點(diǎn)IL6、MAOK8和CASP3的結(jié)構(gòu)，然后將分子靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的主要候選化合物（圖2）槲皮素和木犀草素與核心靶點(diǎn)IL6、MAPK8、CASP3使用Autodock和Pymol軟件進(jìn)行分子對接和可視化處理，對接結(jié)果評分顯示其具有良好的結(jié)合能力（見圖8，表2）。

圖8 QYJDF治療RE分子對接圖Figure 8 QYJDF treatment of RE molecular docking diagram

表2 祛瘀解毒方治療RE分子對接結(jié)果Table 2 QYJDF treatment of RE molecular docking results

3 討論

放射性腸炎根據(jù)其累及部位，可分為放射性直腸炎、結(jié)腸炎和小腸炎。根據(jù)起病時間和病程，可分為急、慢性放射性腸炎[10]。其放療毒性與放射劑量、放射面積相關(guān)，同時也與接受放療患者的遺傳、年齡等自身因素有關(guān)[11]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)可通過口服藥物與外科治療進(jìn)行干預(yù)，但存在較多的不良反應(yīng)與高手術(shù)復(fù)發(fā)率。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)從全局出發(fā)進(jìn)行辨證施治，內(nèi)外合兼，恢復(fù)臟腑功能。內(nèi)治以辨病辨證相結(jié)合，清熱解毒、滋陰養(yǎng)血、調(diào)和脾胃等多法進(jìn)行祛邪扶正，外治多采用針刺、艾灸和中藥灌腸等法改善臨床癥狀[12]，多能取得良好的效果，減輕患者毒副反應(yīng)。

放射性腸炎患者臨床常見腹痛腹瀉，黏液膿血樣便等癥狀，在中醫(yī)屬“腸澼”“痢疾”“泄瀉”等范疇?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中“飲食不節(jié)，起居不時者，陰受之……陰受之則入五臟……入五臟，則滿閉塞，下為飧泄，久為腸澼”，《傷寒論》記載“熱利下重者，白頭翁湯主之”“下利，便膿血者，桃花湯主之”[13]，治以清熱利濕解毒，活血化瘀為主。

林麗珠教授是國內(nèi)著名腫瘤專家，經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐和研究，開創(chuàng)了祛瘀解毒方用于濕熱瘀毒型放射性腸炎及腸癌的治療。祛瘀解毒方由八味中藥組成，功能清熱利濕解毒，活血化瘀。其中，藥物主要?dú)w肝，大腸，脾胃和心經(jīng)。心主血，肝主藏血，脾主統(tǒng)血，對便血癥狀，能起到良好的調(diào)理作用。胃主受納，脾主運(yùn)化，大腸主傳導(dǎo)，對腹痛腹瀉、便秘、里急后重等癥狀，能有針對性作用。

祛瘀解毒方治療RE的KEGG富集結(jié)果顯示，其主要通過作用于PI3K-AKT信號通路發(fā)揮作用。研究顯示，該通路廣泛存在細(xì)胞中，參與炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激等多種生命活動[14]，是典型的自噬通路，可抑制自噬的激活[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，NADH在正常腸細(xì)胞中可通過PI3K-AKT信號通路來抑制炎癥和增強(qiáng)自噬作用，為其對放射性腸炎具有保護(hù)作用提供了證據(jù)[16-17]。越來越多的研究證明了該信號通路可在腸道介導(dǎo)異常炎癥反應(yīng)，引起腸道黏膜損傷，在腸炎發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[18]。

祛瘀解毒方治療RE的“中藥-成分-靶點(diǎn)-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀-中醫(yī)證候”網(wǎng)絡(luò)提示了，患者以腹痛、腹瀉、便血、便秘、便痛、里急后重等為主要癥狀，這與臨床經(jīng)驗和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的認(rèn)識高度一致。并且，我們發(fā)現(xiàn)，患者可能出現(xiàn)瘡毒、濕疹、癢等皮膚癥狀，眩暈、頭痛等頭面部癥狀?；颊邼駸岫攫鰞?nèi)蘊(yùn)，在內(nèi)可見腹痛腹瀉等癥狀，在外可見瘡毒、濕疹、癢等癥狀。邪氣久居，氣機(jī)不暢，擾亂神明，可見眩暈、頭痛等癥狀?！坝兄T形于內(nèi)，必形于外”，我們的研究不僅與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相互佐證，也完善了一些對放射性腸炎的中醫(yī)診療思維。

本研究中，因為土鱉蟲，蒲公英在數(shù)據(jù)系統(tǒng)尚未收錄，仍需要進(jìn)一步完善。此外，祛瘀解毒方治療RE的相關(guān)靶點(diǎn)的BioGPS定位在了大腸、小腸，肝等下焦器官，部分定位于心、肺，這也印證了中醫(yī)藥的歸經(jīng)學(xué)說，中醫(yī)藥治病具有一定的靶向性。祛瘀解毒方不僅對于RE有治療效果，而且對于盆腹腔臟器或存在保護(hù)機(jī)制和療效，需要下一步繼續(xù)深入研究。

分子對接結(jié)果顯示了，祛瘀解毒方治療RE的主要候選化合物槲皮素和木犀草素與核心靶點(diǎn)IL6、MAPK8、CASP3具有良好的結(jié)合能力，這進(jìn)一步驗證了我們的結(jié)果。后期需要在動物和細(xì)胞層面，進(jìn)行組學(xué)、生物芯片、作用機(jī)制等方面進(jìn)行深入研究。

綜上，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，探究了祛瘀解毒方治療RE的分子機(jī)制和靶點(diǎn)，祛瘀解毒方治療RE主要通過抑制PI3K-Ark信號通路發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)自噬等作用，并保護(hù)胃腸道黏膜，促進(jìn)黏膜修復(fù)。其靶向病位在“大腸”“小腸”“肝”“前列腺”“子宮”等下焦臟腑，臨床以腹痛、腹瀉、便血、便秘、便痛、里急后重為主要癥狀及可能出現(xiàn)瘡毒、濕疹、癢等皮膚癥狀及眩暈、頭痛等頭面部癥狀。