王玨，江穎，肖新月，楊銳，孫會敏

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.上海市醫(yī)療器械化妝品審評核查中心，上海 200020)

藥用輔料蔗糖常用于生物制品的冷凍干燥配方中，是最常用且用量很大的保護劑。近年來，生物制品引發(fā)的免疫反應(yīng)受到社會關(guān)注[1-3]，但現(xiàn)有的研究很少區(qū)分這種不良的免疫反應(yīng)是制劑或是輔料本身引起。據(jù)報道，輔料中可能引入的顆粒雜質(zhì)是產(chǎn)生免疫應(yīng)答不良反應(yīng)的風(fēng)險因素之一[4-5]。

補體系統(tǒng)是機體抗感染的第一道防線，是固有免疫的重要組成部分，主要參與非特異性免疫，在感染早期能迅速通過經(jīng)典途徑、旁路途徑或凝集素途徑被活化，作用過程中可產(chǎn)生攻膜復(fù)合物以及 C3a 和 C5a 等關(guān)鍵中間產(chǎn)物，具有溶解細(xì)胞作用、調(diào)理作用、炎癥介質(zhì)作用、清除免疫復(fù)合物作用及免疫調(diào)節(jié)作用。非常低的補體濃度即可誘導(dǎo)強烈的免疫效應(yīng)，并參與炎癥和過敏反應(yīng)。其中，過敏毒素C3a和C5a兩種信號分子能夠引起血管擴張，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，引起組胺的釋放和氧化爆發(fā)，并作為天然免疫細(xì)胞趨化的信號，影響促炎和過敏反應(yīng)的程度，產(chǎn)生過敏反應(yīng)性臨床表現(xiàn)。C4a的產(chǎn)生是補體通過經(jīng)典或凝集素途徑激活的標(biāo)志。Bb因子是B因子的可溶性副產(chǎn)物，也是補體通過旁路途徑活化的特異性標(biāo)志物[6]。過敏反應(yīng)、類過敏反應(yīng)和增加(不希望的)抗體反應(yīng)都可由補體激活引起。

巨噬細(xì)胞屬于單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，在機體組織中廣泛存在，是機體免疫防御、免疫自穩(wěn)、免疫監(jiān)視中的重要組成部分。在機體的獲得性免疫和先天性免疫中均有著至關(guān)重要的作用。本文通過建立體外巨噬細(xì)胞補體激活模型，對蔗糖中的顆粒雜質(zhì)進行提取制備并進行粒徑分析，發(fā)現(xiàn)該微粒的粒徑為100～300 nm；顆粒雜質(zhì)可促進C3a的產(chǎn)生，激活C5轉(zhuǎn)化酶，產(chǎn)生C5a；C4a和Bb含量相比空白對照均有增加，證明該微粒可通過經(jīng)典途徑、甘露糖凝集素途徑或旁路途徑激活補體。不同廠家蔗糖的補體激活程度不同。

1 材料與試劑

1.1 儀器 納米顆粒跟蹤分析儀(Particle Metrix，ZetaView)；切向流超濾系統(tǒng)(PALL，Minimate EVO)；離心過濾器(Millipore，Amicon Ultra 15)；凍干機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司，F(xiàn)D-1A-50)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，F(xiàn)orma 371)；倒置熒光顯微鏡(Olympus Corporation，IX53)；離心機(Thermo Fisher，Multifuge X3R)；酶標(biāo)儀(Molecular Devices，SpectraMax M2e)。

1.2 材料和試劑 蔗糖：A公司(批號：40482A)，編號：Suc-1；B公司(批號：191105)，編號：Suc-2；C公司(批號：102420190601)，編號：Suc-3；D公司(批號：20200207)，編號：Suc-4。PBS緩沖液、1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)均來自Gibco公司；Ficoll單個核細(xì)胞分離液(GE Healthcare)；去離子水；鱟試劑(50-0.005 EU·mL-1，Charles River)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(Charles River)；細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(9 000 EU·mL-1，中國食品藥品檢定研究院)；人補體片段3a(C3a)ELISA試劑盒；人補體片段4a(C4a)ELISA試劑盒；人補體片段5a(C5a)ELISA試劑盒；人補體片段Bb(CBb)ELISA試劑盒。

1.3 細(xì)胞 人骨髓來源巨噬細(xì)胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司，用Procell人骨髓來源巨噬細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 蔗糖中顆粒雜質(zhì)的制備和粒徑測定

2.1.1 不溶性顆粒物的提取和制備 取蔗糖適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加去離子水溶解并稀釋至刻度，制得濃度為100 mg·mL-1的溶液。用切向流過濾系統(tǒng)進行濃縮，用針對超純水的滲濾去除蔗糖，直到達到15倍于樣本溶液體積的透析液。將透析液通過微孔濾膜濾過，以3 000 r·min-1的速率離心10 min進一步濃縮液[7]，標(biāo)記為NPI溶液。另取去離子水100 mL同法處理，作為空白對照。

2.1.2 顆粒雜質(zhì)粒徑測定 采用納米顆粒跟蹤分析儀測定粒徑及其分布。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測 取1支細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1 mL，渦旋混勻15 min，得到9 000 EU·mL-1的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，將該溶液稀釋得0.5～1 000 EU·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。另取蔗糖樣品適量，加內(nèi)毒素檢查用水稀釋得25 mg·mL-1的溶液，分別按5倍和10倍稀釋。取10倍稀釋液和0.125 EU·mL-1的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液以1∶1混合，渦旋混合30 s得陽性對照溶液。參照《中國藥典》2020年版(四部)[8]通則1143方法1 凝膠法進行測定。

2.3 巨噬細(xì)胞補體激活體外模型探究蔗糖顆粒雜質(zhì)的補體激活途徑

2.3.1 樣品溶液的配制 精密稱取蔗糖適量，以PBS為溶劑，制得濃度分別為1、0.1、0.01 mg·mL-1的樣品溶液。取提取制備的顆粒雜質(zhì)溶液，過濾除菌，稀釋得到108、107、106個/mL 3個工作濃度的樣品溶液。

2.3.2 人骨髓來源巨噬細(xì)胞的培養(yǎng) 人骨髓來源巨噬細(xì)胞，以Procell人骨髓來源巨噬細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3.3 補體激活模型的建立 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，狀態(tài)穩(wěn)定后，加入100 μL不同工作濃度的各樣品溶液，設(shè)置3個復(fù)孔。12 h后收集上清，1 000 r·min-1離心20 min。將所獲上清液用于ELISA檢測含量。

2.3.4 ELISA法測定上清液中C3a、C4a、C5a、Bb含量 采用ELISA法測定培養(yǎng)上清液中的補體含量,操作步驟按C3a、C4a、C5a、Bb試劑盒說明書進行測定，用酶標(biāo)儀讀取450 nm波長處吸光度值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用IBM SPSS Statistics 25對數(shù)據(jù)進行分析，組間差異采用One-way ANOVA進行統(tǒng)計學(xué)分析，P≤0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測 細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分，可引起發(fā)熱等炎癥表現(xiàn)，其主要成分為脂多糖(LPS)。LPS活化的巨噬細(xì)胞其補體釋放含量會增加。鱟試劑法對待測樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測試驗結(jié)果表明，本試驗待測樣本中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量均低于0.005 EU·mg-1。即樣品中內(nèi)毒素污染較小，可排除假陽性的可能，免疫應(yīng)答是由于樣品本身的刺激而導(dǎo)致。

3.2 顆粒雜質(zhì)的粒徑及其分布 對提取得到的蔗糖中雜質(zhì)顆粒進行尺寸和數(shù)量的測定，結(jié)果見圖1。由圖1A可知不同廠家蔗糖中顆粒雜質(zhì)的粒徑及其分布均有所差異，單位體積所含有的顆粒數(shù)不同，但總體來說，粒徑分布在80～300 nm之間。圖1B是制備的顆粒雜質(zhì)的粒子成像圖，在納米顆粒跟蹤儀的測試下該顆粒可以直觀顯示并被追蹤。據(jù)文獻報道，該顆粒雜質(zhì)由葡聚糖、灰分和芳香族著色劑組成，在糖精制過程中沒有完全去除[9]。

A.粒徑及其分布的比較圖；B.制備的顆粒雜質(zhì)成像圖圖1 提取制備的顆粒雜質(zhì)及不同廠家蔗糖中顆粒雜質(zhì)的粒徑及其分布

3.3 補體激活途徑 已有研究表明一些納米顆?？赡苷T導(dǎo)補體激活[10]，其活化的程度和機制取決于多種因素，包括納米粒子的大小、表面特征和形態(tài)[11-12]。由圖2可知，來自蔗糖的顆粒雜質(zhì)可促進C3a的產(chǎn)生，C3a是C3蛋白被C3轉(zhuǎn)換酶復(fù)合體裂解后產(chǎn)生的一種過敏性毒素，隨后在補體末端途徑中達到頂峰：激活C5轉(zhuǎn)化酶，開始產(chǎn)生C5a。C4a和Bb含量相比空白對照均有一定程度的增加，因此該顆粒雜質(zhì)能夠激活體外巨噬細(xì)胞補體系統(tǒng)，其途徑可能有經(jīng)典途徑、甘露糖凝集素途徑或旁路途徑。

圖2 ELISA方法測定蔗糖中顆粒雜質(zhì)激活各補體的含量在對不同廠家來源的蔗糖溶液

分別取濃度為0.01、0.1和1 mg·mL-1的不同廠家的蔗糖配制的溶液與巨噬細(xì)胞共孵育，用ELISA法測定上清液中C3a、C5a、Bb和C4a的含量，結(jié)果如圖3所示。與對照相比，不同廠家的蔗糖溶液均可以引起顯著的補體激活效應(yīng)，其中A廠家的產(chǎn)Suc-1處理后的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生了較高含量的C3a、C5a、Bb和C4a，這可能與其中顆粒雜質(zhì)的粒徑較大有關(guān)。

圖3 不同廠家的蔗糖產(chǎn)品促進補體激活的比較

4 討論

蔗糖中存在的顆粒雜質(zhì)粒徑約為80～300 nm之間，這部分顆粒有可能激活補體系統(tǒng)，存在免疫應(yīng)答風(fēng)險造成用藥安全隱患。為減少其中的納米顆粒雜質(zhì)，生產(chǎn)者可通過使用小孔徑過濾器(例如0.02 μm)過濾除去納米顆粒雜質(zhì)，也可改進生產(chǎn)工藝并制定相關(guān)的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，對高風(fēng)險給藥途徑用的蔗糖中納米顆粒雜質(zhì)進行合理控制。