楊杰 彭啟倫 郭步伐 丁維俊

(1.畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)系，貴州 畢節(jié) 551700；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610075)

半夏與附子同方配伍一直以來(lái)頗受眾多醫(yī)家的爭(zhēng)議，源于附子來(lái)自烏頭的側(cè)根，隨后形成了附子反半夏這一假說(shuō)；同時(shí)，《中華人民共和國(guó)藥典2020版》中指出附子不應(yīng)與半夏相配伍。然而，半夏附子同方配伍見(jiàn)于眾多古方之中，如出自《扁鵲心書(shū)神方》的附子半夏湯，以及見(jiàn)于《傷寒雜病倫》的小青龍湯、附子梗米湯和竹葉湯[1-2]。李筠等[3]收集文獻(xiàn)1295篇，涉及患者30042例，發(fā)現(xiàn)半夏附子同方配伍主要用于治療咳喘、胸痹、胃炎胃痛等疾病。李玲等[4]研究結(jié)果表明，附子與半夏配伍可能通過(guò)抗自由基和減少細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

胸痹屬于中醫(yī)病名，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)冠心病有異曲同工之妙，其主要病機(jī)為心脾肝腎虧虛，兼有寒凝、氣滯、血瘀和痰阻，乃至心脈失養(yǎng)所致?！渡颀埍静萁?jīng)》中記載附子、半夏為“下品”之藥，但卻應(yīng)用廣泛?！侗菊聟R言》曰：“附子辛溫大熱，其性善走，為通十二經(jīng)純陽(yáng)之要藥，外則達(dá)皮毛而除表寒，里則達(dá)下元而溫痼冷，徹內(nèi)徹外，凡三焦經(jīng)絡(luò)，諸臟諸腑，果有真寒，無(wú)不可治?！卑胂奈缎列詼囟铮瑸樵餄窕?，溫化寒痰之要藥。兩藥性味相似，配伍用藥，辛溫化痰消瘀而除胸痹，共奏減毒增效之功。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為系統(tǒng)生物學(xué)的一門(mén)分支學(xué)科，可闡釋中藥及復(fù)方調(diào)控疾病靶點(diǎn)、信號(hào)通路的整體網(wǎng)絡(luò)，在中醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[5-7]。周思思等[8-9]通過(guò)UPLC/Q-TOF-MS建立半夏附子配伍后水煎液生物堿成分的化學(xué)指紋圖譜，并分析其差異變化顯著的化學(xué)成分。楊欣等[10]應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲取8個(gè)半夏-附子藥對(duì)關(guān)鍵活性成分，并篩選了磷脂酰肌醇三激酶α(PI3Kα)，類(lèi)脂磷酸酶(PTEN)，3-磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶1(PDK1)等抗腫瘤關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白。但是從半夏-附子藥對(duì)角度切入研究冠心病仍是十分缺乏的。因此，我們通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接方法探究半夏-附子藥對(duì)拮抗冠心病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1半夏-附子藥對(duì)活性成分篩選 在中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)收集半夏、附子的化學(xué)成分。以口服生物利用度(OB≥30%)和類(lèi)藥性(DL≥0.18)為標(biāo)準(zhǔn)建立半夏-附子藥對(duì)的化學(xué)成分集，并在TCMSP中查詢(xún)各自化學(xué)成分的相應(yīng)靶點(diǎn)。將上述所收集到的靶點(diǎn)在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)基因名，選擇的物種為人，以靶基因的縮寫(xiě)表示。

1.2收集疾病相關(guān)靶點(diǎn) 以coronary heart disease為關(guān)鍵詞在DisGeNET(http://www.disgenet.org/)和OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索冠心病相關(guān)靶點(diǎn)，然后通過(guò)R3.6.2軟件將半夏-附子藥對(duì)活性成分的靶點(diǎn)與冠心病相關(guān)靶點(diǎn)繪制韋恩圖并取交集，得到共同的靶點(diǎn)。

1.3構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI網(wǎng)絡(luò)) 將上述分析得到的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https://www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為人，得到了半夏-附子藥對(duì)治療冠心病的PPI網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)R3.6.2軟件將其得到的“TSV”文件進(jìn)行柱狀圖分析，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)自由度(degree)值，degree值越大表示節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的核心地位。

1.4GO與KEGG富集分析 使用R3.6.2軟件對(duì)半夏-附子藥對(duì)拮抗冠心病的靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG富集分析，選擇物種為人，篩選出P<0.05的生物學(xué)過(guò)程與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并根據(jù)富集P值的顯著性進(jìn)行排序，將富集P值前20位的通路以柱狀圖的形式進(jìn)行展示。

1.5構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)并分析 Cytoscape3.7.1是中藥及復(fù)方網(wǎng)絡(luò)的可視化分析軟件。輸入半夏-附子藥對(duì)活性成分以及半夏-附子藥對(duì)拮抗冠心病的相關(guān)靶點(diǎn)，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，導(dǎo)入KEGG富集信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.6分子對(duì)接驗(yàn)證 選取PPI網(wǎng)絡(luò)degree值排名前6位的靶點(diǎn)以及富集8條以上KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載化合物2D結(jié)構(gòu)的“.sdf ”格式文件，并通過(guò)Chem3D軟件轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)“.mol2”格式文件。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)中下載靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)“.pdb ”格式文件，并經(jīng)PyMOL軟件去除水分子和小分子配體。在AutoDockTools 1.5.6軟件中導(dǎo)入靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，經(jīng)加氫、分配電荷等輸出“.pdbqt”格式文件，然后輸入活性成分“.mol2”格式文件，并輸出活性成分“.pdbqt”格式文件，運(yùn)行Grid模塊設(shè)置蛋白原配體對(duì)接的活性口袋；最后運(yùn)行AutoDock_vina 1.1.2分子模擬軟件進(jìn)行分子對(duì)接，用結(jié)合能評(píng)價(jià)化合物與受體的匹配情況，采用PyMOL軟件繪制最佳匹配結(jié)果圖。

2 結(jié)果

2.1半夏-附子藥對(duì)活性成分的篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲取半夏化學(xué)成分116個(gè)，附子化學(xué)成分65個(gè)。以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為條件篩選到半夏化學(xué)成分13個(gè)，附子化學(xué)成分21個(gè)。通過(guò)TCMCP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，11個(gè)半夏化學(xué)成分和6個(gè)附子化學(xué)成分均查詢(xún)到相應(yīng)的靶點(diǎn)。17個(gè)化合物的代碼、分子名以及相應(yīng)的口服生物利用度、類(lèi)藥性和相應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)值見(jiàn)表1。

2.2半夏-附子藥對(duì)活性成分拮抗冠心病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 在DisGeNET、OMIM中以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞搜索冠心病相關(guān)靶點(diǎn)1679個(gè)，并與半夏-附子藥對(duì)活性成分相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到其共同靶點(diǎn)35個(gè)。這些靶點(diǎn)在半夏-附子藥對(duì)抗冠心病的過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用。

2.3構(gòu)建并分析半夏-附子藥對(duì)治療冠心病相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) 將上述35個(gè)共同靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建半夏-附子藥對(duì)活性成分拮抗冠心病相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)R語(yǔ)言制作柱狀圖，展示degree值較高的前30位，見(jiàn)圖1。尤其是degree值排名前6位的靶點(diǎn)：AKT1(RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)、FOS(原癌基因)、VEGFA(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A)、MMP9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)、PPARG(過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ)和PTGS2(前列腺素合成酶2)。

表1 半夏-附子藥對(duì)活性成分表

圖1 PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值前30位的靶點(diǎn)

2.4GO生物學(xué)過(guò)程富集與KEGG通路富集分析 通過(guò)R語(yǔ)言對(duì)半夏-附子藥對(duì)活性成分拮抗冠心病的35個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程富集分析，結(jié)果顯示35個(gè)靶點(diǎn)共在57個(gè)GO term上富集。圖2展示了富集P值較顯著的前20位生物學(xué)過(guò)程，如腎上腺素受體活性(adrenergic receptor activity)、細(xì)胞核受體活性(nuclear receptor activity)、轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity)、兒茶酚胺結(jié)合(catecholamine binding)、類(lèi)固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)等。

對(duì)半夏-附子藥對(duì)活性成分拮抗冠心病的35個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示35個(gè)靶點(diǎn)共富集在75條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上。圖3展示了富集P值較顯著的前20位KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(hsa05417：Lipid and atherosclerosis)通路富集P值最顯著，此通路參與的靶點(diǎn)有9個(gè)，在所有信號(hào)通路里靶點(diǎn)存在的數(shù)量最高，分別為RXRA(視黃酸受體RXR-α)、RELA(轉(zhuǎn)錄因子p65)、AKT1(RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)、BCL2(細(xì)胞凋亡調(diào)控因子)、FOS(原癌基因)、BAX(細(xì)胞凋亡調(diào)控因子)、MMP9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)、NFATC1(活化T細(xì)胞的核因子)和PPARG(過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ)。同時(shí)，脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路所參與AKT1、FOS、MMP9和PPARG等4個(gè)靶點(diǎn)與PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前6位的靶點(diǎn)相吻合，提示了此4個(gè)靶點(diǎn)在半夏-附子藥對(duì)抗冠心病中的重要性。

圖2 GO富集分析

2.5構(gòu)建并分析“半夏-附子藥對(duì)活性成分-冠心病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò) 將半夏-附子藥對(duì)活性成分拮抗冠心病的35個(gè)靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建“半夏-附子藥對(duì)活性成分-冠心病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖4)，此網(wǎng)絡(luò)圖共包含53個(gè)節(jié)點(diǎn)(一個(gè)半夏-附子藥對(duì)、一種疾病、35個(gè)靶基因、16個(gè)活性成分)和187條邊；將KEGG富集通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖5)，由富集P值較顯著的前20條信號(hào)通路與24個(gè)靶點(diǎn)組成，其中AKT1富集18條KEGG信號(hào)通路，RELA(15)，F(xiàn)OS(12)，MMP9(10)，NFATC1(8)。結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)degree值排名前6位的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，半夏-附子藥對(duì)與上述靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的化合物為baicalein(MOL002714)、coniferin(MOL000519)、Cavidine (MOL002670)、beta-sitosterol(MOL000358)、Stigmasterol (MOL000449)、Deltoin(MOL002392)、Deoxyandrographolide (MOL002395)、Karanjin(MOL002398)、xanthine-9 (MOL006967)等，相應(yīng)靶點(diǎn)為AKT1、RELA、FOS、MMP9、NFATC1、VEGFA、PPARG、PTGS2等，主要涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(hsa05417：Lipid and atherosclerosis)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。

圖3 KEGG富集分析

圖4 半夏-附子藥對(duì)活性成分-冠心病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖5 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

2.6分子對(duì)接結(jié)果 一般認(rèn)為，分子對(duì)接結(jié)合能的絕對(duì)值越大，化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合力越強(qiáng)，構(gòu)象也就越穩(wěn)定。某研究表明，結(jié)合能絕對(duì)值大于5，提示結(jié)合能力較高[11-12]；結(jié)合能絕對(duì)值大于7時(shí)，提示結(jié)合能力高[6]。表2中所有分子對(duì)接結(jié)合能絕對(duì)值均大于5，尤其是baicalein(AKT1)、baicalein(FOS)、baicalein(MMP9)、baicalein(PTGS2)、cavidine(PTGS2)和deltoin(PTGS2)分子對(duì)接結(jié)合能絕對(duì)值大于9。同時(shí)，AKT1、FOS、MMP9和PTGS2靶點(diǎn)與PPI網(wǎng)絡(luò)degree值排名前6位的靶點(diǎn)相一致。綜上分析，baicalein、cavidine和deltoin可能是半夏-附子藥對(duì)抗冠心病的關(guān)鍵成分。

表2 半夏-附子藥對(duì)活性成分與冠心病相關(guān)靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

圖6 分子對(duì)接模擬圖

3 討論

經(jīng)數(shù)字信息挖掘，半夏與附子中16個(gè)活性成分調(diào)控35個(gè)冠心病相關(guān)靶點(diǎn)，涉及75條生物學(xué)過(guò)程，體現(xiàn)半夏-附子同方配伍抗冠心病的多組分、多靶點(diǎn)和多通路的特點(diǎn)。PPI網(wǎng)絡(luò)柱狀圖分析提示了半夏-附子藥對(duì)活性成分拮抗冠心病的核心靶點(diǎn)，其蛋白產(chǎn)物涉及炎癥、脂質(zhì)代謝、血管內(nèi)皮調(diào)控等重要生理生化過(guò)程。因剪切應(yīng)力和血流量的影響，AKT1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其在血管內(nèi)的活性將被來(lái)自血液的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)所激活[13-14]；同時(shí)，活化的ATK1將激活血管內(nèi)皮一氧化氮合成酶(eNOS)，進(jìn)一步生成一氧化氮(NO)，并促進(jìn)血管擴(kuò)張和增強(qiáng)血流量[13-14]。PPARG(過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ)的下游信號(hào)可產(chǎn)生脂聯(lián)素，減少脂肪組織炎癥，并改善胰島素抵抗，緩解動(dòng)脈粥樣硬化病變[15-17]。已有研究表明，MMP9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)和PTGS2(前列腺素合成酶2)為炎癥基因，其血清中水平的升高可增加缺血性中風(fēng)急性事件的發(fā)生，惡化加重冠心病發(fā)生的進(jìn)程[18-25]?？傊陨习悬c(diǎn)，炎癥基因與抗炎癥基因共存，半夏-附子藥對(duì)活性成分通過(guò)協(xié)調(diào)其平衡而改善冠心病患者的預(yù)后，從而很大程度上減少其致死率。

KEGG通路富集分析所得到的信號(hào)通路大多數(shù)與炎癥過(guò)程、脂質(zhì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。由圖3可知，脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(hsa05417：Lipid and atherosclerosis)[26-28]通路富集P值最顯著，可認(rèn)為是半夏-附子藥對(duì)活性成分拮抗冠心病的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在此通路中，低密度脂蛋白(LDL)通過(guò)血管內(nèi)膜形成輕微氧化修飾的LDL(mmLDL)，再進(jìn)一步氧化修飾成oxLDL，并被攝取入巨噬細(xì)胞，然后吞噬大量脂滴并形成泡沫細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增生、遷移，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。同時(shí)、細(xì)胞壞死、凋亡將促進(jìn)不穩(wěn)定性斑塊形成。其中，BCL-2[29-30]、BAX[31-32]和FOS[33-34]是參與細(xì)胞凋亡生物學(xué)過(guò)程的關(guān)鍵基因。經(jīng)“靶點(diǎn)-通絡(luò)”網(wǎng)絡(luò)分析，AKT1、RELA[35-37]、FOS、MMP9和NFATC1[38-41]靶點(diǎn)所參與KEGG信號(hào)通絡(luò)數(shù)量較多，而AKT1、FOS和MMP9為PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前6位的靶點(diǎn)，可認(rèn)為是半夏-附子藥對(duì)活性成分拮抗冠心病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

經(jīng)過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)、藥物-成分-靶點(diǎn)-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)和分子對(duì)接分析，半夏-附子藥對(duì)活性成分所調(diào)控的關(guān)鍵冠心病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路；根據(jù)分子對(duì)接結(jié)合能絕對(duì)值大于9，我們認(rèn)為半夏-附子藥對(duì)拮抗冠心病的關(guān)鍵有效成分為baicalein、cavidine和deltoin，其調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn)為AKT1、FOS、MMP9和PGTS2。但是，后期還需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。