王藝璇，譚影影，陳美琳，黃佳奇，翟弋焱，吳嘉瑞

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488)

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，其病因尚不明確。2018年調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全球女性乳腺癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中最高，達24.2%[1]。我國女性乳腺癌發(fā)病率(36.1/105)和死亡率(8.8/105)分別居我國女性惡性腫瘤的第1位和第4位，年度變化百分比分別為3.9%和1.1%，均呈現(xiàn)升高趨勢[1-2]。中醫(yī)相關(guān)資料研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌屬于中醫(yī)學(xué)“乳石癰”“乳巖”等范疇，后世稱該病為“乳巖”并沿用至今[3]。乳腺癌常見的中醫(yī)證型為肝郁氣滯、脾虛痰濕和沖任失調(diào)型等，氣郁、痰濁、瘀血和熱毒等邪氣盛實為形成乳腺癌的主要原因[3-4]。近年來，中醫(yī)對乳腺癌的了解記錄已經(jīng)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對乳腺癌的描寫特征基本一致[5]。人參固本口服液由人參、熟地黃、牡丹皮、茯苓、山茱萸、山藥、生地黃、澤瀉、麥冬和天冬10味藥組成。研究結(jié)果表明，人參含有人參皂苷、人參烯等多種可能具有抗癌作用的化學(xué)成分[6]；茯苓作為扶正抗癌藥，具有促進免疫球蛋白形成等免疫增強作用，可激活免疫監(jiān)視系統(tǒng)，直接抑制腫瘤的生長[7]。因此，人參固本口服液具有益氣補血、安心寧神和健脾固腎等功效，對乳腺癌具有一定的治療作用。中藥的特點為多成分、多作用靶點和作用途徑復(fù)雜等，方劑配伍以“君、臣、佐、使”為組方原則[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的特點與中醫(yī)藥學(xué)的原理殊途同歸，這為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化和國際化指明了方向[8-9]。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，探討人參固本口服液的作用機制，為人參固本口服液在乳腺癌及其他疾病中的合理應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 收集并篩選人參固本口服液的活性成分

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)(https://tcmsp-e.com/)以及BATMAN-TCM平臺(https://bionet.ncpsb.org.cn/bat-man-tcm/)，分別以人參、熟地黃、牡丹皮、茯苓、山茱萸、山藥、澤瀉、天冬、地黃和麥冬為關(guān)鍵詞檢索人參固本口服液中的化學(xué)成分。同時，系統(tǒng)檢索各大數(shù)據(jù)庫中關(guān)于人參固本口服液化學(xué)成分研究的已有文獻，篩選出同為人參固本口服液的活性化合物作為補充。口服生物利用度(OB)≥30%的化合物被認(rèn)為可被人體吸收利用[10]。類藥性(DL)≥0.18的成分對機體產(chǎn)生活性具有重要參考價值[11]。因此，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為篩選條件，借助TCMSP平臺得到上述10味藥中化合物符合的成分作為活性成分。在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索時，以scorecutoff≥20且P-valuecutoff<0.5為篩選條件。

1.2 預(yù)測人參固本口服液活性成分的靶點

借助Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubch-em.ncbi.nlm.nih.gov/)收集活性成分的簡化分子線形輸入規(guī)范(SMILES)信息，并將所得信息導(dǎo)入SWISSTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch)預(yù)測靶點。在Pubchem數(shù)據(jù)庫無法獲取活性成分的SMILES信息，則直接在SWISSTargetPrediction數(shù)據(jù)庫上畫出該化合物的結(jié)構(gòu)來預(yù)測靶點。

1.3 乳腺癌相關(guān)靶點篩選

以“breast cancer”為關(guān)鍵詞，在人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM)(https://www.omim.org/)和基因名片數(shù)據(jù)庫(GeneCards)(https://www.genecards.org/)中檢索篩選乳腺癌的相關(guān)靶點，合并得到的所有靶點并去除重復(fù)數(shù)據(jù)，最后結(jié)果為乳腺癌的相關(guān)靶點。

1.4 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

使用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建人參固本口服液活性化合物和預(yù)測靶點構(gòu)建“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)并分析,通過度值、介數(shù)中心度和緊密中心度3個關(guān)鍵拓撲參數(shù)篩選關(guān)鍵化合物。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

取化合物靶點和乳腺癌靶點的交集靶點,將所得靶點錄入STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/cgi/input.pl)，得到其PPI網(wǎng)絡(luò)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中進行拓撲分析并使用軟件中的MCODE功能對其進行模塊分析。

1.6 富集分析

使用Metascape(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)平臺對MCODE分析獲得的人參固本口服液治療乳腺癌的潛在關(guān)鍵基因進行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，并將結(jié)果以氣泡圖的形式呈現(xiàn)。

1.7 分子對接

在STRING網(wǎng)站上獲取核心靶點的PDB編碼，輸入至蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB，https://www.rcsb.org/)，下載該核心靶點三維結(jié)構(gòu)的PDB格式。在PubChem數(shù)據(jù)庫下載對應(yīng)化合物三維結(jié)構(gòu)的SDF文件，并用Chem 3D轉(zhuǎn)變?yōu)镻DB格式。利用Notepad++軟件對從PDB數(shù)據(jù)庫下載的蛋白結(jié)構(gòu)去水和去除蛋白原結(jié)構(gòu)以外的其他小分子結(jié)構(gòu)。上傳至Autodock Tools 1.5.6設(shè)置活動鍵和可旋轉(zhuǎn)鍵時需要移動的最少原子數(shù)目，保存為pdbqt格式。將處理后的蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Autodock Tools軟件中進行合并非極性氫、加氫和加電荷等操作，并確定活性口袋位置，設(shè)置Grid Box的坐標(biāo)與盒子大小。最后，使用Autodock Vina 1.1.2軟件進行分子對接運算并使用PyMol 2.3.2軟件進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 篩選活性化合物

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索人參、澤瀉、熟地黃、地黃、牡丹皮、茯苓、天冬、山茱萸、山藥和麥冬10味中藥的活性成分。由于TCMSP數(shù)據(jù)庫沒有麥冬、地黃的相關(guān)成分，故在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索。查找相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re以及丹皮酚在人參固本口服液中含量較高，且藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)作用，故將其保留為人參固本口服液的活性成分。最終共得到129個活性化合物及對應(yīng)靶點489個，以及乳腺癌相關(guān)人類靶點15 240個(人參活性化合物22個、靶點542個；澤瀉活性化合物10、靶點900個；熟地黃活性化合物2個、靶點200個；天冬活性化合物9個、靶點837個；牡丹皮活性化合物11個、靶點453個；地黃活性化合物2個、靶點29個；茯苓活性化合物15個、靶點821個；麥冬活性化合物18個、靶點411個；山茱萸活性化合物20個、靶點359個；山藥活性化合物16個、靶點282；補充活性化合物4個、靶點79個)，兩者交集靶點共448個。其中，度值較大的靶點為SHBG、AR、CYP17A1、HMGCR、PTPN2和CES2等。

2.2 “化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將人參固本口服液的活性化合物及潛在靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2進行網(wǎng)絡(luò)分析，得到的人參固本口服液化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)共包含603個節(jié)點、3 262條邊，見圖1；圖中，正方形表示藥物；菱形表示靶點；六邊形表示藥物的共同化合物；圓形表示化合物。在“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點的度值代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點相連路線的條數(shù)。根據(jù)度值、介數(shù)中心度和緊密中心度3個關(guān)鍵拓撲參數(shù)篩選關(guān)鍵化合物。若1個節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中連接較多的化合物或者靶點，其可能為關(guān)鍵的化合物或靶點。各邊表示化合物分子與靶點間的相互作用關(guān)系。將人參固本口服液的活性化合物作用靶點和乳腺癌相關(guān)人類靶點取交集，共得到448個靶點，制作成韋恩圖，見圖2。

圖1 人參固本口服液化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 人參固本口服液-乳腺癌共同靶點韋恩圖

2.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

將共同靶點通過STRING進行網(wǎng)絡(luò)分析，并利用Cytoscape 3.8.2得到其PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3；圖中，每個節(jié)點的大小代表其度值，連線的粗細代表邊介數(shù)。網(wǎng)絡(luò)中有448個節(jié)點和1 360條邊。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)可知，SRC、STAT3、MAPK3、MAPK1、HSP90AA1、EP300、PIK3R1、RELA、Akt1、JUN、EGFR、ESR1和RXRA等13個靶點為核心靶點。

圖3 人參固本口服液相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 模塊分析、GO和KEGG分析

在對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行分析后，對總的PPI網(wǎng)絡(luò)圖進行KEGG通路富集分析，共得到205條通路，圖4展示了前30條顯著的通路?；谖墨I搜索發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號通路在腫瘤方面研究廣泛，且其在KEGG分析結(jié)果中排序靠前，推測其與人參固本口服液治療乳腺癌的作用機制相關(guān)，見圖5；圖中，箭頭代表激活作用，線段代表抑制作用。對總的PPI網(wǎng)絡(luò)圖進行GO分析，最終得到與生物過程(BP)相關(guān)的條目2 949條；細胞組成(CC)相關(guān)條目180條；分子功能(MF)相關(guān)條目363條。展示各自前15條顯著的條目，表明人參固本口服液活性化合物可能通過多種生物調(diào)控過程發(fā)揮抗乳腺癌的作用，見圖6；圖中，圓形顏色由深至淺表示-lg(P)由大到小。同時使用Cytoscape 3.8.2的MCODE功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進行模塊分析，設(shè)置k-Core值為5，最終獲得4個聚類模塊，用Metascape進行GO和KEGG富集分析，并將結(jié)果可視化，見圖7。

圖4 KEGG通路富集分析部分結(jié)果圖

圖5 PI3K-Akt信號通路圖

圖6 GO功能富集分析部分結(jié)果圖

圖7 模塊分析與GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果圖

2.5 “中藥-化合物-靶點-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

將整理出的13個核心靶點與其對應(yīng)的化合物、藥材和排序居前30位的KEGG通路的數(shù)據(jù)，載入Cytoscape 3.8.2軟件中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型，得到“中藥-化合物-靶點-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖8；圖中，六邊形代表藥物，箭頭形代表化合物，圓形代表靶點，正方形代表通路。

圖8 “中藥-化合物-靶點-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對接

為進一步探究人參固本口服液治療乳腺癌的作用機制，選取SRC、HSP90AA1、PIK3R1、Akt1、EGFR和ESR1等6個核心靶點及其對應(yīng)的山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、馬爾肯久納醇苯酯(malkangunin)、豆固醇(stigmasterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)和谷甾醇(sitosterol)等6個活性化合物，用AutoDockTools和Vina軟件進行分子對接，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，最低結(jié)合能越小，表示其對接的效果越好，最低結(jié)合能<-20 929.26 J/mol表示具有良好的結(jié)合活性。利用PyMol對結(jié)果進行可視化，見圖9。

A.山柰酚作用于SRC；B.槲皮素作用于SRC；C.馬爾肯久納醇苯酯作用于HSP90AA1；D.山柰酚作用于PIK3R1；E.槲皮素作用于PIK3R1；F.山柰酚作用于Akt1；G.槲皮素作用于Akt1；H.山柰酚作用于EGFR；I.槲皮素作用于EGFR；J.豆固醇作用于ESR1；K.β-谷甾醇作用于ESR1；L.山柰酚作用于ESR1；M.谷甾醇作用于ESR1

表1 化合物與作用靶點結(jié)合表

3 討論

本研究通過靶點預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分子對接等方法，對人參固本口服液治療乳腺癌的作用機制進行初步的研究和探討。首先通過檢索數(shù)據(jù)庫和已有文獻獲得人參固本口服液中129個活性化合物，并對其進行靶點預(yù)測，共得到3 138個潛在作用靶點?！盎衔?靶點”網(wǎng)絡(luò)顯示山柰酚、槲皮素、豆甾醇和栓菌酸的Degree值最高，提示其在人參固本口服液治療乳腺癌的過程中發(fā)揮了重要作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山柰酚可以通過調(diào)控Akt/PI3K/糖原合成激酶3β信號通路對人炎性乳腺癌細胞株凋亡的促進作用[12]；槲皮素可以通過阻止乳腺癌干細胞中表皮生長因子誘導(dǎo)的血管生成[13]；谷甾醇可以抑制PI3K-Akt信號通路，逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡并抑制其轉(zhuǎn)移[14]。

SRC、STAT3、HSP90AA1、PIK3R1、Akt1、EGFR和ESR1被鑒定為核心靶點。研究結(jié)果表明，SRC的活化和過度表達在調(diào)節(jié)腫瘤血管生成、生存、遷移及侵襲等方面有著重要作用，而乳腺癌組織中的SRC表達顯著升高，且常存在異常活化[15]；STAT3可以調(diào)控cyclin家族及MMP家族等細胞的細胞周期進程，且STAT3的表達上調(diào)也可能與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)[16]；HSP90AA1參與伴侶蛋白復(fù)合物的組裝、蛋白質(zhì)折疊、調(diào)節(jié)蛋白熱反應(yīng)和細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等，而與正常的乳腺組織相比，乳腺癌組織中的HSP90AA1 mRNA高表達，且其高表達患者的總體生存期與無病生存期比低表達患者短[17]。

PI3K-Akt信號通路圖中的Akt、HSP90和RXRα為人參固本口服液的關(guān)鍵靶點，F(xiàn)OXO在人參固本口服液中的度值也較高。根據(jù)信號通路圖可知，藥物作用于PI3K、Akt后，一方面能夠抑制RXRα的磷酸化，從而抑制Bcl-2，提高細胞的存活率，另一方面能夠抑制FOXO的磷酸化，激活p27Kip1和RBL2，推動細胞周期進程。并且有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過度激活PI3K-Akt信號通路后，可以引起一系列反應(yīng)，包括細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移，從而與乳腺癌密切相關(guān)[18]。T淋巴細胞可以通過PI3K-Akt信號通路抑制乳腺癌的細胞增殖[19]。分子對接結(jié)果顯示，化合物小分子配體與其對應(yīng)蛋白受體對接的最低結(jié)合能均<-20 929.26 J/mol，說明結(jié)合情況較好，對應(yīng)的配體與受體間結(jié)合較牢固，親和力較高。

綜上所述，本研究使用多種數(shù)據(jù)庫和軟件，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，揭示了人參固本口服液治療乳腺癌的潛在藥理學(xué)機制，涉及多種成分、多個靶點與多條通路。本研究為人參固本口服液治療乳腺癌及其他疾病的臨床合理應(yīng)用提供了借鑒和參考。但是，考慮到本研究的主要依據(jù)為數(shù)據(jù)分析，因此需要生物學(xué)實驗及其他實踐結(jié)果進一步驗證本研究結(jié)果。