魏姍姍, 楊敏生, 梁海永
(1.衡水學(xué)院, 河北 衡水 053000; 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 河北 保定 071000)
桃(Prunuspersica)是薔薇科(Rosaceae) 李屬(Prunus)桃亞屬植物,起源于中國(guó)的西部地區(qū)[1],在長(zhǎng)期的人工選育過(guò)程中形成了適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境、滿足不同市場(chǎng)需求的品種,現(xiàn)分布在歐、亞、美、澳、非等五大洲,是一種在全球范圍內(nèi)廣泛種植的落葉類核果果樹[2-3]。相關(guān)研究表明,國(guó)內(nèi)各種桃品種種質(zhì)資源圃共收集保存了2 000余份桃種質(zhì)資源[4],了解這些資源是我們更好利用桃種質(zhì)資源的前提。從20世紀(jì)80年代初開始,國(guó)內(nèi)已有不少科研工作者對(duì)桃的種質(zhì)資源進(jìn)行分類[5]?,F(xiàn)在,已經(jīng)可以從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子標(biāo)記等方面對(duì)桃品種進(jìn)行分類和鑒定[6]。但上述方法不適合一些雜交的桃品種分類。因此研究桃品種的分子標(biāo)記輔助分類具有重要的意義[7]。
簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple sequence repeat,SSR) 具有標(biāo)記多態(tài)性好、通用性強(qiáng)且穩(wěn)定易重復(fù)等特點(diǎn),廣泛用于鑒定果樹種質(zhì)資源、分析果樹親緣關(guān)系[8]。但是,桃品種中已報(bào)道的SSR引物較少[9]。2013年,Verde等[10]將80 797條桃品種的ESTs 序列上傳至 NCBI,為以后人們利用SSR標(biāo)記對(duì)桃品種進(jìn)行遺傳多樣性分析提供了寶貴的資源[11]。凌世鵬等[12]分析了53份桃資源的遺傳多樣性。包文泉等[13]對(duì)長(zhǎng)柄扁桃10個(gè)野生群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚類分析。本研究通過(guò)查找分布在桃品種8個(gè)連鎖群中的SSR位點(diǎn),利用Popgene軟件對(duì)95個(gè)桃品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,以期更好地揭示桃品種中不同的生物學(xué)性狀與連鎖群間的遺傳關(guān)系。
95份供試材料主要來(lái)源于保定滿城縣林業(yè)局分院果樹種子苗木站,所取材料及編號(hào)見表1。采集桃幼嫩葉片,以保鮮袋包裝避免高溫,編號(hào)后帶回實(shí)驗(yàn)室,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
試劑及設(shè)備:2×TaqMaster Mix(是由TaqDNA Polymerase、PCR buffer、Mg2+、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成的預(yù)混體系)購(gòu)自北京世紀(jì)生物科技有限公司;相關(guān)的PCR引物序列是由上海生工生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成的;PCR反應(yīng)由Biometer公司的TG型PCR儀完成。引物分別從桃的8對(duì)染色體上各選取4個(gè)SSR位點(diǎn),從中篩選出18對(duì)引物。其序列如表2所示[14]。
1.2.1DNA提取及純化
采用改良的CTAB法提取桃的基因組DNA,進(jìn)行PCR之前,用微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量與濃度。并將DNA稀釋至30 ng/μL以備用。
1.2.2PCR擴(kuò)增反應(yīng)
PCR反應(yīng)總體積為10 μL,包括:4 μL 2×TaqMaster Mix引物0.5 μmol/L,1 μL模板DNA。SSR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變形5 min,94 ℃變形50 s,53~60 ℃退火50 s,72 ℃復(fù)性50 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸7 min,最后置于4 ℃冰箱保存。
1.2.3電泳檢測(cè)
將PCR產(chǎn)物與1/2體積的6×Loading Buffer充分混勻,取1.5 μL上樣在8%的變性聚丙烯酰胺凝膠上,之后用230 V電壓進(jìn)行60 min電泳。結(jié)束后,取下凝膠,放在0.1% AgNO3中銀染10 min;之后倒掉液體,用水洗去殘液。再將凝膠放在含有1.5% NaOH和0.4%甲醛的顯色液中直至條帶清晰為止。取出凝膠,并對(duì)其拍照記錄[15]。
假定凝膠上相同位置的條帶是來(lái)自于同一連鎖群上的同一個(gè)等位基因。按基因型統(tǒng)計(jì),從下往上,條帶依次記作A、B、C、D、E、F、G、H。對(duì)每個(gè)樣品的擴(kuò)增電泳譜帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì),構(gòu)成基因型的原始數(shù)據(jù)矩陣。假定桃品種中各個(gè)等位基因的頻率與哈迪-溫伯格平衡相符。利用Popgene軟件,計(jì)算桃品種間的觀測(cè)雜合值、觀測(cè)純和值、Nei’s基因多樣度、Shannon信息指數(shù)、期望雜合值、期望純和值、等位基因頻率及群體間遺傳距離。
如表3所示,桃品種8個(gè)連鎖群觀測(cè)到的等位基因數(shù)在4~9之間,有效等位基因數(shù)從2.2~5.5。第7連鎖群的觀測(cè)純合值最高,為0.89;其有效等位基因數(shù)最少,為2.2。第6連鎖群的觀測(cè)純合值最低,為0.47;其有效等位基因數(shù)最高,為5.45。說(shuō)明桃品種的7號(hào)連鎖群上的等位基因較少且純合較多,表明其連鎖群的保守性較高,不易突變。而桃品種的6號(hào)連鎖群上的等位基因較多且宜雜合,表明其連鎖群的保守性較差,易發(fā)生突變。從表2~表10中可以看出,所含有的有效等位基因數(shù)目從小到大依次為:7=2<4<8<1<5<3<6;桃品種8個(gè)連鎖群的純合度依次為:7>2>1>3>8>5>4>6。其中,第4連鎖群和第5連鎖群較為特殊。第4連鎖群有效等位基因數(shù)較多,其有效等位基因數(shù)較少,其純合度較低,即雜合度較高;第5連鎖群恰好相反,其有效等位基因數(shù)較多,其純合度較高,即雜合度較低。
表1 試驗(yàn)材料
表2 試驗(yàn)SSR引物
表3 不同連鎖群桃品種的遺傳多樣性
從表4可以看出,等位基因A、B、C和D是桃品種中分布最廣的四種基因,在桃的8個(gè)連鎖群中均有分布。等位基因E僅次于上述四種等位基因,分布在除第7連鎖群外的其余連鎖群上。等位基因H和I為6號(hào)連鎖群特有基因。從分布較廣的四種基因來(lái)看,等位基因C的頻率較高,為0.27,等位基因A的頻率較低,為0.11。從基因在連鎖群上的分布情況來(lái)看,等位基因A在第6連鎖群的頻率最高,為0.31,在第7和第8連鎖群的頻率最低,為0.03;等位基因B在第4連鎖群的頻率最高,為0.55,在第7連鎖群的頻率最低,為0.03;等位基因C在第2連鎖群的頻率最高,為0.63,在第6連鎖群的頻率最低,為0.02;等位基因D在第7連鎖群的頻率最高,為0.49,在第2和第6連鎖群的頻率最低,為0.06;等位基因E在第8連鎖群的頻率最高,為0.36,在第2連鎖群的頻率最低,為0.01;等位基因F在第5連鎖群的頻率最高,為0.22,在第3連鎖群的頻率最低,為0.09;等位基因G在第6連鎖群頻率較高,而等位基因H和I僅在6號(hào)連鎖群出現(xiàn)。
表4 不同連鎖群桃品種等位基因頻率
表5所示,球形和扁球形兩個(gè)類群觀測(cè)到的等位基因數(shù)在4~5之間,有效等位基因數(shù)在2.7左右。兩個(gè)類群從雜合值和純合值可以看出,球形果實(shí)品種純合子較多,而扁球形果實(shí)品種雜合子較多。基于桃果形性狀的類群遺傳分析中,扁球形類群的Nei’s基因多樣度高于球形類群,說(shuō)明扁球形類群遺傳多樣性更為豐富。
表5 不同果實(shí)形狀桃品種的遺傳多樣性
表6列出了球形和扁球形兩個(gè)桃類群的平均等位基因頻率。通過(guò)分析比較可以看出,扁球形類群等位基因頻率分布較球形類群更為均衡,說(shuō)明扁球形類群雜合性偏高。等位基因B的頻率在兩個(gè)類群中同為最高。通過(guò)對(duì)表中數(shù)據(jù)分析可知,球形類群等位基因頻率順序與扁球形類群差異較大,這說(shuō)明兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
表6 不同果實(shí)形狀桃品種等位基因頻率
從遺傳一致度(表7)看,兩個(gè)類群的遺傳一致度很高,為0.96,反映出連續(xù)分布類群間有較小的遺傳分化特點(diǎn)。
表7 兩類群間的Nei氏遺傳一致度的無(wú)偏估計(jì)值
表8所示,有毛和無(wú)毛兩個(gè)類群觀測(cè)到的等位基因數(shù)在4左右,有效等位基因數(shù)都是2.8。綜合表中數(shù)據(jù)可知,兩類群純合子較多,所占比例接近。基于桃有無(wú)毛性狀的類群遺傳分析中,有毛類群的Nei’s基因多樣度和Shannons遺傳表型指數(shù)均與無(wú)毛類群接近,說(shuō)明兩者遺傳多樣性相似。
表8 果皮有無(wú)毛桃品種類群的遺傳多樣性
如表9,等位基因C的頻率在兩個(gè)類群中同為最高。等位基因E與H,B與D,A與F在兩類群中的等位基因頻率順序恰好相反,據(jù)此推測(cè)等位基因E,B和A可能與有毛性狀相關(guān),等位基因H、D和F可能與無(wú)毛性狀相關(guān)。
表9 果皮有無(wú)毛桃品種類群的等位基因頻率
如表10,兩種群的遺傳一致度很高,為0.93,反映出連續(xù)分布種群間有較小的遺傳分化特點(diǎn)。
表10 兩類群間的Nei氏遺傳一致度的無(wú)偏估計(jì)值
SSR分子標(biāo)記技術(shù)由于其共顯性強(qiáng)、檢測(cè)方便且便于重復(fù)等特點(diǎn),已成為果樹育種中最重要的分子標(biāo)記之一[15]。目前,SSR分子標(biāo)記技術(shù)已成功用于桃的遺傳分析及品種鑒定[16]。本研究采用來(lái)自桃8條染色體18對(duì)核心引物,對(duì)95份桃品種的基因連鎖群和遺傳性狀進(jìn)行遺傳分析。更好地區(qū)分桃已有的不同性狀,為桃種群分類提供更好的分子鑒定體系。
遺傳多樣性是物種長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果,是種群生存和發(fā)展的前提[17]。通過(guò)Nei’s基因多樣度、Shannons信息指數(shù)不難看出,桃品種群體的8個(gè)連鎖群中7號(hào)連鎖群上的等位基因較少且純合較多,表明其連鎖群的保守性較高,不易突變。而桃品種的6號(hào)連鎖群上的等位基因較多且易雜合,表明其連鎖群的保守性較差,易發(fā)生突變。等位基因A、B、C和D是桃品種中分布最廣的三種基因,在桃的8個(gè)連鎖群中均有分布,為未來(lái)桃品種的連鎖群基因分析奠定了基礎(chǔ)。
基于桃果形性狀的類群遺傳分析中,扁球形類群的Nei’s基因多樣度略高于球形類群,Shannons遺傳表型指數(shù)極為接近,球形的為1.06,扁球形的為1.05,說(shuō)明扁球形與球形的品種類群遺傳多樣性比較均衡,果實(shí)的形狀在選種時(shí)并沒有作為重要的指標(biāo)。
基于桃有無(wú)毛性狀的類群遺傳分析中,有毛類群的Nei’s基因多樣度和Shannons遺傳表型指數(shù)均高于無(wú)毛類群,說(shuō)明有毛類群的遺傳多樣性和基因雜合度高于無(wú)毛類群。SSR分析中最重要的環(huán)節(jié)是引物的篩選,只要能開發(fā)出合適的引物,能夠廣泛地覆蓋不同的染色體,并對(duì)分析體系進(jìn)行優(yōu)化,就能挖掘SSR在種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用潛力。