童銀洪，劉 永，紀(jì)德安，肖松豐，高 平

（1廣東海洋大學(xué)珍珠研究所，廣東湛江 524025；2湛江海洋大學(xué)珍珠有限公司，廣東湛江 524025；3湛江市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東湛江 524022）

珍珠是珍珠分泌細(xì)胞形成的，由95%左右的生物碳酸鈣和5%左右的有機(jī)質(zhì)組成，其中有機(jī)質(zhì)包含多種生物活性物質(zhì)，如:蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、類(lèi)胡蘿卜素、牛磺酸和微量元素等[1-2]。珍珠粉是將珍珠粉碎、磨細(xì)而成的粉狀物。我國(guó)已有2000 多年珍珠粉的使用歷史，珍珠粉可用于內(nèi)科、外科、婦科、兒科、五官科、皮膚科等護(hù)膚、保健和醫(yī)藥行業(yè)，具有潤(rùn)膚祛斑、解毒生肌、安神定驚和明目消翳等功效[3-4]。近年來(lái)珍珠粉用于壓瘡護(hù)理、骨損修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)和改善產(chǎn)后切口愈合等方面，受到醫(yī)藥行業(yè)的廣泛關(guān)注[5-9]。

近年來(lái)中外許多學(xué)者開(kāi)展了珍珠的體外抗氧化性和美白機(jī)理研究，證實(shí)珍珠具有抗衰老的護(hù)膚功效[10-16]。市場(chǎng)上珍珠粉種類(lèi)繁多，從粒徑大小角度可分為普通、超細(xì)和納米級(jí)。人體皮膚的毛孔很細(xì)小，一般來(lái)說(shuō)，珍珠粉顆粒粒徑越細(xì)，其生物活性物質(zhì)就越容易滲透到肌膚底層，促進(jìn)皮膚新陳代謝、增強(qiáng)細(xì)胞活力，從而起到延緩衰老的作用。

目前珍珠粉透皮吸收的研究很少，只有楊安全等[17]比較了納米級(jí)與微米級(jí)珍珠粉的透皮吸收，兩種具有顯著性差異，納米級(jí)珍珠粉的經(jīng)皮滲透速度明顯快于微米級(jí)珍珠粉。但沒(méi)有研究珍珠粉的粒徑分布和礦物組成，難以深入比較透皮吸收效果，不利于珍珠粉加工技術(shù)的改進(jìn)與提高。珍珠粉生產(chǎn)廠家由于原料、加工設(shè)備、加工工藝和檢測(cè)技術(shù)等不同，珍珠粉的粒徑分布千差萬(wàn)別。若珍珠粉不能被吸收或者吸收不充分，功效則難以達(dá)到，還會(huì)造成皮膚的負(fù)擔(dān)。因此，研究不同粒徑珍珠粉的透皮吸收，具有理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三種不同粒徑的珍珠粉由海南某珍珠公司提供，經(jīng)過(guò)激光粒度分析儀檢測(cè)平均粒徑為0.3 μm、3 μm、10 μm，分別編號(hào)為樣品1、樣品2 和樣品3 號(hào)。

采用掃描電子顯微鏡（GeminiSEM 300 型，加速電壓為5kV）對(duì)三種不同粒徑的珍珠粉進(jìn)行微觀形貌觀察。

采用X 粉末衍射儀（PANalytical X’Pert PRO型，銅靶，波長(zhǎng)=0.154 nm）檢測(cè)三種珍珠粉樣品的物相組成。

采用紅外光譜儀（美國(guó)NEXUS 470 FT-IR 型）對(duì)三種珍珠粉進(jìn)行紅外光譜分析，測(cè)試條件：KBr壓片法，掃描范圍2000～400 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率為4 cm-1。

1.2 試劑與儀器

配制pH=5 純凈水：稱(chēng)取14.7 g 檸檬酸溶于700 mL 純凈水中，配成溶液A；稱(chēng)取29.4 檸檬酸三鈉溶于1000 mL 純凈水中，配成溶液B；將615 mL溶液A 與885 mL 溶液B 混合后，再加入1500 mL純凈水，測(cè)定pH 為5，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

分別稱(chēng)取0.3 μm、3 μm、10 μm 珍珠粉9 mg，轉(zhuǎn)移至50mL 容量瓶中，加pH=5 純凈水定容至刻度，均為澄清溶液，靜置24 h 無(wú)沉淀析出，常溫保存?zhèn)溆谩７Q(chēng)取無(wú)水氯化鈣粉末28 mg，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加pH=5 純凈水定容至刻度，溶液澄清，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)動(dòng)物：KM 小鼠，20±2 g，雌雄各半，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SCXK（湘）2019-0004，合格證號(hào)：1107272011006880。使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2019-0001。

主要試劑：純凈水；Ca 試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20200721）；無(wú)水氯化鈣（上海超強(qiáng)化工有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：151101），一水合檸檬酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20120131），二水合檸檬酸三鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20120118）。

主要儀器：TP-6 智能透皮試驗(yàn)儀（天津市精拓儀器科技有限公司），是一種滲透擴(kuò)散裝置，如圖1所示。滲透擴(kuò)散裝置由上下兩筒狀玻璃對(duì)合，皮膚夾于兩室之間，上為擴(kuò)散室，下為接收室，接受室的兩側(cè)有入口管和出口管，供取液和補(bǔ)充接受液之用；ME204E 分析電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；Infinite M200PRO 酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士）。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV754N，上海佑科儀器儀表有限公司）。

圖1 滲透擴(kuò)散裝置的示意圖

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠離體無(wú)毛皮膚的制備：用電動(dòng)剃毛器將小鼠腹部剃毛后，用脫毛膏進(jìn)行脫毛處理，生理鹽水洗凈腹部脫毛部位，飼養(yǎng)24 h 后處死，剝離無(wú)毛的腹部皮膚，去除皮下脂肪，用生理鹽水洗干凈后濾紙吸干水分，剪成適當(dāng)大小的圓形（直徑約3cm），再用pH=7.4 的磷酸鹽PBS 緩沖液漂洗干凈，濾紙吸干備用。

體外透皮試驗(yàn)：取30 塊小鼠皮膚，雌雄各半，隨機(jī)分為5 個(gè)組（分別為空白組、陽(yáng)性組、濃度為0.18 mg/mL 的0.3 μm、3 μm、10 μm 珍珠粉組），每組6 塊。利用TP-6 智能透皮試驗(yàn)儀，擴(kuò)散池的有效面積約為1.54 cm2，接受介質(zhì)為pH=5 純凈水，接受池的體積約為13.5 mL。將處理好的小鼠離體無(wú)毛皮膚固定于擴(kuò)散池和接受池之間，角質(zhì)層表面朝向擴(kuò)散池，在擴(kuò)散池中加入待測(cè)珍珠粉，用保鮮膜覆蓋擴(kuò)散池頂部及接受池取樣口，在350 r/min、（37±0.5）℃的條件下，分別于1、2、4、6、8、10、12、24 h 時(shí)從接受池中取樣0.4mL，置于0.5mL 離心管中保存待測(cè)，每次取樣后補(bǔ)加等量等溫的pH=5純凈水。采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定鈣離子含量。

鈣含量及其累計(jì)滲透量：

式中：OD 值為吸光度，無(wú)量綱。標(biāo)準(zhǔn)品濃度：5.04mmol/L

累積透過(guò)量：按照公式計(jì)算單位面積累積滲透量（Q）

式中：S為有效面積，1.54 cm2；V0為接受池中接收液體積，13.5 mL；V為取樣體積，0.4 mL；Ci為第i 次取樣時(shí)接收液中碳酸鈣質(zhì)量濃度，mg/mL〔0.1×鈣含量（mmol/L）〕；Cn為第n次取樣時(shí)接收液中碳酸鈣質(zhì)量濃度，mg/mL〔0.1×鈣含量（mmol/L）〕；n為取樣次數(shù)。以累積透過(guò)量為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制三種粒徑珍珠粉透皮吸收曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 掃描電鏡下特征

整體上，樣品1 的顆粒粒徑最小，但團(tuán)聚一起；樣品2 的顆粒粒徑居中，分布均勻；樣品3 的顆粒粒徑最大，差異也大，分布不均勻。如圖2 所示。

圖2 珍珠粉的掃描電鏡SEM 二次電子像（上-樣品1，中-樣品2，下-樣品3）

2.2 X 射線粉末衍射（XRD）分析

如圖3 所示，三個(gè)樣品的衍射峰位置與文石型碳酸鈣（標(biāo)準(zhǔn)PDF 卡片No.71-2396）的衍射峰位置一致[18]，表明三種珍珠粉的礦物組成主要為文石型碳酸鈣；樣品2 和樣品3 在衍射角2θ=29.4°位置有極弱的方解石（hkl=104）晶面的衍射峰，表明含有痕量方解石型碳酸鈣。

圖3 不同粒徑珍珠粉的XRD 圖譜

2.3 傅里葉紅外光譜（FT-IR）分析

如圖4 所示，三個(gè)樣品分別在1790cm-1、1448cm-1、1081 cm-1、860 cm-1、712 cm-1位置出現(xiàn)明顯吸收峰。其中1790 cm-1處吸收峰對(duì)應(yīng)的是C-O 伸縮振動(dòng)峰，1448 cm-1處對(duì)應(yīng)的是C-O 不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，在1081 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰對(duì)應(yīng)的是C-O 對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，在860 cm-1處對(duì)應(yīng)的是CO32-面外變形振動(dòng)峰，在712 cm-1處吸收峰對(duì)應(yīng)的是CO32-面內(nèi)變形振動(dòng)峰，這與文石型碳酸鈣的紅外光譜圖相對(duì)應(yīng)[19]。

圖4 不同粒徑珍珠粉的FT-IR 圖譜

X 射線粉末衍射譜和紅外光譜的測(cè)試結(jié)果表明，三種珍珠粉的礦物成分主要為文石型碳酸鈣，樣品2 和樣品3 含有痕量方解石型碳酸鈣。

2.4 三種粒徑珍珠粉中碳酸鈣經(jīng)皮累積滲透量

三種粒徑珍珠粉中碳酸鈣經(jīng)皮累積滲透量結(jié)果以X±S表示，如表1 所示。在三種粒徑珍珠粉中，1、2、4、6、8、10、12、24 h 時(shí)平均粒徑10 μm珍珠粉中碳酸鈣經(jīng)皮累積滲透量最低。1、2、6、8 h時(shí)平均粒徑0.3 μm 珍珠粉中碳酸鈣經(jīng)皮累積滲透量高于平均粒徑3 μm 珍珠粉中碳酸鈣經(jīng)皮累積滲透量；4、10、12、24 h 時(shí)平均粒徑3 μm 珍珠粉中碳酸鈣經(jīng)皮累積滲透量高于平均粒徑0.3 μm 珍珠粉中碳酸鈣經(jīng)皮累積滲透量。

表1 三種粒徑珍珠粉中碳酸鈣經(jīng)皮累積滲透量（，n=6）

表1 三種粒徑珍珠粉中碳酸鈣經(jīng)皮累積滲透量（，n=6）

2.5 三種粒徑珍珠粉中碳酸鈣經(jīng)皮滲透速率

以累積滲透量為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制經(jīng)皮滲透曲線，如圖5 所示。平均粒徑0.3 μm 珍珠粉：Q=0.0055t+0.2778（n=6，r=0.6083），經(jīng)皮滲透速率為0.0055 mg·cm-2·h-1。平均粒徑3 μm 珍珠粉：Q=0.0089t+0.2506（n=6，r=0.8840），經(jīng)皮滲透速率為0.0089 mg·cm-2·h-1。平均粒徑10 μm 珍珠粉：Q=0.001t+0.2118（n=6，r=0.3734），經(jīng)皮滲透速率為0.001 mg·cm-2·h-1。

圖5 不同粒徑珍珠粉中碳酸鈣經(jīng)皮累積滲透量曲線

不同粒徑珍珠粉在不同時(shí)間透皮鈣含量如圖6所示，0.3μm 珍珠粉24h 碳酸鈣的累積滲透量為（0.382±0.118）mg·cm-2；3μm 珍珠粉24h 碳酸鈣的累積滲透量為（0.433±0.198）mg·cm-2；10 μm 珍珠粉24 h 碳酸鈣的累積滲透量為（0.244±0.226）mg·cm-2。0.3 μm 珍珠粉經(jīng)皮滲透速率為0.0055 mg·cm-2·h-1；3 μm 珍珠粉經(jīng)皮滲透速率為0.0089 mg·cm-2·h-1；10 μm 珍珠粉經(jīng)皮滲透速率為0.001 mg·cm-2·h-1。

圖6 不同粒徑珍珠粉在不同時(shí)間透皮鈣含量

三種不同粒徑珍珠粉中碳酸鈣經(jīng)皮滲透速率及24 h 皮膚滲透累積量的大小為：3 μm＞0.3 μm＞10 μm。

3 結(jié)論與討論

三種珍珠粉中主要成分為文石型碳酸鈣，是一種生物活性鈣。此外，珍珠粉還有少量有機(jī)質(zhì)（蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、類(lèi)胡蘿卜素和牛磺酸等活性成分），碳酸鈣與有機(jī)質(zhì)結(jié)合成在一起。隨著碳酸鈣的經(jīng)皮滲透，有機(jī)質(zhì)也經(jīng)皮滲透進(jìn)入皮下組織，產(chǎn)生功效性作用。三種不同粒徑珍珠粉中活性成分經(jīng)皮滲透速率及24 h 皮膚滲透累積量的大小為：3 μm＞0.3 μm＞10 μm。3 μm 粒徑珍珠粉透皮吸收效果最好，主要原因?yàn)榱椒植季鶆颉⒘酱笮『线m。

珍珠層一般是由碳酸鈣晶質(zhì)薄層與有機(jī)質(zhì)的薄層交替累積而成。碳酸鈣單晶長(zhǎng)3～5 μm，寬2～3 μm，厚0.2～0.5μm，為不規(guī)則多邊形的扁平平板狀，由有機(jī)質(zhì)粘結(jié)，有機(jī)質(zhì)厚約0.1～0.3μm 。整個(gè)珍珠層結(jié)構(gòu)好像“磚墻”結(jié)構(gòu)，由一層的“磚塊”（碳酸鈣）加上一層“泥灰”（有機(jī)質(zhì)）經(jīng)重疊為上千層累積而成[20-21]。采用現(xiàn)代加工工藝，盡可能將碳酸鈣晶體與有機(jī)質(zhì)完全解離，使得珍珠有效成分能直接、快速和均勻地被皮膚吸收利用，是珍珠化妝品開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)和方向[22]。

為了提高珍珠粉的吸收效率，在粉狀珍珠面膜中可加入適量熟石膏，熟石膏溶于水時(shí)可釋放熱量，使皮膚溫度微微升高，促進(jìn)血液循環(huán)，促進(jìn)皮膚對(duì)有效成分的吸收；在膏狀珍珠面膜中可加入適量成膜物質(zhì)，在產(chǎn)品使用過(guò)程中使皮膚與外界空氣隔絕，皮膚溫度會(huì)上升，膏狀面膜中珍珠的營(yíng)養(yǎng)活性成分會(huì)更快地滲進(jìn)皮膚內(nèi)層，促進(jìn)表皮組織細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)、分裂，重組皮膚內(nèi)層，促進(jìn)皮膚新陳代謝，起到明顯的護(hù)膚作用[23]。

添加促進(jìn)劑有利于珍珠粉的透皮吸收。皮膚角質(zhì)層作為一種生物屏障限制了很多營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)的經(jīng)皮滲透，因此采用有效的方法促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)經(jīng)皮滲透成為技術(shù)關(guān)鍵。聚合物納米粒因具有藥物包封率高、減小酶降解、可控釋性能好、比表面積大等優(yōu)勢(shì)，易于在皮膚表面富集，從而促進(jìn)活性物質(zhì)滲透和功效顯現(xiàn)；此外，珍珠粉與氧化鋅等粉末混合，發(fā)揮聯(lián)合協(xié)同作用，可以有效治療皮膚病，已成為近幾年的研究熱點(diǎn)[24-25]，應(yīng)引起珍珠化妝品和醫(yī)藥行業(yè)的高度重視。

化妝品的功效越來(lái)越受到消費(fèi)者重視，而化妝品是否能透皮吸收是其發(fā)揮真正功效的前提。大多數(shù)情況下珍珠粉在使用時(shí)會(huì)與水混合或者添加到乳液、膏霜中，很少單獨(dú)使用，珍珠美白、保濕和延緩衰老等護(hù)膚功效成分的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，需要建立在透皮吸收的基礎(chǔ)上，擴(kuò)散池法是目前最常用的檢測(cè)化妝品成分透皮吸收的體外方法[26]。本研究采用擴(kuò)散池法比較不同粒徑的珍珠粉透皮吸收效果，使用小鼠離體無(wú)毛皮膚在體外進(jìn)行，是在一定的實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件下得出的結(jié)論，對(duì)珍珠粉的加工與應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。實(shí)際上，人體皮膚是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)的有機(jī)系統(tǒng)，不同個(gè)體存在差異性，而且影響吸收效果的皮膚因素很多，如年齡、性別、皮膚部位、溫度和完整性、角質(zhì)層含水量等等。本研究沒(méi)有深入涉及珍珠粉的透皮吸收機(jī)理，不同粒徑的珍珠粉末溶于水后的物理和化學(xué)性質(zhì)的變化是否一致，CaCO3是否已經(jīng)發(fā)生了同樣的電離反應(yīng)，尚有待今后加強(qiáng)研究。