張 昭, 姚志鳳, 王 鵬, 蘇寶峰, 劉 斌,宋懷波, 何東健*, 徐 炎, 胡靜波

1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100 2. 寶雞文理學(xué)院電子電氣工程學(xué)院，陜西 寶雞 721016 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100 4. 陜西省農(nóng)業(yè)信息感知與智能服務(wù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100 5. 西北農(nóng)林科技大學(xué)信息工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100 6. 西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100 7. 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100

引 言

葡萄霜霉病是葡萄霜霉菌(plasmopara viticola, PV)引起的真菌病害，該病侵染能力強(qiáng)，擴(kuò)展速度快，盡早防治是關(guān)鍵。 若能在潛伏期實(shí)現(xiàn)霜霉病侵染的早期檢測(cè)，就能及早制定防治方案，阻斷霜霉病的蔓延和流行，保證葡萄的品質(zhì)和產(chǎn)量。 然而在沒(méi)有病癥的霜霉病潛伏期，田間觀察無(wú)法判斷霜霉病侵染，近年來(lái)興起的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)可通過(guò)DNA定量擴(kuò)增技術(shù)準(zhǔn)確確定病原菌，并通過(guò)檢測(cè)病原菌相對(duì)生物量判斷侵染程度，但PCR技術(shù)制備樣本耗時(shí)費(fèi)力，必須在實(shí)驗(yàn)室完成，無(wú)法在田間實(shí)現(xiàn)霜霉病癥前快速無(wú)損檢測(cè)。 作為一種無(wú)損檢測(cè)的新技術(shù)，脈沖調(diào)制葉綠素?zé)晒?pulse amplitude-modulated chlorophyll fluorescence，PAM-ChlF)成像技術(shù)在植物病害早期檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛[1-2]。 Cen等[3]用PAM-ChlF成像技術(shù)揭示了柑橘黃龍病的光合指紋，綜合熒光圖像和參數(shù)特征的SVM模型對(duì)健康、黃龍病侵染和營(yíng)養(yǎng)缺乏葉片檢測(cè)準(zhǔn)確率為97.00%。 Tung等[4]利用PAM-ChlF成像技術(shù)對(duì)接種炭疽病菌的本氏煙葉片侵染程度進(jìn)行了量化分析，發(fā)現(xiàn)在接種96 h用Fv/Fm圖像量化的病變面積與顯癥后的病斑數(shù)量存在顯著的線性關(guān)系。 上述研究表明，PAM-ChlF成像技術(shù)能夠?qū)Χ喾N植物病害進(jìn)行有效檢測(cè)，但現(xiàn)有研究多用單一參數(shù)和圖像進(jìn)行分析，缺乏從霜霉病侵入到顯癥連續(xù)多天的葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)，尚未建立綜合各個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)，能準(zhǔn)確進(jìn)行霜霉病早期檢測(cè)的方法和模型。

為了提供一種葡萄霜霉病癥前早期檢測(cè)的方法和技術(shù)，采用PAM-ChlF成像技術(shù)，從暗適應(yīng)—光適應(yīng)—暗弛豫3個(gè)光合生理狀態(tài)連續(xù)變化過(guò)程中，研究霜霉病侵染對(duì)葉片光合作用的影響，分析接種和健康葉片正面的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線和圖像特征，考察從接種到顯癥連續(xù)6 d葉綠素?zé)晒鈪?shù)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，尋找對(duì)霜霉病侵染敏感的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，探索有效識(shí)別健康與侵染霜霉病葉片的模型與方法，以期為葡萄霜霉病病光合表型分析和早期檢測(cè)提供一種快速、準(zhǔn)確的手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

以葡萄葉片為研究對(duì)象進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)檢測(cè)霜霉病實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)分為供試葉片的制備、葉綠素?zé)晒獬上窈蚉CR檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析與建模3個(gè)階段(圖1)。 首先制備供試葉片，將休眠期葡萄幼苗移植于花盆中，并在溫室中培養(yǎng)，待霜霉病在田間發(fā)病后，進(jìn)行霜霉菌離體接種和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；之后連續(xù)6 d每天進(jìn)行葉片正面葉綠素?zé)晒鈭D像采集和霜霉病PCR檢測(cè)；最后對(duì)獲取的接種和健康葉片數(shù)據(jù)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線、圖像和參數(shù)變化分析，應(yīng)用特征選擇算法篩選出葉綠素?zé)晒鈪?shù)最優(yōu)特征子集，輸入分類器建立霜霉病早期檢測(cè)模型并驗(yàn)證模型的識(shí)別效果。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 Flow chart of the experiment

1.1 供試葉片的制備

2020年1月，將全球種植面積最大的葡萄品種 “赤霞珠”一年生幼苗移植于花盆中，在溫室中培養(yǎng)。 7月摘取新發(fā)枝條6～8節(jié)上完全展開的健康葉片，清洗消毒后置于用濾紙保濕的培養(yǎng)皿中；按照霜霉病離體接種方法，接種前一天將田間發(fā)病的霜霉病葉片采下帶回實(shí)驗(yàn)室清洗后保濕24 h，用潔凈毛筆刷下葉片背面重新長(zhǎng)出的新鮮霉層于無(wú)菌水中，離心富集后，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制成105個(gè)孢子囊·mL-1的孢子囊懸浮液；將配制好的孢子懸浮液均勻噴施于需要接種的健康葉片背面，相同數(shù)量的健康葉片噴等量無(wú)菌水作為對(duì)照。 將盛有葉片的培養(yǎng)皿封口后放入溫度18℃、相對(duì)濕度84%、照度為12 000 lux的光照培養(yǎng)箱(RXZ型，寧波江南儀器廠)中，進(jìn)行16 h光照、8 h黑暗光照控制培養(yǎng)。

接種后葉片發(fā)病情況如圖2所示，健康葉片在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)保持鮮綠[圖2(a)]。 1～5 DPI葉片上無(wú)任何癥狀，直到6 DPI接種葉片背面均出現(xiàn)不同程度的白色霜霉層，部分葉片背面區(qū)域有病癥[圖2(b)]，部分葉片背面布滿了霜霉層[圖2(c)]。

圖2 接種后第6天的健康葉片和接種葉片(a)： 健康葉片；(b)： 區(qū)域發(fā)?。?c)： 全葉片發(fā)病Fig.2 Healthy leaves and inoculated leaveswith disease spots at 6 DPI(a)： Heathy leaf；(b)： Leaf with scattered lesions； (c)： Leaf covered with lesions

1.2 葉綠素?zé)晒鈭D像采集和PCR檢測(cè)

1.2.1 葉綠素?zé)晒鈭D像采集

葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)采集從接種后第1天(1 DPI)開始，用圖3所示FluorCam FC 800開放式熒光成像系統(tǒng)，連續(xù)6 d每天獲取葡萄葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像和動(dòng)力學(xué)曲線。 FluorCam FC 800系統(tǒng)主要由CCD相機(jī)(分辨率696 px×520 px)、鏡頭(SV-0614H，VS Technology)、4個(gè)LED 光源板(2個(gè)紅色(620 nm)和2個(gè)藍(lán)色(450 nm)LED面板，對(duì)稱布置，分別與載物臺(tái)成45°)、控制器、計(jì)算機(jī)、載物臺(tái)和軟件系統(tǒng)(Fluocam7.0)等組成，成像面積為20 cm×20 cm。 為消除外部光線干擾，成像背景用黑布遮蓋。

圖3 葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)Fig.3 Chlorophyll fluorescence imaging system

葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)的光源包括測(cè)量光、光化光和飽和光(圖4)。 測(cè)量光是為測(cè)量葉片熒光強(qiáng)度而經(jīng)過(guò)頻率調(diào)制的光脈沖，本研究采用波長(zhǎng)620 nm，強(qiáng)度0.02 μEinsteins·m-2·s-1，脈沖寬度10 μs橙紅色光脈沖為測(cè)量光，系統(tǒng)獲取與測(cè)量光同頻的熒光。 光化光是葉片進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)的光源，選用波長(zhǎng)620 nm，強(qiáng)度206 μEinsteins·m-2·s-1的穩(wěn)定光源作為光化光，持續(xù)照射70 s。 飽和光使用波長(zhǎng)450 nm，脈寬800 ms，強(qiáng)度為2 806 μEinsteins·m-2·s-1的藍(lán)色光脈，暫時(shí)抑制葉片光合作用，使葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度達(dá)到最大。

測(cè)量程序控制激發(fā)光源照射葉片產(chǎn)生葉綠素?zé)晒?，在葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度動(dòng)態(tài)變化的不同時(shí)刻，利用高靈敏度的CCD快速進(jìn)行圖像采集。 圖像采集前，首先對(duì)葉片進(jìn)行20 min暗適應(yīng)，以使光合器官回到初始狀態(tài)。 采集時(shí)，調(diào)節(jié)升降臺(tái)使鏡頭和葉片間的距離保持在22 cm，用吸水紙吸去葉片表面水分，依次將健康和接種葉片放在載物臺(tái)上，每次3個(gè)葉片同時(shí)采集[圖2(c)]。 葉綠素?zé)晒鈭D像采集耗時(shí)192 s，包括暗適應(yīng)(約0～22 s)、光適應(yīng)(23～92 s)和暗馳豫(93～192 s)三個(gè)連續(xù)的光合生理狀態(tài)(圖4)。

圖4 葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量步驟Fig.4 Chlorophyll fluorescence measurement procedure

每天采集葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)，觀察并用手機(jī)拍攝記錄葉片發(fā)病狀況，之后將葉片放回培養(yǎng)皿，噴無(wú)菌水保濕，封口膠纏繞后繼續(xù)培養(yǎng)，直到6 DPI葉片背面出現(xiàn)霜霉層。

1.2.2 葡萄霜霉病PCR檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler 96 System，Roche)測(cè)定葉片是否受到葡萄霜霉菌的侵染及侵染程度，研究參考Lei等[5]方法，以葡萄霜霉菌的相對(duì)生物量為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 分別在1～6 DPI每天對(duì)健康和接種葉片取樣，液氮速凍后存放于-80 ℃超低溫冰箱備用。 根據(jù)文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)引物如表1所示，由楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司合成。 用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305，北京天根生化科技)提取樣品的總DNA并將濃度調(diào)整至50 ng·mL-1，分別以葡萄霜霉菌PvActin及葡萄VvActin為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，用2-△△CT法計(jì)算葡萄霜霉菌的相對(duì)生物量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Real time fluorescent quantitative PCR primers

1.3 數(shù)據(jù)分析與建模

1.3.1 數(shù)據(jù)分析方法

實(shí)驗(yàn)共獲取160個(gè)供試葉片(健康和接種各80個(gè))連續(xù)6 d(1DPI～6DPI)的葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)，包括葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線、98個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像和參數(shù)值。 98個(gè)參數(shù)中有19個(gè)參數(shù)是葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)直接采集獲得的基礎(chǔ)熒光參數(shù)，其余79個(gè)參數(shù)是2～5個(gè)基礎(chǔ)熒光參數(shù)通過(guò)相應(yīng)公式運(yùn)算得到的，其中植物脅迫檢測(cè)常用葉綠素?zé)晒鈪?shù)如表2所示。

表2 植物脅迫檢測(cè)常用熒光參數(shù)Table 2 Fluorescence parameters commonly usedin detection of plant stress

首先通過(guò)PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)和霜霉病顯癥后的葉片RGB圖像，對(duì)霜霉病的侵染程度和接種效果進(jìn)行判斷。 之后對(duì)比健康和接種葉片葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線和圖像，探明出現(xiàn)差異的時(shí)間和大小。 為揭示從接種到顯癥葉綠素?zé)晒鈪?shù)連續(xù)6 d的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，對(duì)每個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)，分別計(jì)算健康和接種葉片在不同DPI的均值和方差，并通過(guò)單因素方差分析計(jì)算健康和接種葉片在各個(gè)熒光參數(shù)下的差異顯著水平，探究各個(gè)熒光參數(shù)對(duì)霜霉病侵染的敏感性。

1.3.2 霜霉病早期檢測(cè)模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

在數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上建立霜霉病早期檢測(cè)模型。 獲取的98個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)，采用序列浮動(dòng)前項(xiàng)選擇(sequential floating forward selection，SFFS)算法[7]作為特征選擇策略進(jìn)行特征子集優(yōu)選，并以Relief算法為對(duì)照，其中SFFS算法分為4個(gè)步驟(圖5)：

第1步： 輸入全體特征數(shù)據(jù)，并初始化變量。

第2步： 添加特征h+。

第3步： 刪除特征h-。

第4步： 輸出。 重復(fù)進(jìn)行添加和刪除特征操作，當(dāng)達(dá)到最大搜索次數(shù)(m=M)時(shí)，輸出評(píng)估函數(shù)(Bayes)交叉驗(yàn)證平均準(zhǔn)確率最高時(shí)的最優(yōu)特征子集Zm*。

如圖5所示，篩選出的最優(yōu)特征子集分別輸入邏輯回歸(logic regression，LR)、線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類器進(jìn)行霜霉病檢測(cè)機(jī)器學(xué)習(xí)模型的訓(xùn)練，10折交叉驗(yàn)證的平均準(zhǔn)確率作為特征子集和分類器選擇的依據(jù)。 將篩選的最優(yōu)特征子集數(shù)據(jù)輸入到訓(xùn)練后的霜霉病早期檢測(cè)模型進(jìn)行不同DPI的健康和接種葉片的識(shí)別，對(duì)模型識(shí)別效果進(jìn)行驗(yàn)證。

圖5 特征選擇(SFFS)和模型構(gòu)建流程圖Fig.5 Flow chart of feature selection algorithm (SFFS) and model construction

以上數(shù)據(jù)分析、特征選取算法和模型的實(shí)現(xiàn)均在MATLAB R2017b 環(huán)境下完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄霜霉病PCR檢測(cè)結(jié)果分析

為了對(duì)葉片內(nèi)部霜霉病侵染狀況進(jìn)行評(píng)估，對(duì)接種后健康和接種葉片連續(xù)6 d的樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)。 如圖6所示，健康葉片的霜霉菌相對(duì)生物量從1～6DPI始終為0，證明供試健康葉片未受到霜霉菌的侵染。 接種霜霉菌葉片其相對(duì)生物量1～3DPI緩慢增加，4～6DPI快速升高，1DPI為1.00，6DPI達(dá)到6.70，表明在肉眼不可見(jiàn)的潛育期霜霉病的侵染在持續(xù)加劇。 霜霉菌孢子接種到葉片表面，在水的作用下通過(guò)氣孔侵入，并逐漸在葉肉組織內(nèi)生長(zhǎng)，侵染初期霜霉菌侵染產(chǎn)生的核酸物質(zhì)累積較少，相對(duì)生物量增長(zhǎng)緩慢(1～3DPI)，隨著霜霉菌在葉片內(nèi)部擴(kuò)展定殖，侵染程度不斷加深，孢囊梗從氣孔伸出，迅速繁殖，引起相對(duì)生物量急劇升高(4～6DPI)。 樣本方差從1DPI的0.10增加到6DPI的0.87，表明不同葉片及葉片上不同位置的侵染程度差異大。

圖6 健康和接種樣本連續(xù)6 d PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線對(duì)霜霉病侵染的響應(yīng)分析

葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線是在測(cè)量程序控制下葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度隨時(shí)間的變化，是直接測(cè)量獲得的基礎(chǔ)熒光數(shù)據(jù)，可以用來(lái)檢測(cè)脅迫。 典型的健康和接種葉片葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線如圖7所示，綠色線表示健康葉片，紅色線表示接種葉片。 1 DPI[圖7(a)]健康和接種樣本曲線基本重合，從2DPI開始在光適應(yīng)階段(23～92 s)接種葉片熒光強(qiáng)度高于健康葉片[圖7(b)]，6DPI差異繼續(xù)變大[圖7(c)]。 接種葉片健康和接種葉片光適應(yīng)狀態(tài)下葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的顯著差異表明葉片光合作用因?yàn)樗共〉那秩咀兓黠@，接種葉片的熒光淬滅速率大于健康葉片。

2.3 葉綠素?zé)晒鈭D像對(duì)霜霉病侵染的響應(yīng)分析

對(duì)比1DPI，2DPI和6DPI(顯癥當(dāng)天)的葉正面葉綠素?zé)晒鈭D像和葉片背面的RGB圖像，為方便觀察，將葉正面葉綠素?zé)晒鈭D像以中間主葉脈為軸進(jìn)行了左右鏡像，如圖8所示。 1～2DPI葉片RGB圖像上沒(méi)任何病癥，1DPI葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像均勻一致，2DPI該葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像空間異質(zhì)明顯，橙黃色高亮區(qū)域(Ft-L4圖像)和深藍(lán)色低暗區(qū)域(qN-L3和Rfd-L2圖像)與6DPI 的RGB圖像中病斑(白色霜霉層)的數(shù)量、位置、大小和形狀高度一致，熒光參數(shù)圖像中病斑位置顏色深淺與RGB圖像中發(fā)病部位霜霉層的密集程度與十分匹配，表明葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像時(shí)空異質(zhì)是霜霉病侵染引起的，qN-L3，Rfd-L2，F(xiàn)t-L4對(duì)霜霉病早期侵染敏感，在接種后2 d(顯癥前4 d)能從葉片正面檢測(cè)到霜霉病的侵染，比文獻(xiàn)[8]用高光譜成像技術(shù)在顯癥前1～2 d發(fā)現(xiàn)光譜顯著差異提前了2～3 d。 同樣NPQ，F(xiàn)m，F(xiàn)v/Fm等參數(shù)圖像也因霜霉病侵染體現(xiàn)出隨時(shí)空變化的異質(zhì)性。 但F0和Fp等參數(shù)圖像接種前后沒(méi)有顯著變化，對(duì)霜霉病早期侵染不敏感。

圖7 健康和接種葉片的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線(a)： 1 DPI；(b)： 2 DPI；(c)： 6 DPIFig.7 Representative kinetic chlorophyll fluorescencecurves of healthy and inoculated leaves(a)： 1 DPI；(b)： 2 DPI；(c)： 6 DPI

圖8 接種霜霉病葉片RGB圖像和葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像

2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)霜霉病侵染的響應(yīng)分析

為了研究不同葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)霜霉病侵染的響應(yīng)，在圖像分析基礎(chǔ)上，以葉片為感興趣區(qū)域，計(jì)算各個(gè)熒光參數(shù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，對(duì)比健康和接種葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)均值隨DPI的變化，并對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)逐一進(jìn)行單因素方差分析。 如圖9所示，健康葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)隨DPI變化較小，而接種葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)隨DPI變化較大，其中qN，NPQ，Rfd，F(xiàn)v/Fm等參數(shù)值隨著DPI增加而逐漸下降，從2DPI開始顯著低于健康葉片；Ft和Fm等參數(shù)值隨著DPI增加不斷升高，從2DPI開始顯著高于健康葉片。 如圖9(a)所示接種葉片qN-L3在2DPI較健康葉片顯著下降(p<0.01)，為(0.38±0.13)，6DPI繼續(xù)下降到(0.31±0.15)，與健康葉片差距持續(xù)變大(p<0.001)。 與qN-L3變化趨勢(shì)相反，接種葉片F(xiàn)t-L4從1DPI的(400±67)持續(xù)增加到6DPI的(603±116)，從2DPI開始顯著高于健康葉片(p<0.01)[圖9(b)]。Rfd-L2與qN-L3有著相同變化趨勢(shì)[圖9(c)]，F(xiàn)0數(shù)值在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期波動(dòng)很小，在1DPI～5DPI健康和接種葉片無(wú)顯著差異[圖9(d)]，直到6DPI健康葉片F(xiàn)0數(shù)值顯著高于接種配片(p<0.05)。

圖9 接種和健康葉片連續(xù)6 d的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化 顯著性： *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001

*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的上述變化是因?yàn)樗共【那秩咀璧K了葡萄葉片光合器官功能的正常發(fā)揮，隨著DPI增加，葉片光合作用減弱，光化學(xué)猝滅速率減小(Rfd變小)，光合效率不斷降低(Fv/Fm變小)，葉片活力和光保護(hù)能力持續(xù)衰退(NPQ和qN變小)，葉片吸收的光能更多以熒光的形式釋放出來(lái)(Ft和Fm變大)。 不同熒光參數(shù)值隨時(shí)間的變化從光能的吸收、傳遞、耗散和分配等不同方面反映了霜霉病對(duì)光合作用的影響，表明霜霉病侵染程度隨DPI增加在不斷加深。

2.5 霜霉病早期檢測(cè)模型的建立與驗(yàn)證

上述分析表明，F(xiàn)o和Fp等參數(shù)對(duì)霜霉病侵染不敏感，同時(shí)NPQ-L3，Rfd-L3和qN-L3(r>0.85，p<0.01)等參數(shù)對(duì)霜霉病檢測(cè)的貢獻(xiàn)相似，因此，分別用SFFS和Relief算法作為特征選擇策略獲取最優(yōu)特征子集，并輸入LR，LDA和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類器建立霜霉病早期檢測(cè)模型。 數(shù)據(jù)集為160個(gè)葡萄葉片(80片接種，80片健康對(duì)照)連續(xù)6 d的98個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)值，分類器參數(shù)選擇準(zhǔn)確率最高的參數(shù)組合，使用交叉驗(yàn)證的分類器平均準(zhǔn)確率進(jìn)行模型評(píng)估。 其中BP網(wǎng)絡(luò)為單隱層結(jié)構(gòu)，采用L-M訓(xùn)練算法，傳輸函數(shù)輸入層到隱層選用Tansig函數(shù)，隱層到輸出層為Sigmoid函數(shù)。 結(jié)果如表3所示，SFFS最優(yōu)特征子集在3種分類模型中的準(zhǔn)確率均高于Relief特征子集，Relief算法雖然運(yùn)行效率高，搜索速度快，但算法穩(wěn)定性差，容易陷入局部最優(yōu)。 SFFS算法穩(wěn)定性好，多次運(yùn)行最優(yōu)特征子集均為qN-L3，Rfd-L2，NPQ-L1和Fv/Fm-D1，此4個(gè)特征屬于表2中的脅迫檢測(cè)常用葉綠素?zé)晒鈪?shù)，也是葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像分析和參數(shù)方差分析中均對(duì)霜霉病侵染敏感的參數(shù)。 對(duì)比不同分類器的識(shí)別效果，BP分類器在SFFS、Relief最優(yōu)特征子集的準(zhǔn)確率分別為85.94%和81.40%，均高于LDA(83.57%，78.22%)和LR(80.95%，75.43%)。 在特征選擇策略與分類器組合中，基于SFFS最優(yōu)特征子集和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類器的SFFS-BP模型具有最高的識(shí)別準(zhǔn)確率。

表3 基于SFFS和Relief葉綠素?zé)晒庾顑?yōu)特征子集的三個(gè)分類器識(shí)別結(jié)果

表4 基于SFFS-BP模型不同DPI健康和接種葉片識(shí)別結(jié)果

訓(xùn)練后的SFFS-BP模型對(duì)1～6DPI的健康和接種葉片進(jìn)行識(shí)別，結(jié)果如表4所示。 隨著接種天數(shù)增加，分類準(zhǔn)確率逐漸升高，從1DPI的69.38%，增加到3DPI的83.75%，6DPI時(shí)達(dá)到98.75%，全實(shí)驗(yàn)周期連續(xù)6 d的準(zhǔn)確率為85.94%，成功實(shí)現(xiàn)了霜霉病的早期檢測(cè)。 本方法比文獻(xiàn)[9]使用多光譜熒光技術(shù)從葉片背面檢測(cè)葡萄霜霉病方法1DPI、3DPI和全實(shí)驗(yàn)周期的準(zhǔn)確率分別提高了3.78%，3.30%和1.34%，而且采用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)從葉片正面檢測(cè)霜霉病侵染比從葉片背面檢測(cè)更方便實(shí)用。 通過(guò)識(shí)別結(jié)果可以看出，識(shí)別錯(cuò)誤的樣本中，將接種葉片誤識(shí)別為健康樣本的數(shù)量遠(yuǎn)大于將健康樣本誤識(shí)別為接種樣本，這是由于在霜霉病培養(yǎng)過(guò)程中，葉片侵染程度不同，其中有的接種葉片發(fā)病輕微，葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像和參數(shù)值與健康葉片沒(méi)有顯著差異，容易造成識(shí)別錯(cuò)誤。

3 結(jié) 論

以接種和健康對(duì)照葡萄葉片為研究對(duì)象，以實(shí)現(xiàn)葡萄霜霉病早期檢測(cè)為目標(biāo)，PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)作為霜霉病侵染的依據(jù)，驗(yàn)證了PAM-ChlF成像技術(shù)進(jìn)行霜霉病早期檢測(cè)的可行性。 從暗適應(yīng)到光適應(yīng)再到暗豫馳3個(gè)光合生理狀態(tài)連續(xù)變化過(guò)程中，得到健康和接種葡萄葉片連續(xù)6 d的98個(gè)熒光參數(shù)圖像，通過(guò)數(shù)據(jù)分析和研究發(fā)現(xiàn)：

(1)PCR檢測(cè)結(jié)果表明，接葉片侵染程度在不斷加深，在2DPI，葉綠素?zé)晒鈭D像能從葉片正面檢測(cè)到侵染，病斑區(qū)域出現(xiàn)時(shí)空異質(zhì)，健康和接種葉片參數(shù)均值差異顯著(p<0.05)。

(2)隨著接種天數(shù)增加，霜霉病侵染導(dǎo)致接種葉片光化學(xué)淬滅速率減小(Rfd變小)，光合效率降低(Fv/Fm變小)，葉片活力和光保護(hù)能力衰退(NPQ和qN變小)，葉片吸收的光能更多以熒光的形式釋放出來(lái)(Ft和Fm變大)。

(3)基于特征選擇算法(SFFS和Relief)和機(jī)器學(xué)習(xí)分類器(LR，LDA和BP)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)早期檢測(cè)模型成功實(shí)現(xiàn)了霜霉病的早期檢測(cè)，其中基于SFFS算法優(yōu)選的特征子集(qN-L3，Rfd-L2，NPQ-L1和Fv/Fm-D1)和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類器的SFFS-BP模型對(duì)3DPI健康和接種葉片識(shí)別準(zhǔn)確率為83.75%，全實(shí)驗(yàn)周期連續(xù)6 d平均準(zhǔn)確率達(dá)到85.94%。