蔣 萌，付尚譚，王曉峰

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊陵 712100)

近年來隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，基因編輯技術(shù)基于其高效、可控、定向編輯的特點(diǎn)在植物學(xué)和農(nóng)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)利用序列特異識別的核酸酶(sequence-specific nucleases，SSNs)使特定位點(diǎn)的DNA雙鏈發(fā)生斷裂，從而啟動兩種高度保守的自身修復(fù)機(jī)制，即非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重組修復(fù)(homologous directed repair，HDR)。真核生物中DNA雙鏈斷裂(double strand break，DSBs)的修復(fù)多為NHEJ的方法，即通過DNA連接酶直接連接DSBs末端，但相比于需要同源序列模板的HDR，精確度更低[1]?；蚓庉嫾夹g(shù)主要有3種類型，即鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)技術(shù)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)技術(shù)及規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列及其關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas)。與CRISPR/Cas相比，ZFNs和TALENs在編輯效率、穩(wěn)定性、成本及復(fù)雜程度上都有其無法克服的缺點(diǎn)。

CRISPR/Cas技術(shù)2013年開始應(yīng)用于植物基因組編輯，加速了人們對植物基因組中特定DNA序列定向編輯的步伐，被Science雜志評為十大科學(xué)突破之一[2]。其中應(yīng)用最為廣泛的是CRISPR/Cas9系統(tǒng)，目前已經(jīng)在水稻、玉米、小麥等多種作物中得到應(yīng)用[3-6]。

番茄(Solanumlycopersicum)是中國及世界上最主要的蔬菜之一，其生命周期較短，遺傳簡單，具備成熟的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。自2014年CRISPR/Cas9首次應(yīng)用于番茄基因編輯后，在基因功能研究和種質(zhì)資源創(chuàng)新領(lǐng)域得到了大量的應(yīng)用[7]，但編輯效率低等問題依然限制了其進(jìn)一步發(fā)展。本綜述將總結(jié)近幾年CRISPR/Cas9技術(shù)在番茄中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并討論該技術(shù)在番茄中應(yīng)用的前景及面臨的問題。

1 CRISPR技術(shù)簡介

近年來，CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于多種生物體的基因編輯，以對基因功能進(jìn)行基礎(chǔ)研究和創(chuàng)建動植物育種的新材料。從1987年在堿性磷酸酶同工酶基因中發(fā)現(xiàn)CRISPR序列后[8]，經(jīng)過不斷地探索和改進(jìn)，最終將CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)應(yīng)用于編輯目標(biāo)基因。根據(jù)Cas基因的數(shù)量和功能之間的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為兩類，第一類是需要多種蛋白的Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型系統(tǒng)，第二類是僅需單一蛋白即可編輯雙鏈的Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型CRISPR/Cas系統(tǒng)[9]。目前應(yīng)用最為廣泛的是來自Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要由crRNA(CRISPR RNA)與tracrRNA(trans-activating crRNA)結(jié)合后形成雙鏈二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行Cas9蛋白的招募，共同形成活性核糖核蛋白(ribonucleoproteins，RNPs)復(fù)合體并識別PAM(protospacer adjacent motif)區(qū)，隨后Cas9蛋白發(fā)揮其DNA核酸內(nèi)切酶的活性，進(jìn)行DNA雙鏈的切割，由此產(chǎn)生DSB觸發(fā)DNA修復(fù)機(jī)制。CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)應(yīng)用的核心是構(gòu)建Cas9/sgRNA表達(dá)載體，將載體導(dǎo)入受體細(xì)胞并發(fā)揮編輯作用[10]，用于植物的Cas9核酸酶主要由35S啟動子或組織特異性啟動子等強(qiáng)啟動子驅(qū)動，而sgRNA一般由聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄的U6啟動子驅(qū)動，多重靶點(diǎn)編輯一般通過串聯(lián)sgRNA連接至相應(yīng)載體中表達(dá)[11-12]。隨后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌葉片注射法等方式導(dǎo)入受體細(xì)胞。

2013年，Science雜志報(bào)道了CRISPR/Cas9在小鼠等動物中的應(yīng)用[13]，同年NatureBiotechnology雜志報(bào)道了在水稻、模式植物本氏煙草和擬南芥中的基因定點(diǎn)編輯[14-15]，并于2014年首次應(yīng)用于番茄基因編輯[7]。目前，CRISPR/Cas9的應(yīng)用主要集中在生物和非生物脅迫響應(yīng)以及性狀改良等方面，通過編輯編碼序列位點(diǎn)產(chǎn)生無效等位基因突變體，最終應(yīng)用于改良作物品種。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在番茄中的應(yīng)用現(xiàn)狀

CRISPR/Cas9技術(shù)近幾年在番茄中的應(yīng)用主要為農(nóng)藝性狀改良及抗逆、抗病基因功能研究，表1中列舉了這三方面的應(yīng)用。

表1 CRISPR/Cas9在番茄中的應(yīng)用

2.1 CRISPR/Cas9在番茄農(nóng)藝性狀改良中的應(yīng)用現(xiàn)狀

番茄傳統(tǒng)育種需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力將優(yōu)良性狀賦于目標(biāo)品系，還會連鎖引入一些不需要的不良性狀，而CRISPR/Cas9技術(shù)能夠快速精準(zhǔn)地創(chuàng)制應(yīng)用于各品系各位點(diǎn)的新種質(zhì)資源[16]。番茄基因組的測序使研究人員能夠利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)精確調(diào)控植株形態(tài)、生長發(fā)育、果實(shí)性狀等農(nóng)藝性狀，從而得到優(yōu)異的番茄種質(zhì)資源。不僅如此，番茄作為一種研究漿果果實(shí)發(fā)育和果實(shí)成熟的模型，其性狀改良對其他作物農(nóng)藝性狀改良也具有參考價(jià)值。

2.1.1 調(diào)控植株形態(tài)葉型影響番茄的植株形態(tài)和光合效率，Brooks等[7]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯番茄SlAGO7基因，導(dǎo)致葉型發(fā)生改變，并發(fā)現(xiàn)突變能夠穩(wěn)定遺傳，首次證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在番茄中的強(qiáng)大功能。株高是作物重要農(nóng)藝性狀，矮化番茄植株較小，適宜盆栽，觀賞價(jià)值高，CRISPR/Cas9編輯赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)因子PROCERA能夠獲得矮化突變體，自交獲得T1代植株，雜合子在苗期表現(xiàn)出野生型和純合子之間的中間表性，意味著突變?yōu)榘腼@性，而發(fā)育后期純合子雜合子矮化程度相同，隨后通過自交獲得了無Cas9構(gòu)建的矮化番茄植株，為番茄優(yōu)良矮化品種的培育提供了先例[17]。

2.1.2 改良果實(shí)性狀果實(shí)作為番茄的經(jīng)濟(jì)器官，其性狀直接影響生產(chǎn)者的經(jīng)濟(jì)效益，其中果實(shí)保質(zhì)期的延長，果實(shí)品質(zhì)及果色的改良對經(jīng)濟(jì)效益影響較大。

續(xù)表1 Continued Table 1

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)被應(yīng)用于研究果實(shí)成熟相關(guān)基因功能，如RIN(ripening inhibitor)[18-19]、RING2[20]、ALC(alcobaca)[21]、ORRM4(organelle RNA recognition motif-containing 4)[22]以及NAM1[23]，敲除突變體果實(shí)延遲成熟，為培育貨架期長的番茄耐貯藏品種提供材料。為了檢測基因在果實(shí)發(fā)育中的特異功能，開發(fā)了果實(shí)特異性的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)以PPC2基因的啟動子驅(qū)動Cas9基因表達(dá)，并結(jié)合GFP檢測系統(tǒng)。使用該系統(tǒng)對植物發(fā)育產(chǎn)生多種影響的EZ2(zeste)基因進(jìn)行編輯，對其在番茄果實(shí)中的功能進(jìn)行探究，檢測到果實(shí)成熟的延遲[24-25]，初步確認(rèn)了果實(shí)特異性編輯的可行性，為番茄果實(shí)相關(guān)基因功能研究建立了新的研究方法。

可溶性糖是番茄果實(shí)品質(zhì)中很重要的一個(gè)性狀，INVINH1(inhibitor of the acid invertase gene)基因特異性抑制細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性，SlVPE5(vacuolar processing enzyme)負(fù)向調(diào)節(jié)糖的積累，均抑制果實(shí)可溶性糖積累。CRISPR/Cas9編輯驗(yàn)證SlINVINH1和SlVPE5功能，結(jié)果表明，比起SlINVINH1和SlVPE5單突變體，雙突變體能進(jìn)一步提高番茄果實(shí)中可溶性糖積累，二者表現(xiàn)為協(xié)同作用，為提高番茄果實(shí)品質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[26]。此外，葉綠素?cái)?shù)量增加能夠通過增強(qiáng)光合作用提高植物的營養(yǎng)品質(zhì)和果實(shí)顏色。Liu等[27]得到了一個(gè)葉綠素減少的突變體，發(fā)現(xiàn)是SlRCM1(reduced chlorophyll mutant 1)基因所導(dǎo)致，該基因的敲除系果實(shí)在綠熟期表現(xiàn)出黃色，為改善果實(shí)品質(zhì)提供了一個(gè)新思路。番茄紅素是決定番茄果實(shí)品質(zhì)的重要因素，SGR1(stay-green1)、LCY-E(lycopene E-cyclase)、BLC(beta-lycopene cyclase)、LCY-B1(lycopene B-cyclase1)、LCY-B2是番茄紅素代謝途徑中的關(guān)鍵基因，設(shè)計(jì)6個(gè)sgRNA并利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行敲除，其中sgr1單突變體的番茄紅素含量增加約5.1倍，多重突變體也不同程度地增加了番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量，在提升果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)方面有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[28]。

隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者對果色的要求也隨之提高，粉果番茄更受中國消費(fèi)者的歡迎。柚皮苷查爾酮(naringenin chalcone，NarCh)缺失造成番茄果實(shí)呈現(xiàn)粉色，對NarCh合成相關(guān)基因SlMYB12(myeloblastosis 12)進(jìn)行編輯得到粉紅果實(shí)突變體，且沒有檢測到突變體主要農(nóng)藝性狀及果實(shí)品質(zhì)的變化，同時(shí)建立了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的粉果番茄快速育種系統(tǒng)，為日后通過基因編輯改良農(nóng)藝性狀提供了一個(gè)很好的實(shí)例[29-30]。八氫番茄紅素合酶(phytoene synthase，PSY)和類胡蘿卜素異構(gòu)酶(carotenoid isomerase，CRITOSO)參與類胡蘿卜素合成途徑，利用CRISPR/Cas9分別敲除紅果番茄的PSY1和CRTISO，獲得了黃色和橙色果實(shí)的突變體[31-32]。

2.1.3 調(diào)節(jié)生長發(fā)育番茄地上部分器官的分化和發(fā)育由莖端干細(xì)胞決定，CLV/WUS(clavata/wuschel)途徑調(diào)控莖端分生組織的增值和分化。CLV3通過抑制WUS的表達(dá)限制干細(xì)胞增殖，SlCLE9(clavata 3/embryo)通過緩沖SlCLV3對干細(xì)胞增值的限制來維持干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，使用CRISPR/Cas9編輯SlCLE9和SlCLV3發(fā)現(xiàn)雙突變體表現(xiàn)出莖粗增大、葉片及分枝增多，并發(fā)現(xiàn)SlCLE9和SlCLV3之間的主動補(bǔ)償效應(yīng)[33]。Hendelman等[34]進(jìn)一步研究WUS相關(guān)基因在發(fā)育中的調(diào)節(jié)功能，利用CRISPR/Cas9創(chuàng)造大量敲除SlWOX8(wuschel-related homeobox 8)和SlWOX9啟動子等位基因的突變體，揭示了該基因在生長發(fā)育方面的多效性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了新花序表型。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的含量與發(fā)育相關(guān)，選擇GABA代謝途徑中的5個(gè)基因進(jìn)行敲除，得到的多個(gè)突變體組合均能夠顯著提高GABA含量，抑制花、葉、果實(shí)的生長發(fā)育，驗(yàn)證了GABA在發(fā)育中的功能，證明了多敲系統(tǒng)的高效性[11]。此外，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteins kinases，MAPKs)在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、分裂等過程發(fā)揮著重要作用，但其在植物發(fā)育過程中的功能還不清楚。利用CRISPR/Cas9徹底敲除SlMPK20，發(fā)現(xiàn)突變體花粉生存能力被抑制，探究了SlMPK20基因在花粉發(fā)育調(diào)控中的作用[35]。MIR(MICRORNA)基因轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)物微小核糖核酸(MicroRNAs，miRNAs)，作用范圍廣泛，調(diào)控植物發(fā)育、生物非生物脅迫等生物過程。CRISPR/Cas9分別編輯miR164a、miR164b和miR164 d，發(fā)現(xiàn)miR164a影響果實(shí)大小硬度等性狀，而miR164b能夠維持花芽正常發(fā)育，并在果實(shí)生長調(diào)控中和miR164a發(fā)生冗余，揭示了miR164在發(fā)育和果實(shí)性狀中的作用[36]。

2.1.4 雄性不育及單性結(jié)實(shí)品種培育番茄雜種優(yōu)勢明顯，但雜交制種需大量人力物力，雄性不育系的創(chuàng)制能夠節(jié)省這部分成本，同時(shí)提高雜交種子純度。Du等[37]鑒定并敲除雄蕊特異基因SlSTR1創(chuàng)建了雄性不育系，并通過自交剔除了T-DNA，同時(shí)創(chuàng)建通過幼苗顏色區(qū)分育性的保持系，建立了基于CRISPR/Cas9的番茄雜交制種系統(tǒng)。最近我們團(tuán)隊(duì)使用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向育性基因MS1035(male sterile)及其連鎖的標(biāo)記基因創(chuàng)建了具有綠色下胚軸標(biāo)記或下胚軸多毛表型的雄性不育系。創(chuàng)制的不育系能夠通過可視化標(biāo)記在苗期區(qū)分出不育植株，且應(yīng)用于雜交制種后能夠獲得高純度雜交種，推動了CRISPR/Cas9在創(chuàng)制番茄雄性不育系及生產(chǎn)雜交種子中的應(yīng)用[38]。近期研究發(fā)現(xiàn)，GDP-l-半乳糖磷酸化酶(GDP-l-galactose phosphorylase，GGP)調(diào)控抗壞血酸含量，CRISPR/Cas9誘導(dǎo)GGP突變導(dǎo)致植株花器官結(jié)構(gòu)受損，進(jìn)一步研究表明植株高抗壞血酸含量損害花粉活力，為雄性不育系的培育提供了新思路[39]。

單性結(jié)實(shí)即無需授粉子房直接形成無子果實(shí)，能夠避免花粉活力對坐果率的影響。AGL6(agamous-like6)基因被證明與番茄單性結(jié)實(shí)有關(guān)，CRISPR/Cas9敲除AGL6產(chǎn)生了果實(shí)質(zhì)量等性狀未受影響的單性結(jié)實(shí)材料，驗(yàn)證了AGL6賦予番茄的單性結(jié)實(shí)能力[40]，并據(jù)此對SlAGL6介導(dǎo)的單性結(jié)實(shí)機(jī)制進(jìn)行了深入研究[41]。類似的，Aux/IAA(auxin/indole-3-acetic acid)轉(zhuǎn)錄因子SlIAA9的下調(diào)激活番茄單性結(jié)實(shí)，CRISPR/Cas9敲除獲得的單性結(jié)實(shí)突變體顯示出果實(shí)無核的表型，研究發(fā)現(xiàn)該突變能夠穩(wěn)定遺傳至下一代，并快速應(yīng)用于番茄各品種[42]。

2.1.5 多性狀改良品種培育CRISPR/Cas9能夠一次性編輯調(diào)控番茄生長發(fā)育、產(chǎn)量及營養(yǎng)方面的多個(gè)基因，同時(shí)優(yōu)化番茄多個(gè)性狀。Kwon等[43]利用CRISPR/Cas9同時(shí)編輯SlER(erecta)、SP(self-pruning)和SP5G(self-pruning 5G)，獲得株型緊湊，外觀更像灌木，40 d內(nèi)能夠收獲成熟果實(shí)且不影響產(chǎn)量的番茄植株，創(chuàng)建了一種適宜城市農(nóng)業(yè)的番茄材料，能夠滿足現(xiàn)代化都市生存與發(fā)展需要。野生番茄具有很好的抗逆性，但品質(zhì)方面還需改良，Zs?g?n等[44]選擇野生番茄品種，靶向其形態(tài)方面的6個(gè)基因，得到了大量形態(tài)、果實(shí)數(shù)量、果實(shí)形狀及營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生改變但保留了野生品種抗逆性的突變體。其次，該團(tuán)隊(duì)還提出利用CRISPR/Cas9技術(shù)能夠使番茄產(chǎn)生辣椒素，提高番茄營養(yǎng)價(jià)值和抗菌能力[45]。這些結(jié)果表明了CRISPR/Cas9技術(shù)在番茄育種中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

2.2 CRISPR/Cas9在提高番茄抗逆性中的應(yīng)用現(xiàn)狀

番茄生長發(fā)育經(jīng)常面臨干旱、高溫、低溫等多種逆境條件，嚴(yán)重影響番茄的正常生長發(fā)育，因此提高番茄抗逆性一直是育種的主要目標(biāo)。CRISPR/Cas9技術(shù)推動植物抗逆相關(guān)基因功能及逆境脅迫機(jī)制等理論研究，并最終服務(wù)于番茄抗逆育種。

2.2.1 提高抗旱性干旱是對番茄生長發(fā)育最具破壞性的非生物脅迫。MAPK級聯(lián)系統(tǒng)通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)節(jié)植物抗旱反應(yīng)。CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的SlMAPK3突變體中，檢測到了過氧化氫的含量減少及熱脅迫耐受性降低[46]，此外，病原體防御反應(yīng)調(diào)控因子SlNPR1(nonexpressor of pathogenesis-related 1)的CRISPR/Cas9敲除突變體，也得到了類似結(jié)果[47]。證明SlMAPK3和SlNPR1響應(yīng)干旱脅迫，賦予植株一定程度的抗旱能力，這些耐旱相關(guān)基因的編輯，凸顯了基因組編輯技術(shù)在調(diào)節(jié)植株抗旱性中的可行性，但還未得到進(jìn)一步應(yīng)用。

植物激素對植物生長發(fā)育起著重要調(diào)節(jié)作用，其通過與外部環(huán)境之間相互作用提高植株對一定程度環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力[48]。油菜素甾醇(brassinosteroids，BRs)信號通路的重要轉(zhuǎn)錄因子BZR1(brassinazole resistant transcription factor 1)參與抗旱調(diào)節(jié)，CRISPR/Cas9誘變SlBZR1，突變體缺少熱應(yīng)激耐受性，且過氧化氫的含量減少、熱脅迫耐受性降低[49]。證明SlBZR1是抗旱性正調(diào)控因子。氮響應(yīng)負(fù)調(diào)控因子LBD(lateral organ boundaries domain)參與茉莉酸(jasmonate，JA)信號傳導(dǎo)，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的SlLBD40基因突變，提高了植株抗旱性，證明了SlLBD40是抗旱性的負(fù)調(diào)控因子[50]。最近一項(xiàng)研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯赤霉素受體蛋白基因GID1(gibberellin-insensitive dwarf1)，得到在缺水條件下保持較高水平葉片含水量的番茄植株，有效提高了番茄抗旱能力。在此基礎(chǔ)上深入探究了赤霉素(gibberellin，GA)與番茄抗旱之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下，植物體內(nèi)GA水平降低，通過減少葉面積，促進(jìn)氣孔關(guān)閉，減少木質(zhì)部增殖和擴(kuò)張，以減少木質(zhì)部水力傳導(dǎo)等多種機(jī)制減少蒸騰作用，從而提高植株耐旱性[51]，但這些抗旱相關(guān)基因之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

2.2.2 提高抗寒性寒冷也是影響植物生長發(fā)育和產(chǎn)量的重要環(huán)境因素之一。CBFs(CRT binding factors)是一種存在于各物種中的冷響應(yīng)因子，利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯SlCBF1基因得到的突變體對低溫脅迫的耐受性和敏感度下降[52]，突變體脯氨酸含量、過氧化氫含量和抗氧化酶活性等生理指標(biāo)測定也驗(yàn)證了這一結(jié)果，同時(shí)檢測到JA、ABA等激素含量的提高。這些結(jié)果有助于更好地探究SlCBF1在抗冷機(jī)制中的作用方式。過表達(dá)光合碳同化關(guān)鍵酶SBPase能夠提高植株耐寒性，而利用CRISPR/Cas9創(chuàng)建的突變體slsbpase則對冷害更加敏感，突變導(dǎo)致植株體內(nèi)抗壞血酸和谷胱甘肽含量、谷胱甘肽合成酶活性及其編碼基因轉(zhuǎn)錄豐度的降低，并抑制AsA-GSH再循環(huán)，這些結(jié)果支持SlSBPASE中的突變通過抑制 GSH 生物合成和 AsA-GSH 再循環(huán)來加劇低溫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，并表明 SBPase 是番茄植株對低溫脅迫的最佳響應(yīng)所必需的[53]。

2.2.3 提高抗鹽性鹽堿脅迫會對農(nóng)作物整個(gè)生長周期造成不同程度的抑制，限制農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量。HyPRPs(hybrid proline-rich proteins)是鹽脅迫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，CRISPR/Cas9精確調(diào)控SlHyPRP1使番茄在萌發(fā)和營養(yǎng)階段表現(xiàn)出高鹽度耐受性[54]。SlHAK20(high-affinity K+20)位于4號染色體前端，具有鈉鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體功能，能夠維持植物組織中的K+和Na+穩(wěn)態(tài)，利用CRISPR/Cas9進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)該基因與番茄耐鹽性相關(guān)，為解釋耐鹽分子機(jī)制以及耐鹽品種的選育提供了重要依據(jù)[55]。

2.2.4 提高抗除草劑能力根寄生雜草對農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量影響很大，MAX1(more axillary growth 1)基因是獨(dú)腳金內(nèi)酯(strigolactone，SL)合成基因，而SL是根寄生雜草萌發(fā)所必需的誘導(dǎo)劑。設(shè)計(jì)靶向SlMAX1基因第3個(gè)外顯子的sgRNA，得到SlMAX1敲除突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體SL水平降低，并獲得對根寄生雜草分枝列當(dāng)(Phelipancheaegyptiaca)的抗性，為有效控制根寄生雜草提供了新方法[56]。

2.2.5 提高多種非生物脅迫抗性植物通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除機(jī)制減輕非生物脅迫帶來的損害，其穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子CGFS 型谷氧還蛋白(CGFS-type glutaredoxin，GRX)，CRISPR/Cas9靶向誘變分析番茄4種GRX基因(SlGRXS14、SlGRXS15、SlGRXS16和SlGRXS17)，其中SlGRXS14和SlGRXS17突變體對熱、寒冷、干旱、重金屬毒性、營養(yǎng)缺失和短光周期等非生物脅迫都更敏感，而SlGRXS16突變體主要對寒冷更加敏感，為通過基因工程方法提高番茄對多種非生物脅迫的耐受性提供了新思路[57]。

2.3 CRISPR/Cas9在提高番茄抗病性中的應(yīng)用現(xiàn)狀

近年來，番茄病害發(fā)生逐年增多，根據(jù)病原體可分為真菌病、病毒病和細(xì)菌病等，這些病害嚴(yán)重影響了番茄產(chǎn)量，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用有效提高番茄對不同類型病原體的抵抗力。

2.3.1 提高真菌病抗性番茄白粉病主要危害葉片，該病害通過在葉片上形成霉斑來影響光合作用，直接影響植株生長發(fā)育。研究表明番茄Mlo(mildew resistance locus o)基因家族SlMlo1是白粉病易感基因，利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除SlMlo1，10個(gè)月內(nèi)即可得到白粉病抗性很強(qiáng)的非轉(zhuǎn)基因番茄[58]。在此基礎(chǔ)上，研究人員引入多敲系統(tǒng)創(chuàng)制抗病突變體，構(gòu)建雙靶點(diǎn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向SlMlo1，成功獲得SlMlo1大片段缺失且完全抗白粉病的突變體[59]。此外，白粉病易感基因PMR4(powdery mildew resistance 4)的缺失導(dǎo)致抗病性增強(qiáng)[60]，多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯SlPMR4的敲除突變體顯著地提高了白粉病抗性。證明了CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)能夠快速且有效地提高植株對真菌病抗性。

致病疫霉(Phytophthorainfestans)所引起的的番茄晚疫病是一種嚴(yán)重的番茄真菌病害，主要影響設(shè)施番茄產(chǎn)量。miRNAs能夠通過抑制其靶基因提高植物抗性，利用多重編輯系統(tǒng)同時(shí)敲除miR482b和miR482c，發(fā)現(xiàn)雙突變體比單突變體抗性更高，揭示了miRNAs調(diào)控抗性新機(jī)制[61]。此外，CRISPR/Cas9驗(yàn)證了SlMYBS2對致病疫霉的正向調(diào)控作用，并推測SlMYBS2通過SA和JA信號通路抵抗致病疫霉[62-63]。CRISPR/Cas9技術(shù)還可用于更多番茄致病疫霉相關(guān)基因功能的進(jìn)一步驗(yàn)證中。

基因組編輯技術(shù)還被應(yīng)用于提高尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)所導(dǎo)致枯萎病[64]以及灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)所導(dǎo)致的灰霉病抗性[65]。CRISPR/Cas9編輯產(chǎn)生的Sloyc08g075770突變體對枯萎病敏感性更高[64]。此外，茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)在植物抗逆中起信號傳遞作用，研究人員推測MeJA相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MYC2(myelocytomatosis protein 2)參與調(diào)控植株抗逆，CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的SlMYC2突變，降低了突變體果實(shí)抗灰霉病能力和抗氧化酶活性，證明該基因在MeJA誘導(dǎo)的番茄果實(shí)抗灰霉病過程中起正調(diào)控作用[65]。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)果膠裂解酶基因PL(pectate lyase)的CRISPR/Cas9敲除將植株對灰霉病的易感性降低了50%以上[66]。

2.3.2 提高病毒病抗性番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)是番茄生產(chǎn)中的一種毀滅性病害。CRISPR/Cas9能夠靶向TYLCV基因組從而提高植物抗病性[67]，此外通過靶向番茄TYLCV基因組的復(fù)制酶Rep(replicase)及外殼蛋白CP(coat protein)，賦予突變體TYLCV抗性，其中CP位點(diǎn)的突變效率更高[68]。在此基礎(chǔ)上利用誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)建CRISPR/Cas9表達(dá)載體，靶向TYLCV的基因間區(qū)域IR(intergenic region)和CP序列，檢測到病毒的積累減少或發(fā)生延遲[69]。除此之外，研究人員通過QTL定位(quantitative trait locus)鑒定了抗性連鎖的一系列位點(diǎn)，使用CRISPR/Cas9敲除Ty-5位點(diǎn)編碼的SlPelo(pelota)基因，其缺失也能有效抑制TYLCV病毒增殖[59]。

除直接干擾病毒基因組外，小型RNA在病毒防御中的作用也值得探討。DCL(dicer-like)作為加工酶參與RNA沉默，其中擬南芥DCL2能夠?qū)?nèi)源性和病毒性dsRNA(double-stranded RNA)加工成22-nt的sRNA(small RNA)，從而造成病毒RNA沉默[70]。為了研究番茄DCL2在抗病中的功能，使用CRISPR/Cas9編輯番茄DCL2四個(gè)亞家族(SlDCL2a-SlDCL2d)中表達(dá)量最高的SlDCL2b，顯著增強(qiáng)了番茄對番茄花葉病毒(tomato masaic virus，ToMV)的抗性[71]，同時(shí)編輯SlDCL2a和SlDCL2b則顯著提高番茄對馬鈴薯X病毒(potato virus X，PVX)和煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)的抗性[72]。研究認(rèn)為SlDCL2是番茄抗病毒病途徑中的關(guān)鍵組成部分，證明CRISPR/Cas9在創(chuàng)建番茄多重抗病品種方面有著很大的潛力。

2.3.3 提高細(xì)菌病抗性丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)是細(xì)菌性葉斑病的致病菌，它通過釋放冠毒素COR(coronatine)引起植株氣孔的張開，從而利于細(xì)菌的侵染。JAZ(jasmonate-ZIM)結(jié)構(gòu)域蛋白是COR共受體，運(yùn)用CRISPR/Cas9編輯SlJAZ2，使其缺少JAZ結(jié)構(gòu)域，突變體對細(xì)菌性葉斑病產(chǎn)生抵抗力[73]。

黃單胞菌(Xanthomonaseuvesicatoriapv)引起番茄瘡痂病，PUB(plant U-box)在多種作物中正向調(diào)控植株抗病性，CRISPR/Cas9敲除SlPUB24，突變體顯示出黃單胞菌屬T3族易感性，因此認(rèn)為SlPUB24是一種黃單胞菌屬T3族抗性基因，為抗瘡痂病抗病機(jī)制研究提供基礎(chǔ)[74]。此外，CRISPR/Cas9編輯抗性(resistance，R)基因Rx4，發(fā)現(xiàn)Rx4蛋白識別黃單胞菌屬T3族病原體后，激活防御機(jī)制超敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)，從而提高瘡痂病抗性，亦為瘡痂病抗病機(jī)制研究提供參考[75-76]。

2.3.4 提高植株多重抗病能力傳統(tǒng)育種依賴于單一R基因，而易感基因S(Susceptibility gene)更具持久和廣譜抗病性。CRISPR/Cas9技術(shù)提供了一種多重抗病材料的創(chuàng)建策略，其誘導(dǎo)的番茄S基因SlDMR6-1突變，賦予番茄更強(qiáng)的細(xì)菌、卵菌和真菌等不同類型的病原體抗性[77-78]。此外，CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的乙炔酶編碼基因ACER1a和ACET1b突變顯示出對真菌和細(xì)菌病原體的抗性的增加[79]。

總而言之，這些研究結(jié)果體現(xiàn)了CRISPR/Cas9在抗病性方面的強(qiáng)大功能，該技術(shù)能夠幫助科研人員探索病原體發(fā)病機(jī)制和植物體抗病機(jī)制，對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展起到了很大的推動作用[80]。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的問題及改進(jìn)方法

隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷發(fā)展，其應(yīng)用范圍的擴(kuò)大也成了一個(gè)熱點(diǎn)問題，CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯特異性的提高、轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化以及新型基因編輯系統(tǒng)的開發(fā)等方法能夠降低CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的局限性。

3.1 編輯效率的提高

盡管CRISPR/Cas9具有精確高效的特點(diǎn)，但由于Cas9核酸酶在一定程度上可以容忍sgRNA與靶序列之間的錯(cuò)配，直接導(dǎo)致編輯精確性下降。雖然在植物中比較少見[81]，但研究人員還是開發(fā)了各種方法以降低脫靶效應(yīng)。

穩(wěn)定的sgRNA能夠更準(zhǔn)確地引導(dǎo)RNPs，Moreno-Mateos等[82]分析發(fā)現(xiàn)富含G而缺乏A的sgRNA更加穩(wěn)定，設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)應(yīng)避開poly-T序列、限制GNGG序列，此外截短sgRNA也能降低脫靶效應(yīng)[83]。此外，使用兩種不同的Cas9酶進(jìn)行編輯也能夠極大地減少脫靶效應(yīng)[84]。脫靶效應(yīng)也與靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)相關(guān)，各種軟件網(wǎng)站被開發(fā)以進(jìn)行更具有特異性的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)[82]。研究人員還開發(fā)出多靶點(diǎn)系統(tǒng)，通過串聯(lián)sgRNA，靶向單個(gè)基因不同靶點(diǎn)，更徹底地進(jìn)行基因編輯。此外，優(yōu)化Cas9表達(dá)啟動子[85]，誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)HDR修復(fù)途徑[86]，預(yù)測網(wǎng)站的應(yīng)用[10]等也能提高基因編輯精確性。

3.2 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化

目前，導(dǎo)入CRISPR系統(tǒng)比較成熟的方法是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，該方法雖然能夠使Cas9和sgRNA在植物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，但轉(zhuǎn)化效率較低。Yu等[21]提出病毒介導(dǎo)的基因組編輯系統(tǒng)能夠簡化繁瑣的轉(zhuǎn)化過程，Ma等[87]將SpCas9和gRNA插入到SYNV病毒基因組中，成功應(yīng)用于煙草，編輯效率能夠達(dá)到40%～91%。CRISPR/Cas9的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化能夠?qū)崿F(xiàn)無轉(zhuǎn)基因編輯，Yuan等[88]建立雙生病毒復(fù)制子和雙終止子的高水平瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，通過農(nóng)桿菌侵染在番茄中瞬時(shí)表達(dá)，進(jìn)行目標(biāo)基因的編輯，該系統(tǒng)提高了編輯效率以及后代無Cas9植株的比例。此外，遺傳轉(zhuǎn)化過程中的生長條件改變也促進(jìn)了突變的增加[3]。

3.3 新型基因編輯技術(shù)的發(fā)展

為了解決CRISPR/Cas9的限制性問題，新的基因編輯技術(shù)也在不斷地被發(fā)現(xiàn)，如幾乎沒有脫靶效應(yīng)的CRISPR/Cpf1[89]以及能夠精準(zhǔn)編輯的堿基編輯技術(shù)(base editing，BE)[90]等。

Zetsche等[91]發(fā)現(xiàn)Cpf1系統(tǒng)，將其歸為CRISPR的第2類Ⅴ型，又被稱為CRISPR/Cas12a。該系統(tǒng)使用單一RNA引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶，產(chǎn)生具有5′突出的粘性末端，促進(jìn)NHEJ機(jī)制精確地編輯基因。此外該核酸酶本身是RNase能夠切割RNA，且分子量小能夠方便地進(jìn)入細(xì)胞，擴(kuò)大了CRISPR的應(yīng)用范圍[92]。此后還開發(fā)出了多種高效Cas12a[93]，以提高編輯效率，擴(kuò)大PAM區(qū)域識別范圍。CRISPR/LbCpf1的雙生病毒多重復(fù)制子系統(tǒng)的使用成功編輯番茄耐鹽相關(guān)的SlHKT1;2等位基因，且有效提高了HDR的基因組編輯效率，為無轉(zhuǎn)基因編輯鋪平道路[94]。Bernabé-Orts[95]證明了CRISPR/Cas12a能夠在番茄中進(jìn)行基因編輯，并且沒有檢測到脫靶效應(yīng)，能夠作為CRISPR/Cas9的替代工具，該系統(tǒng)還被應(yīng)用于ToMV和番茄棕褐色果實(shí)病毒(tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV)的特異性檢測[96]。

BE也在多種作物中得到了應(yīng)用[97-98]，該技術(shù)基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)單個(gè)堿基替換。與CRISPR相比，BE不依賴于DSBs的產(chǎn)生，無需供體DNA參與并更具高效性和廣泛適用性[90]。Shimatani等[99]將CRISPR/Cas9和活化誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶AID(activation-induced cytidine deaminase)融合，將該系統(tǒng)命名為Target-AID，利用該系統(tǒng)進(jìn)行編輯，得到的突變體在靶位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變，證明了BE在作物改良方面的可行性。乙酰乳酸合酶ALS(acetolactate synthase)賦予番茄對磺酰脲類除草劑氯磺隆抗性，且精確堿基編輯效率高達(dá)71%，其中12.9%的番茄植株無T-DNA插入[98]。在番茄中靶向類胡蘿卜素代謝途徑中的3個(gè)基因(SlDDB1、SlDET1和SlCYC-B)同時(shí)導(dǎo)入堿基置換突變，增加了番茄果實(shí)中類胡蘿卜素含量，證明了Target-AID堿基編輯技術(shù)能夠高效編輯多個(gè)基因[100]。Lu等[101]在番茄中利用Prime Editing技術(shù)實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)的堿基替換或刪除，該團(tuán)隊(duì)引入熒光報(bào)告基因通過基因槍法進(jìn)行轉(zhuǎn)換，優(yōu)化了植物密碼子和啟動子，從而大大提高編輯效率。

此外，更加高效的CRISPR/Cas12f1[102]以及TnpB[103]等系統(tǒng)也被開發(fā)。這些新型系統(tǒng)能夠識別更多的PAM序列，結(jié)構(gòu)更加簡化，擴(kuò)大了基因編輯的應(yīng)用范圍。通過基因編輯系統(tǒng)不斷地更新，在番茄上使CRISPR系統(tǒng)成為一個(gè)常規(guī)化的技術(shù)將是一項(xiàng)長期持續(xù)的工作。

4 展 望

對植物活體基因組的定向編輯是長期以來農(nóng)學(xué)上實(shí)現(xiàn)基因優(yōu)化的重大難題，CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)能夠高效而簡單地解決這一問題，使我們對基因功能的研究和農(nóng)藝性狀的優(yōu)化有了一個(gè)不可替代的有力工具。一直以來轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用都存在著很大的爭議，但CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)不引入外源基因，能夠產(chǎn)生無T-DNA插入的編輯后代，這為使用生物技術(shù)手段創(chuàng)建優(yōu)異的非轉(zhuǎn)基因材料提供了嶄新的途徑。因此CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將在番茄等重要作物上獲得廣泛的應(yīng)用。2016年4月，CRISPR/Cas9創(chuàng)建的蘑菇通過了美國農(nóng)業(yè)部的認(rèn)證，也讓基因編輯在育種方面的應(yīng)用受到了很大的鼓舞[104]，使得CRISPR/Cas9的道德討論及法律制約也在不斷完善。

目前基因編輯技術(shù)已經(jīng)在抗病、抗逆方面以及改良農(nóng)藝性狀方面取得了很大的成就，加速了農(nóng)作物的馴化，提高了番茄商業(yè)價(jià)值。與傳統(tǒng)的基因沉默技術(shù)如RNAi及VIGS技術(shù)相比，CIRSPR/Cas9技術(shù)能夠更加精確地對目標(biāo)基因進(jìn)行編輯，多敲系統(tǒng)的引入則能夠更加徹底地對目標(biāo)基因進(jìn)行敲除。此外，CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)建的突變體能夠穩(wěn)定遺傳，從而更準(zhǔn)確地研究目標(biāo)基因的功能，保證了科研的嚴(yán)謹(jǐn)性。盡管機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存，但CRISPR/Cas9的時(shí)代已經(jīng)到來。