李明月，李孟軍，李國良，郭秀林，孟祥照*

(1 河北省農(nóng)林科學(xué)院 生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所，石家莊 050051；2 河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024； 3 石家莊市農(nóng)林科學(xué)院，石家莊 050000)

高溫脅迫常常引起植物細(xì)胞內(nèi)蛋白的錯(cuò)誤折疊以及活性氧(ROS)的積累，嚴(yán)重制約著植物的正常生長發(fā)育過程[1]。通常來講，當(dāng)植物周圍環(huán)境溫度升高 10～15 ℃就可形成熱脅迫[2]。為了在高溫脅迫下得以生存，植物進(jìn)化出一套能夠維持蛋白穩(wěn)定以及清除細(xì)胞內(nèi)過量 ROS 的分子機(jī)制，即：當(dāng)植物感知高溫脅迫后，熱激轉(zhuǎn)錄因子被迅速激活并結(jié)合到下游熱激蛋白(heat shock protein，Hsp)的啟動(dòng)子上誘導(dǎo)其表達(dá)，從而抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白的錯(cuò)誤折疊，保護(hù)蛋白質(zhì)的構(gòu)象以確保其行使正常的生物學(xué)功能；與此同時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)的 ROS 清除功能酶被激活，以清除細(xì)胞內(nèi)過量的 ROS 從而維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[3]。研究表明，熱激轉(zhuǎn)錄因子不僅是植物響應(yīng)高溫脅迫的重要調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也參與植物對(duì)于低溫、干旱以及高鹽的響應(yīng)過程[4]。在擬南芥中異源過表達(dá)水稻(Oryzasativa)熱激轉(zhuǎn)錄因子OsHsfA2e能夠增強(qiáng)植物的耐鹽性[5]。水稻熱激轉(zhuǎn)錄因子OsHsfC1b也參與植物對(duì)于鹽脅迫的響應(yīng)過程[6]。過表達(dá)TaHsfA2d的轉(zhuǎn)基因擬南芥不僅提高了植株的耐熱性，同時(shí)還增強(qiáng)了其耐鹽和抗旱能力[7]。

自從首個(gè)植物 Hsf 基因從番茄 (Lycopersiconesculentum)基因組中克隆得到以來，越來越多的 Hsf 基因被陸續(xù)鑒定、研究[8]。已有的研究表明，擬南芥、番茄、水稻和玉米 (Zeamays)基因組中分別有 21、16、25 和 30 個(gè) Hsf 基因，相對(duì)于上述物種，小麥基因組中的 Hsf 多達(dá) 82 個(gè)[9-13]。依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)將 Hsf 分成 A、B 和 C 族，到目前為止，研究最為廣泛的是 A 族中的 A1 和 A2 亞族[14]。在擬南芥中，Hsf 家族成員 HsfA1s 通過激活 HSR (heat stress responsive)基因從而增強(qiáng)植物的耐熱性，與此同時(shí)，這類基因的轉(zhuǎn)錄水平受到環(huán)境溫度的精細(xì)調(diào)控[15]。在正常溫度范圍內(nèi)，熱激蛋白 Hsp70 和 Hsp90 能夠通過與 HsfA1 蛋白互作而阻止 HsfA1 的核定位，進(jìn)而抑制 HsfA1 蛋白的活性，而當(dāng)植物處于高溫脅迫下時(shí)，就會(huì)使得 HsfA1 蛋白從熱激蛋白 Hsp70 和 Hsp90 組成的復(fù)合體中解聚并穿梭進(jìn)核以調(diào)控下游 HSR 基因[16-17]。

此外，周期蛋白依賴性蛋白激酶 CDC2a 能夠磷酸化 Hsf1 并隨后抑制其結(jié)合到下游基因啟動(dòng)子上[18]。在擬南芥和番茄基因組中只有1個(gè)HsfA2 亞族成員，受高溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在植物的基礎(chǔ)和獲得性耐熱過程中均發(fā)揮重要作用[19-20]。在高溫脅迫過程中，熱激轉(zhuǎn)錄因子HsfA2 基因的表達(dá)受到 HsfA1 的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后的 HsfA2 蛋白與 HsfA1 形成異源寡聚體進(jìn)核調(diào)控下游基因的表達(dá)[21]。已有的研究表明，AtHsfA2 能夠部分恢復(fù)athsfA1 突變體的表型，但在功能方面，AtHsfA2 更傾向于調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)、碳水化合物、脂類代謝途徑基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)于維持高溫脅迫后細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)起到關(guān)鍵作用[22-24]。將玉米 A2 亞族的3個(gè)基因ZmHsf01、ZmHsf04 和ZmHsf05 異源過表達(dá)在擬南芥中，均顯著地提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的基礎(chǔ)耐熱性[25-27]。在對(duì)小麥 A2 亞族基因TaHsfA2d的研究過程中發(fā)現(xiàn)，異源過表達(dá)該基因后不僅提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐熱能力，同時(shí)還促進(jìn)了種子的產(chǎn)量[7]。

相對(duì)于擬南芥等物種，對(duì)于小麥熱激轉(zhuǎn)錄因子的研究起步晚，許多基因的功能還有待于挖掘。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果表明，小麥基因組中存在 82 個(gè) Hsf，它們隨機(jī)分布在 21 條染色體上，其中 A2 亞族有18個(gè)成員，充分說明了小麥 Hsf 的復(fù)雜性[13]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究從小麥中克隆得到TaHsfA2-5 基因的完整編碼序列，以期為進(jìn)一步揭示TaHsfA2-5 基因的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料及培養(yǎng)本研究選取小麥半冬性耐熱性小麥品種‘滄 6005’為材料(種子由河北省滄州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈(zèng))。選取籽粒飽滿且大小均一的小麥種子，經(jīng)由 0.1% HgCl2表面消毒后，用自來水清洗干凈并置于室溫下浸泡 12 h，待根長長至 1～2 cm 時(shí)，移栽到 Hoagland 營養(yǎng)液中，置于溫度為 25 ℃、相對(duì)濕度為 50%～60%、光周期為 16 h/8 h (光照/黑暗)、光照強(qiáng)度為 70～100 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室生長。

本研究使用的擬南芥野生型材料為Columbia(Col-0)生態(tài)型，由本實(shí)驗(yàn)室繁種后保存。選取適量擬南芥種子，經(jīng)由 0.5% 的 NaClO 進(jìn)行表面消毒后，以無菌水清洗 5～6 次，并均勻地鋪在 MS 固體培養(yǎng)基上，低溫春化 3 d 后置于室溫下萌發(fā)。

1.2 小麥熱脅迫處理選取正常生長于 Hoagland 營養(yǎng)液中的小麥幼苗，參照李慧聰?shù)萚28]的方法進(jìn)行高溫脅迫處理，分別剪取小麥的葉片、莖和根，于液氮中速凍后備用。另外，在常規(guī)種植大田試驗(yàn)中，分別取花期的雌蕊、雄蕊、萼片，以及 1 周齡幼胚和成熟胚，液氮速凍，用于組織表達(dá)分析。

1.3 目的基因的克隆以RNArose Reagent Systems試劑盒 (華舜生物工程公司，上海)提取植物總RNA后，按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒 (TaKaRa，大連) 提供的方法去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。以基因特異性引物 (F: 5′-GACATGGACCCGGTGCCGAGTC-3′; R: 5′-TGGAATGGAA-CTAGGTTGAGAGGGT-3′)對(duì)上述cDNA進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物回收純化后連接至T載體 (pEasy-Blunt Simple Cloning Kit，TransGen Biotech)，經(jīng)菌液 PCR 檢測后選取 3 個(gè)陽性單克隆送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4 亞細(xì)胞定位分析將TaHsfA2-5 基因的編碼區(qū)以XbaⅠ 和BamHI 雙酶切體系構(gòu)建在含有 CaMV35S 啟動(dòng)子的 pJIT1-hGFP 表達(dá)載體上，可以將 TaHsfA2-5 蛋白與 GFP 進(jìn)行融合表達(dá)。實(shí)驗(yàn)參照李慧聰?shù)萚28]描述的方法進(jìn)行， 質(zhì)粒經(jīng)過金粉包埋后通過基因槍將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞中，在室溫下暗培養(yǎng) 16 h后，于激光共聚焦顯微鏡 (Zeiss META510)下觀察熒光。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-PCR) 參考 Duan 等[13]對(duì)小麥 Hsfs 的分析結(jié)果，設(shè)計(jì)TaHsfA2-5 的特異引物，以TaRP15 (表 1)作為內(nèi)參基因，按照張玉杰等[29]描述的反應(yīng)體系以及程序進(jìn)行擴(kuò)增。在組織表達(dá)模式中將根的表達(dá)量設(shè)定為 1，在熱脅迫過程中將取材 0 min 的表達(dá)量設(shè)定為 1，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)定 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)定 3 次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)以 Excel 進(jìn)行分析并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差，同時(shí)結(jié)合 SPSS 19.0 軟件分析差異顯著性。

表1 小麥 TaHsfA2-5 基因的擴(kuò)增以及擬南芥 HSRs定量分析引物序列

1.6 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及耐熱性分析擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及其篩選過程均參考張玉杰等[29]的方法。將獲得的目的基因TaHsfA2-5 利用XbaⅠ和SacⅠ雙酶切后構(gòu)建到 pCAMBIA1300 載體上，測序驗(yàn)證正確后提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。利用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥野生型植株，篩選陽性苗直至獲得純合株系。選取其中的line 15_8、 line 14_32 和 line 4_3 株系用于耐熱性分析。耐熱性分析分為基礎(chǔ)耐熱性 (45 ℃處理1 h 后，置于 22 ℃下恢復(fù) 8 d)和獲得耐熱性 (37 ℃處理 1 h，22 ℃培養(yǎng) 2 d，46 ℃處理 50 min 后，置于 22 ℃下恢復(fù) 8 d)兩部分，每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)株系至少處理 30 棵幼苗，共進(jìn)行 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。分別觀察耐熱處理前后的幼苗生長表型，記錄并拍照，隨后收集不同株系的地上蓮座葉，測定葉綠素含量。

1.7 熱脅迫后轉(zhuǎn)基因擬南芥 HSR 基因的表達(dá)分析選取 6 個(gè)擬南芥熱相關(guān)蛋白，取 5 d 齡擬南芥野生型和轉(zhuǎn)基因系 Line 15_8，經(jīng)基礎(chǔ)和獲得耐熱性熱處理后，于恢復(fù) 1 h 和 4 h 分別取樣進(jìn)行定量分析。以 0 h 不同處理的野生型作為對(duì)照，數(shù)值記為 1。引物序列見表 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 TaHsfA2-5編碼蛋白的序列及其亞細(xì)胞定位分析

參照 Duan 等[13]對(duì)小麥 Hsf 的分析結(jié)果，從熱處理后的小麥品種‘滄 6005’ 二葉一心幼苗葉片中克隆得到熱激轉(zhuǎn)錄因子TaHsfA2-5 的完整編碼序列，共計(jì) 1 218 bp，編碼 405 個(gè)氨基酸(圖1)。經(jīng)蛋白序列相似性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白序列與大麥 HvHsfA2b 蛋白的相似性最高，達(dá) 88.07%(圖2)。

為進(jìn)一步分析 TaHsfA2-5 蛋白的亞細(xì)胞定位情況，構(gòu)建了可以融合表達(dá) GFP 的瞬時(shí)表達(dá)載體，通過基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TaHsfA2-5 蛋白定位于細(xì)胞核(圖3)。

2.2 小麥 TaHsfA2-5 的組織表達(dá)以及在熱脅迫下的誘導(dǎo)情況

qRT-PCR分析表明，TaHsfA2-5在小麥多個(gè)組織器官中均有表達(dá)，并且在成熟的根、雄蕊、雌蕊、萼片、成熟種子以及幼胚中呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，在幼嫩的根、莖、葉以及成熟的莖、葉中呈現(xiàn)較低的表達(dá)水平(圖4)。

在熱脅迫條件下，TaHsfA2-5 基因在小麥葉片和根部受誘導(dǎo)表達(dá)的程度不同。其中，小麥葉片中的TaHsfA2-5 基因更易受到熱脅迫誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，并且在熱處理 90 min 時(shí)達(dá)到最大值；而根中TaHsfA2-5 基因在熱脅迫處理?xiàng)l件下表現(xiàn)出較弱的上調(diào)表達(dá)趨勢，且在熱處理 120 min 時(shí)達(dá)到最大值 (圖5)。

2.3 小麥 TaHsfA2-5 基因在擬南芥中的耐熱性分析

擬南芥 HsfA2 亞族中只有一個(gè)成員，屬于熱誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄激活因子，在熱激響應(yīng)過程中會(huì)受到 AtHsfA1 家族成員的調(diào)控，并在擬南芥獲得性耐熱過程中發(fā)揮重要作用[20]。為進(jìn)一步分析TaHsfA2-5 是否參與調(diào)控耐熱過程，選取 line 15_8、 line 14_32 和 line 4_3 過表達(dá)擬南芥純合株系，進(jìn)行基礎(chǔ)性耐熱性(圖6，A、B)和獲得性耐熱性鑒定實(shí)驗(yàn)(圖6，C、D)。結(jié)果表明，在正常生長條件下，轉(zhuǎn)基因株系與野生型的生長狀況一致；在基礎(chǔ)性和獲得性耐熱試驗(yàn)處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系相較于野生型擬南芥幼苗能夠保持更好的生長狀況，說明TaHsfA2-5 能夠增強(qiáng)擬南芥植株的基礎(chǔ)性和獲得性耐熱性。

同時(shí)，通過對(duì)熱脅迫處理前后擬南芥地上蓮座葉中葉綠素含量的測定分析 (圖6，E)發(fā)現(xiàn)，在處理前，轉(zhuǎn)基因株系蓮座葉中葉綠素含量與野生型無明顯差異，通過基礎(chǔ)性和獲得性耐熱試驗(yàn)處理后，轉(zhuǎn)基因株系和野生型蓮座葉中葉綠素的含量均降低，但轉(zhuǎn)基因株系蓮座葉中葉綠素含量要明顯高于野生型，以上結(jié)果進(jìn)一步說明TaHsfA2-5 基因參與了調(diào)控植物的基礎(chǔ)性以及獲得性耐熱過程。

2.4 異源表達(dá)小麥 TaHsfA2-5 對(duì)擬南芥熱激響應(yīng)基因的影響

植物中的熱激轉(zhuǎn)錄因子會(huì)通過結(jié)合下游 HSR 基因啟動(dòng)子區(qū)一段保守的熱激響應(yīng)元件(GAAnnTTCnn GAA)來調(diào)控植物對(duì)于高溫脅迫的響應(yīng)[22]。

為進(jìn)一步分析小麥TaHsfA2-5 對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥熱激響應(yīng)基因的影響，對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)基因材料 line15_8 和野生型(WT)進(jìn)行了基礎(chǔ)性和獲得性耐熱的處理，取樣后檢測了 6 個(gè)下游 HSR 基因的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論是通過基礎(chǔ)性還是獲得性耐熱的處理，異源過表達(dá)TaHsfA2-5 均能夠不同程度地上調(diào)所檢測的 HSR 基因的表達(dá)量，但在獲得性耐熱處理的情況下多數(shù) HSR 基因的上調(diào)表達(dá)幅度明顯小于基礎(chǔ)性耐熱處理(圖7)。

3 討 論

植物響應(yīng)高溫脅迫是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，涉及到多種信號(hào)通路、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及細(xì)胞組分，其中熱激轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物響應(yīng)高溫脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用[30]。以往的研究結(jié)果主要是來自于模式植物擬南芥和番茄，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多作物中的熱激轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)。已有的研究表明，AtHsfA2是擬南芥 A2 亞族的唯一成員，且是響應(yīng)高溫脅迫的關(guān)鍵調(diào)控因子[22-24]。普通小麥?zhǔn)峭戳扼w物種，基因組龐大，重復(fù)序列多，Xue 等[31]在 2014 年推測小麥至少有 56 個(gè)熱激轉(zhuǎn)錄因子，單單 HsfA2 亞族就有 9 個(gè)成員。本實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，小麥的熱激轉(zhuǎn)錄因子多達(dá) 82 個(gè)，同時(shí) HsfA2 亞族也比先前預(yù)測的多，我們共發(fā)現(xiàn) 18 個(gè) HsfA2 亞族成員，且初步分析發(fā)現(xiàn)多數(shù) HsfA2 亞族成員會(huì)受到高溫脅迫、過氧化氫、脫落酸、水楊酸以及 PEG 的誘導(dǎo)[13]。相較于模式植物，小麥中 HsfA2 亞族成員的復(fù)雜性不言而喻，因此對(duì)于小麥 HsfA2 亞族成員生物學(xué)功能的解析將會(huì)極大地推動(dòng)耐熱性小麥的育種進(jìn)程。本研究從熱處理后的小麥二葉一芯幼苗葉片中克隆得到熱激轉(zhuǎn)錄因子TaHsfA2-5 的完整編碼序列，并分析了相應(yīng)蛋白序列以及亞細(xì)胞定位情況，證明該基因具備HsfA2 亞族的結(jié)構(gòu)特征和定位特點(diǎn)，暗示其作為熱激轉(zhuǎn)錄因子具備調(diào)控下游熱激響應(yīng)基因表達(dá)的可能。

根據(jù)熱激轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)構(gòu)域 HR-A 與 HR-B 之間氨基酸的數(shù)量將 Hsf 劃分為 A、B、C 三大類，在 A 族中 HR-A 與 HR-B 結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸數(shù)量最多，達(dá)到 21 個(gè)，其次是 C 族，有 7 個(gè)氨基酸的插入，而 B 族中沒有氨基酸的插入[32]。蛋白結(jié)構(gòu)的不同也決定了各族轉(zhuǎn)錄因子會(huì)行使不同的功能。當(dāng)前的研究結(jié)果表明，A 族成員在調(diào)控植物響應(yīng)基礎(chǔ)耐熱性以及獲得耐熱性的過程中發(fā)揮著主效作用，在高溫脅迫的誘導(dǎo)下能夠通過結(jié)合下游熱激響應(yīng)基因啟動(dòng)子上的熱激元件(HSE，heat shock element)從而使得植物對(duì)于周圍不利環(huán)境做出快速應(yīng)答，其中 A1 亞族在花粉中的表達(dá)量較高，A2 亞族屬于高溫脅迫誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，可以在擬南芥中保持較高的表達(dá)水平[14, 23-24]。B 族和 C 族的研究報(bào)道較少，由于它們并不具有 AHA 基序，暗示這些熱激轉(zhuǎn)錄因子并不具有激活功能[30]。很多 B 族成員也都可以受到高溫脅迫的誘導(dǎo)，但更多的是在熱響應(yīng)后期發(fā)揮著負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用，而 C 族成員在高溫脅迫下普遍下調(diào)，通常高表達(dá)于小麥的籽粒以及根中[31, 33-34]。本研究結(jié)果顯示，TaHsfA2-5 的表達(dá)在多個(gè)小麥組織中均可檢測到，并且在成熟的根、雄蕊、雌蕊、萼片、成熟種子以及幼胚中呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平；同時(shí)，該基因的表達(dá)會(huì)受到高溫脅迫的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，與之前對(duì)于 HsfA2 亞族的描述一致。

目前的研究結(jié)果表明，不同家族的 Hsf 存在蛋白結(jié)構(gòu)和生物功能的差異，即便是同一亞族的 Hsf 成員之間也行使著不一樣的功能。在擬南芥中異源表達(dá)TaHsfA2e基因雖說均可提高轉(zhuǎn)基因材料的基礎(chǔ)耐熱性和獲得耐熱性，但顯然過表達(dá)TaHsfA2e基因更利于提高植物的基礎(chǔ)耐熱能力，然而，同家族的另一個(gè)成員TaHsfA2f基因更利于提高植物的獲得耐熱能力[29,35]。在本研究中，將TaHsfA2-5 基因轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，通過基礎(chǔ)以及獲得性耐熱實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無論是從表型方面觀察，還是對(duì)于熱脅迫后地上蓮座葉中葉綠素含量的測定，均說明TaHsfA2-5 基因?qū)τ谵D(zhuǎn)基因擬南芥的基礎(chǔ)以及獲得性耐熱能力具有不同程度的提高，但在基礎(chǔ)性耐熱過程中，轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出相較于野生型更強(qiáng)的耐熱性，同時(shí)，多數(shù)熱激蛋白的表達(dá)量也呈現(xiàn)出更高的表達(dá)水平。至于TaHsfA2-5 如何在不同的耐熱性處理下發(fā)揮不一樣的調(diào)控方式，可能與其在不同生物學(xué)過程中調(diào)控的下游基因有關(guān)。如本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥中熱激蛋白HSP70b在基礎(chǔ)性耐熱過程中上調(diào)明顯，而在獲得性耐熱過程中，基本上未受到高溫脅迫的誘導(dǎo)。