楊娟，平文卉，葉青華，張穎茜，王金鑫，戴志英

分析檢測

高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法對嬰幼兒奶粉和輔食中不同形態(tài)汞的測定

楊娟，平文卉，葉青華，張穎茜，王金鑫，戴志英

（南通市疾病預(yù)防控制中心， 江蘇 南通 226007）

采用高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀測定嬰幼兒奶粉和輔食中不同形態(tài)汞含量。樣品用冰浴超聲振蕩提取后用離心機(jī)將樣液離心分離，分離好的上清液用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，過膜后經(jīng)過形態(tài)分析儀預(yù)處理，由高效液相色譜分離，最后用原子熒光光度計(jì)檢測。甲基汞、乙基汞和二價(jià)汞3 種形態(tài)汞標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍0～10 μg·L-1；相關(guān)系數(shù)均大于0.99；檢出限分別為 0.51、0.50、0.52 μg·L-1；平均加標(biāo)回收率為 90.8%～109.3%；RSD為1.76%～7.07%。該法測定嬰幼兒奶粉和輔食形態(tài)汞含量，方法的精密度和準(zhǔn)確度及線性關(guān)系均比較滿意，適合用于嬰幼兒奶粉和輔食形態(tài)汞含量的測定。

高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用法； 嬰幼兒奶粉和輔食； 形態(tài)汞

近幾年，隨著生活水平的提高，食品安全問題受到人民群眾的關(guān)注，二胎政策放開之后，奶粉、輔食量需求量增高，其安全問題成為父母首要關(guān)注的問題[1]。

汞具有易揮發(fā)、易富集的特點(diǎn)[2]。毒性有機(jī)汞高于無機(jī)汞，有機(jī)汞中甲基汞毒性最大。甲基汞很容易穿過血腦屏障并損害人的神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)。有機(jī)汞是一種親脂性有機(jī)化合物，很容易在食物鏈中富集。被人體吸收后，大多數(shù)無機(jī)汞會在腎臟中積累，對腎臟造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，甲基汞更可能是人體致癌物。

由于汞對人類健康造成的巨大損害，汞污染在世界范圍內(nèi)變得越來越重要。由于汞不可降解性和強(qiáng)大的生物蓄積性，土壤和水中的汞經(jīng)過生物蓄積后會進(jìn)入食品原料，從而危害人體健康。水和土壤中的汞通過微生物甲基化并通過食物鏈逐漸富集在魚類等水產(chǎn)動(dòng)物中，因此，魚類等水產(chǎn)動(dòng)物食品中甲基汞的含量普遍高于其周邊環(huán)境。由于濫用農(nóng)藥，化工廠等排污不當(dāng)，所以植物食物容易被汞污染，在微生物的作用下，無機(jī)汞轉(zhuǎn)化為甲基汞[3]。此外，食物在采集、運(yùn)輸、加工和包裝過程中，溶解在金屬容器中的汞和含汞的食品添加劑也可能會污染食品，尤其是奶制品，現(xiàn)在女性工作壓力大，事業(yè)和家庭兼顧，晚婚晚育的現(xiàn)象普遍存在，生育后很多要么奶水不足，要么背奶，要么干脆選擇配方乳，因?yàn)閷τ趮胗變簛碚f配方乳的需求量巨大，然而國內(nèi)出現(xiàn)過三鹿毒奶粉事件后，媽媽對選擇奶粉方便更加謹(jǐn)慎，奶粉的安全性，奶源的安全性都很重視，因?yàn)榧訌?qiáng)配方奶粉和輔食質(zhì)量的監(jiān)測監(jiān)管非常有必要。

對于水樣，特別是飲用水，預(yù)處理萃取快速而簡單[4-7]，對于食品樣品，尤其是奶粉和輔食樣品中含有脂肪，蛋白質(zhì)和其他復(fù)雜結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。在預(yù)處理過程中將使用大量的酸和萃取劑，萃取過程環(huán)節(jié)復(fù)雜，影響提取效率，進(jìn)而影響檢測結(jié)果，并且污染環(huán)境[8-13]，因而前處理過程至關(guān)重要。

目前不同形態(tài)汞的測定方法主要是液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法（HPLC-AFS）和液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-ICP-MS）[14]。兩種方法相比, HPLC-AFS儀器結(jié)構(gòu)簡單、儀器耗材成本低、靈敏度高、選擇性好和普及廣等優(yōu)點(diǎn)，因而使用該方法檢測有機(jī)汞的頻率相對高，國內(nèi)外報(bào)道的機(jī)會比較多，方法也相對成熟。

在這項(xiàng)工作中，使用5 mol·L-1HCl溶液超聲提取樣品中的汞。使用6 mol·L-1NaOH溶液將樣品的pH調(diào)節(jié)至2～7。C18反相色譜柱分離，在流動(dòng)相中添加L-半胱氨酸作為汞配合物，在紫外線照射下甲基汞轉(zhuǎn)化為無機(jī)汞，在酸性條件下，無機(jī)汞與硼氫化鉀在線反應(yīng)生成汞蒸氣，通過原子熒光光譜法[15]用于檢測不同形式的汞。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SAP-10液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀，艾杰爾反相C18分析柱，汞空心陰極燈，KQ-300TDB型高頻數(shù)控超聲波清洗器，BI0FUGE PRlM0 R230冷凍離心機(jī)，JY10002電子天平。

1 000 mg·L-1汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(北京有色金屬研究院)；

甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(65.2±2.5 μg·g-1，中國計(jì)量科學(xué)研究院，GBW08675)；

乙基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(70.6±2.5 μg·g-1，中國計(jì)量科學(xué)研究院，GBW（E）081524)；

湖底沉積物中甲基汞及無機(jī)元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（甲基汞5.2±0.7 ng·g-1, 總汞0.48±0.03 μg·g-1中國計(jì)量科學(xué)研究院，GBW08308）；

甲醇(色譜純)；L-半胱氨酸(生化試劑)，國藥集團(tuán)；硼氫化鉀：SIGMA;鹽酸(優(yōu)級純)；乙酸銨、氫氧化鈉：分析純，國藥集團(tuán)；

液相流動(dòng)相：5%甲醇、0.1% L-半胱氨酸、0.06 mol·L-1乙酸銨，稱取1.21 g L-半胱氨酸，4.62 g乙酸銨，放入1 L的容量瓶中，加入超純水超聲溶解，再加入50 mL色譜純甲醇，用超純水定容至1 L，用溶劑過濾器過水相膜抽濾，水浴超聲30 min，流動(dòng)相需現(xiàn)用現(xiàn)配。

形態(tài)分析試劑：7%鹽酸溶液作為載流，20 g·L-1硼氫化鉀溶液作為還原劑，準(zhǔn)確稱取20.0 g硼氫化鉀，用3.5 g·L-1氫氧化鉀溶液溶解并稀釋至1 L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 儀器工作條件

液相色譜：C18色譜分析柱(150 mm×4.6 mm×5 um)，C18預(yù)柱(10 mm×4.6 mm×5 um)，泵流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣體積0.1 mL 。

原子熒光：負(fù)高壓280 V，汞燈電流40 mA，載氣流速400 mL·min-1，屏蔽氣流速600 mL·min-1。

形態(tài)分析預(yù)處理裝置條件：泵速：60 r·min-1，紫外燈（UV）開。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取奶粉和輔食樣品約0.50～2.0 g，置于15 mL 聚丙烯離心管中，加入10 mL 5 mol·L-1現(xiàn)配鹽酸溶液，搖勻放置冰箱冷藏過夜。空調(diào)制冷溫度下冰浴超聲提取60 min，期間振搖數(shù)次。4 ℃下以8 000 r· min-1轉(zhuǎn)速離心15 min。準(zhǔn)確吸取2.0 mL上清液至5 mL容量瓶或者刻度試管中（刻度試管置于冰水混合物中），逐滴加入6 mol·L-1氫氧化鈉溶液，邊滴邊迅速搖勻，使樣液pH值在2～7之間。加入0.1 mL 10 g·L-1的L-半胱氨酸溶液，最后用水定容至刻度。最后經(jīng)0.45μm水相濾膜過濾，待測。同時(shí)做空白試驗(yàn)。將處理好的試樣溶液100 μL注入液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀中，檢測得到3種汞形態(tài)色譜圖，用外標(biāo)峰面積法定量計(jì)算出樣品中3種形態(tài)汞含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

元素形態(tài)分析需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理,包括化學(xué)提取和富集。汞不同形態(tài)的提取方法主要包括堿消解法和酸提取法；由于甲基汞是一種脂溶性化合物, 通常與蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)結(jié)合。通過查文獻(xiàn)得知陳德泉等人的工作證明在眾多酸堿提取劑中鹽酸的提取率是最高的，并且不會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，因此本實(shí)驗(yàn)在超聲輔助作用下用鹽酸萃取的,通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)證明, 提取過程中汞沒有發(fā)生形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化因此選擇鹽酸作為萃取劑來提取。常用的絡(luò)合劑主要有L-半胱氨酸和硫脲，本實(shí)驗(yàn)選擇L-半胱氨酸。

2.2 試驗(yàn)條件優(yōu)化

含有汞的樣品在超聲提取時(shí)，隨著超聲產(chǎn)熱，水溫逐漸升高，汞化合物極易揮發(fā)，所以，在水中可加入冰塊來控制水溫上升或者采用可以制冷的超聲儀進(jìn)行超聲提取。在用氫氧化鈉溶液調(diào)樣品pH值時(shí)，因樣品預(yù)處理加入的鹽酸和調(diào)pH值用的氫氧化鈉發(fā)生中和反應(yīng)會迅速升溫，導(dǎo)致汞化合物揮發(fā)檢測結(jié)果偏低。因此樣品在調(diào)pH值時(shí)需在冰浴下進(jìn)行，邊加氫氧化鈉邊震蕩混勻讓產(chǎn)生的熱釋放到冰水混合物中。加標(biāo)回收試驗(yàn)證明，溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響比較大，控制前處理溫度至關(guān)重要。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

由于有機(jī)汞是劇毒品，本實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)系列范圍確定低濃度0～10 μg·L-1，實(shí)驗(yàn)證明，滿足檢測要求。分別吸取1 μg·mL-1的甲基汞、乙基汞和汞混標(biāo)溶液0, 20, 40, 60, 80, 100 μL于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成濃度分別為0、2、4、6、8、10 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列，吸取100μL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測定，分別以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以甲基汞、乙基汞和二價(jià)汞的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以10倍信噪比計(jì)算檢出下限。線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出下限見表1。

表1 方法的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢出下限

2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)和精密度

分別向奶粉樣品中加入質(zhì)量濃度為2.0、6.0、10.0 μg·L-13種不同形態(tài)的汞標(biāo)化合物進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平行測定6次，得到加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表2。甲基汞的加標(biāo)回收率為94.7%～103.5%，乙基汞為95.6%～107.0%，二價(jià)汞為90.8%～109.3%，表明該方法測定準(zhǔn)確度較高。甲基汞的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.76%～3.63%，乙基汞為1.94%～2.52%，二價(jià)汞為3.79%～7.07%，表明甲基汞和乙基汞穩(wěn)定性比較好，二價(jià)汞穩(wěn)定性欠缺，可能和二價(jià)汞易揮發(fā)的性質(zhì)相關(guān)。

表2 奶粉樣品加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.5 方法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

采用 HPLC-AFS 法對質(zhì)控樣品GBW08308湖底沉積物中不同形態(tài)汞的含量進(jìn)行測定, 檢測得甲基汞的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.02 μg·kg-1（湖底沉積物質(zhì)控樣品證書中甲基汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.2±0.7μg·kg-1），測得值與證書中中位值基本吻合，從而驗(yàn)證了本方法具有較高的準(zhǔn)確性。

2.6 實(shí)際樣品檢測實(shí)驗(yàn)

采用 HPLC-AFS 法對20份奶粉、10份輔食樣品中不同形態(tài)汞的含量進(jìn)行測定, 其中輔食樣品中有1份深海鱈魚腸檢出甲基汞的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.65 μg·kg-1, 乙基汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.86 μg·kg-1, 二價(jià)汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2.59 μg·kg-1，用全自動(dòng)測汞儀測定總汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.0 μg·kg-1。不同形態(tài)汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(3種形態(tài)汞質(zhì)量濃度均為6.0 μg·L-1)的測定圖譜如圖1 所示, 深海鱈魚腸樣品的測定圖譜如圖2 所示。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)運(yùn)用 HPLC-AFS 法對嬰幼兒奶粉以及輔食中不同形態(tài)的汞含量進(jìn)行測定, 建立了嬰幼兒奶粉以及輔食中不同形態(tài)汞的提取、分離方法, 通過對質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)樣GBW08308湖底沉積物中的不同形態(tài)汞進(jìn)行檢測, 其中甲基汞檢測結(jié)果和證書中甲基汞的值很接近，該方法操作簡便快捷、準(zhǔn)確度很高、重復(fù)性很好, 適合用于對嬰幼兒奶粉以及輔食中不同形態(tài)汞以及總汞含量的檢測。實(shí)際樣品檢測得出，奶粉樣品未檢出總汞和有機(jī)汞，說明嬰幼兒奶粉質(zhì)量有一定的保障，不管是國產(chǎn)的還是進(jìn)口的均未出現(xiàn)超標(biāo)樣品。

圖1 HPLC-AFS法測定混和標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 HPLC-AFS法測定深海鱈魚腸色譜圖

雖然檢出率不高，奶粉未檢出，但是嬰幼兒乳制品重金屬污染物限量指標(biāo)的國家標(biāo)準(zhǔn)缺失，對于乳制品生產(chǎn)企業(yè)監(jiān)管難度會加大，乳制品生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量完全靠自律，嬰幼兒奶粉質(zhì)量安全方面的問題存在一定的隱患。呼吁制定嚴(yán)格詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)才能應(yīng)對防不勝防的乳品安全質(zhì)量問題。

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Determination of Different Forms of Mercury in Infant Milk Powder and Complementary Food by High Performance Liquid Chromatography-Atomic Fluorescence Spectrometry

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（Nantong Center for Disease Control and Prevention, Nantong Jiangsu 226007, China）

High-performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry was used to determine the different forms of mercury in infant formula and complementary foods.The sample was extracted by ultrasonic shaking with an ice bath, and then centrifuged to separate the sample solution. The separated supernatant was adjusted to pH with sodium hydroxide solution, passed through a membrane and pretreated by a spectrometer, and separated by high performance liquid chromatography. At last, it was detected with the atomic fluorescence spectrometer. The linear range of the three standard mercury profiles of methylmercury,ethylmercury and divalent mercury was 0～10 μg·L-1;The correlation coefficient was greater than 0.99;The detection limits were 0.51,0.50,0.52 μg·L-1,respectively;The average spike recovery was 90.8%～109.3%;The RSD was 1.76%～7.07%. The precision,accuracy and linearity of the method are satisfactory. It is suitable for the determination of mercury content in infant formula and food supplement.

High performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry; Infant formula and complementary food; Morphology mercury

南通市科技局（項(xiàng)目編號：YYZ17092；MS12017018-6）。

2021-11-26

楊娟（1985-），女，河南省項(xiàng)城市人，工程師，碩士，2013年畢業(yè)于揚(yáng)州大學(xué)學(xué)校分析化學(xué)專業(yè)，研究方向：理化檢驗(yàn)技術(shù)。

戴志英（1967-），女，高級工程師，研究方向：理化檢驗(yàn)技術(shù)。

TQ462.24

A

1004-0935（2022）03-0434-04