劉開強，李孝瓊，韋 宇，陳 穎，王小姣，李林娟，郭嗣斌

(廣西農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點實驗室，南寧 530007)

【研究意義】水稻是我國的主要糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)對保障我國糧食安全至關重要[1-2]。螟蟲(二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等)是水稻的主要害蟲，對世界水稻生產(chǎn)造成的損失巨大，其中，二化螟在我國稻區(qū)分布較廣，年防治面積達1500萬hm2，年防治費用約6.5億美元，年產(chǎn)值損失8.4億美元[3-4]。使用化學殺蟲劑防治螟蟲效果雖然較好，但耗費巨大，而且還會造成環(huán)境污染，其農(nóng)藥殘留甚至威脅人類健康。培育抗螟蟲水稻新品種是最經(jīng)濟有效的水稻螟蟲防治措施，可在提高水稻產(chǎn)量的同時保護生態(tài)環(huán)境安全[5]。但我國的水稻品種資源多為低抗或中抗螟蟲材料，抗性低且不穩(wěn)定，高抗螟蟲品種資源較少，采用常規(guī)雜交育種方法很難培育出抗螟蟲水稻品種，而利用轉(zhuǎn)基因技術改良水稻抗蟲性已成為抗蟲育種的新方法[6]。在前人研究基礎上，以轉(zhuǎn)Bt基因水稻材料為供體與農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻品系雜交、回交及多代自交，通過分子標記輔助選擇(Molecular marker-assisted selection，MAS)技術結(jié)合田間農(nóng)藝性狀篩選，是選育兼具優(yōu)良農(nóng)藝性狀和抗蟲新品種的有效途徑[7-10]。因此，通過MAS技術進行抗螟蟲水稻新恢復系選育，對我國雜交稻抗性育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】MAS可有效縮短育種周期和提高育種效率，在水稻、玉米和小麥等糧食作物及多種經(jīng)濟作物上已廣泛應用[11-12]。蘇云金芽孢桿菌(Baclillusthuringiensis)蛋白(Bt蛋白)對鱗翅目昆蟲具有專一毒性，對人類無毒害作用。Fujimoto等[13]利用轉(zhuǎn)基因技術將cryIA(b)基因轉(zhuǎn)入粳稻，并使crylA(b)蛋白成功表達，從而培育出抗螟蟲粳稻品種。Cheng等[14]通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化獲得2600個轉(zhuǎn)cryIA(b)和cryIA(c)基因水稻植株，并已證實這些基因能在R0和R1代中整合、表達和遺傳。Tu等[15]在Bt明恢63植株中檢測到Bt融合蛋白cryIA(b)/cryIA(c)含量為20.0 ng/mg；對轉(zhuǎn)基因雜交組合Bt汕優(yōu)63進行田間卷葉蟲和黃莖螟抗性試驗，發(fā)現(xiàn)在不降低水稻產(chǎn)量的情況下，轉(zhuǎn)基因雜交稻高抗卷葉蟲和黃莖螟。Wang等[16]利用轉(zhuǎn)Bt基因水稻品系KMD1和KMD2與常規(guī)水稻品種雜交，并鑒定其后代F1、BC1和F2群體具有抗蟲遺傳性，其中Bt水稻對螟蟲的抗性為顯性遺傳，易于在雜交水稻生產(chǎn)中利用。高方遠等[17]將優(yōu)質(zhì)抗稻瘟病水稻恢復系成恢177與轉(zhuǎn)基因水稻Bt明恢63雜交并回交1次，采用PCR分析、試紙條檢測和田間抗性鑒定相結(jié)合的方法，育成兼具轉(zhuǎn)基因抗蟲性和稻瘟病抗性的水稻新恢復系Bt5198。李榮田等[18]、孔夢瑩等[19]以水稻空育131為受體，利用根瘤農(nóng)桿菌介導法創(chuàng)制了轉(zhuǎn)cry1C*和cry2A*基因的抗蟲水稻獨立系，并對不同生長發(fā)育階段Bt基因表達量進行了測定。隨著對轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻研究的深入，我國于2009年11月通過了對轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻華恢1號和Bt汕優(yōu)63的生物安全認證，轉(zhuǎn)Bt基因抗螟蟲水稻技術已日趨成熟。華中農(nóng)業(yè)大學已成功將多個Bt基因(cry1Ab/c、cry1C*和cry2A*)導入生產(chǎn)上大面積推廣應用的三系雜交稻恢復系明恢63中，并篩選出標記基因已經(jīng)丟失的抗蟲恢復系材料TT51，以其配組的雜交組合抗蟲1號和抗蟲2號已完成在多個省市的生產(chǎn)性試驗[20-21]。崔海瑞等[22]已育成對二化螟、三化螟和稻縱卷螟等鱗翅目害蟲具100%抗性的克螟稻，以此為種質(zhì)初步育成具有推廣前景的大批秈稻新品系和新組合，并開始較大面積示范。實踐證明，以轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻材料為供體，以農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻品系為受體，通過MAS技術結(jié)合農(nóng)藝性狀篩選，可選育出兼具優(yōu)良農(nóng)藝性狀和抗蟲的新品系，這些抗蟲新品系均能穩(wěn)定遺傳Bt抗蟲基因，并能成功表達Bt蛋白，且具有與供體親本相當?shù)目瓜x能力[20-22]。【本研究切入點】近年來廣西水稻螟蟲發(fā)生面積不斷增加，危害加重，造成產(chǎn)量損失增大，某些地區(qū)局部爆發(fā)螟蟲危害產(chǎn)量損失達50%甚至絕收，而目前針對廣西抗螟蟲雜交稻恢復系選育的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過雜交、回交結(jié)合MAS技術將轉(zhuǎn)Bt基因水稻中的抗蟲基因cry1C*導入廣西骨干恢復系中，培育適合廣西稻區(qū)推廣應用的抗螟蟲轉(zhuǎn)基因水稻恢復系，為雜交水稻抗蟲育種提供參考依據(jù)及基礎材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017—2020年在廣西南寧市進行。含抗蟲基因cry1C*和與目標基因連鎖的抗除草劑基因(bar基因)的抗螟蟲轉(zhuǎn)基因材料T1C-19由華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室提供。其他水稻材料包括廣西雜交稻骨干恢復系親本廣恢998、桂恢1561和桂恢110，以及利用這些恢復系回交轉(zhuǎn)育而成的抗螟蟲轉(zhuǎn)基因恢復系材料KH998、KH1561和KH110均由廣西農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所分子育種研究室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗螟蟲材料回交轉(zhuǎn)育 以轉(zhuǎn)基因材料T1C-19為供體，以廣西雜交稻骨干恢復系親本廣恢998、桂恢1561和桂恢110為輪回親本進行1次雜交、3次回交和連續(xù)8次自交，結(jié)合MAS和抗蟲鑒定獲得抗螟蟲轉(zhuǎn)基因恢復系材料KH998、KH1561和KH110。

1.2.2 抗螟蟲材料及雜交組合的農(nóng)藝性狀考查和抗蟲性鑒定 2017年晚季配制雜交組合野香A/KH998和天豐A/KH998，2018年早季以特優(yōu)63為對照(CK1)種植抗蟲轉(zhuǎn)基因雜交組合野香A/KH998和天豐A/KH998。2020年早季配制雜交組合華浙2A/KH110、天豐A/KH1561、華浙2A/KH1561和天豐A/KH110，2020年晚季以天優(yōu)華占為對照(CK2)種植抗蟲轉(zhuǎn)基因雜交組合華浙2A/KH1561、華浙2A/KH110、天豐A/KH1561和天豐A/KH110。試驗設2次重復，每份材料種5行，每行種10株，種植密度為18.9 cm×16.5 cm。收獲時，取行中間8株考察株高、每株有效穗數(shù)、穗長、每穗實粒數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重和單株重等性狀，取8株的平均值作為分析數(shù)據(jù)。

采用室內(nèi)離體接蟲鑒定法結(jié)合室外自然鑒定法進行轉(zhuǎn)基因材料抗蟲鑒定。室內(nèi)離體接蟲鑒定法具體操作如下：于拔節(jié)期從稻株上取莖稈，切成5.0 cm長的莖段，放入養(yǎng)蟲管，每管放5個莖段，接入20頭一齡三化螟，置于人工氣候箱，5 d后統(tǒng)計三化螟死亡率，3次重復。

1.2.3 抗螟蟲材料的分子標記鑒定 水稻全基因組DNA通過改良CTAB法[23]抽提獲取。根據(jù)cry1C*基因的序列設計引物檢測水稻基因組DNA中是否含有該基因。參考Tang等[24]的方法進行PCR擴增，擴增引物為F：5′-TTCTACTGGGGAGGACATCG-3′，R：5′-CGGTATCTTTGGGTGATTGG-3′，擴增片段長度為602 bp。PCR反應體系20.0 μL：DNA模板30～50 ng，10×Buffer 2.0 μL，2 mmol/L dNTP 1.5 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，10 μmol/L引物(F/R)各0.5 μL，加ddH2O至20.0 μL；擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

根據(jù)bar基因序列設計引物檢測水稻基因組DNA是否含有該基因。PCR擴增引物為F：5′-GGGTCTAGAATGGAGCCCAGAACGACGCCG-3′，R：5′-GCTCGGGATCCTCAGATCTCGGTGACG-3′，擴增片段長度為561 bp。PCR反應體系20.0 μL：DNA模板50 ng，10×Buffer 2.0 μL，2 mmol/L dNTP 1.5 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，10 μmol/L引物(F/R)各0.5 μL，Taq酶1 U，加ddH2O至20.0 μL；擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 抗螟蟲材料殺蟲蛋白含量檢測 于黃熟期取參試材料的新鮮綠色葉片檢測殺蟲蛋白表達量，參照cry1C平板試劑盒(美國Envirologix公司)說明進行檢測。具體方法如下：稱取20.0 mg水稻新鮮葉片，用試劑盒隨帶的抽提液進行研磨抽提，在酶標儀450 nm處讀取吸光度值，繪制標準曲線，計算樣品中的Bt蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗螟蟲轉(zhuǎn)基因恢復系的選育歷程

抗螟蟲轉(zhuǎn)基因恢復系的選育過程見圖1。以骨干恢復系(廣恢998、桂恢1561和桂恢110)為母本，與T1C-19進行雜交，獲得F1代雜種。種植F1植株，根據(jù)株葉形態(tài)特征去除假雜種，選擇真雜種作父本與輪回親本(骨干恢復系)進行回交，獲得BC1F1代種子。種植BC1F1植株，移栽后逐株取葉片進行MAS，選取檢測結(jié)果為陽性的植株為父本與輪回親本繼續(xù)進行回交，獲得BC2F1種子；同樣在BC2F1中選取陽性單株繼續(xù)回交獲得BC3F1，最終根據(jù)分子標記檢測和農(nóng)藝性狀考察結(jié)果，在BC3F1中收獲10～20株陽性植株，收取自交種。將收獲的10～20株陽性BC3F2群體各種植100苗，結(jié)合分子標記檢測結(jié)果和農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，最后在15個群體中選擇30個Bt陽性單株收種。種植來自BC3F2的30個BC3F3株系，每個株系50苗，苗期逐株進行PCR檢測，篩選出10個Bt基因純系。10個Bt基因純系田間自然鑒定均無螟蟲發(fā)生，根據(jù)農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，選擇與輪回親本差異最小的株系，再經(jīng)過連續(xù)5代自交穩(wěn)定后，正式定名。通過此方法選育出與廣西雜交稻骨干親本廣恢998、桂恢1561和桂恢110分別對應的抗螟蟲轉(zhuǎn)基因恢復系材料KH998、KH1561和KH110。

圖1 抗螟蟲轉(zhuǎn)基因恢復系KH998的選育過程Fig.1 Breeding process of insect-resistant restorer line KH998

2.2 抗螟蟲轉(zhuǎn)基因恢復系及其雜交組合的性狀表現(xiàn)

2016年早季種植KH998、KH1561和KH110及其原始親本廣恢998、桂恢1561和桂恢110，以T1C-19為對照(CK3)，考查農(nóng)藝性狀表現(xiàn)。由表1可知，KH998、KH1561和KH110與對應的原始親本相比，均對螟蟲具有抗性，且抗性與CK3相當；在農(nóng)藝性狀方面較其對應的原始親本有所改善，如KH998、KH1561和KH110的千粒重均低于CK3，KH1561的千粒重比其原始親本桂恢1561變??；而KH998和KH110的千粒重較其相應原始親本的千粒重分別增加1.40和3.40 g，產(chǎn)量優(yōu)勢變大。

表1 T1C-19衍生品系的農(nóng)藝性狀和抗螟蟲表現(xiàn)

2018年早季和2020年晚季種植抗螟蟲轉(zhuǎn)基因雜交組合、親本、CK1和CK2，收獲后考查其農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，結(jié)果(表2)表明，天豐A/KH110表現(xiàn)抗蟲，其產(chǎn)量比CK2增加1.29%；野香A/KH998和天豐A/KH998表現(xiàn)抗蟲，但產(chǎn)量比CK1分別減產(chǎn)8.69%和0.49%；華浙2A/KH1561、天豐A/KH1561和華浙2A/KH110表現(xiàn)抗蟲，但產(chǎn)量比CK2分別減產(chǎn)1.89%、3.24%和5.56%。

表2 T1C-19衍生品系雜交組合的農(nóng)藝性狀和抗螟蟲表現(xiàn)

2.3 抗螟蟲轉(zhuǎn)基因恢復系分子標記檢測結(jié)果

水稻移栽返青后，在KH998、KH1561和KH110及其原始親本廣恢998、桂恢1561和桂恢110中分別隨機選取10株的葉片抽提基因組DNA作模板，分別用于與cry1C*基因和bar基因?qū)奶禺愐镞M行PCR擴增，cry1C*基因在KH998、KH1561和KH110中均能擴增出長度為602 bp的片段，而在陰性對照廣恢998、桂恢1561和桂恢110中無條帶顯示(圖2)；bar基因在KH998、KH1561和KH110中均擴增出長度為561 bp的片段，而在陰性對照中無條帶顯示(圖3)。說明抗蟲基因cry1C*和耐除草劑基因bar均已轉(zhuǎn)入受體親本中，并能在受體親本中穩(wěn)定遺傳。

M：DNA Marker；1：T1C-19(陽性對照)；2～7分別為KH998、廣恢998 (陰性對照)、KH1561、桂恢1561(陰性對照)、KH110和桂恢110 (陰性對照)的單株；目標產(chǎn)物片段為602 bpM：DNA Marker；1：T1C-19(positive control)；2-7 were the individual plants of KH998，Guanghui 998 (negative control)，KH1561，Guihui 1561(negative control)，KH110 and Guihui 110(negative control)；the target product size fragment was 602 bp圖2 KH998、KH1561和KH110的cry1C*基因PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR detection results of cry1C*gene in KH998，KH1561 and KH110

M：DNA Marker；1：陰性對照；2：T1C-19(陽性對照)；3～5分別為KH998、KH1561和KH110 的單株；目標產(chǎn)物片段為561 bpM：DNA Marker；1：Negative control；2：T1C-19(positive control)；3-5 were the individual plants of KH998，KH1561 and KH110；The target product size fragment was 561 bp圖3 KH998、KH1561和KH110的bar基因PCR檢測結(jié)果Fig.3 PCR detection results of bar gene in KH998，KH1561 and KH110

2.4 抗螟蟲恢復系的殺蟲蛋白含量檢測與分析

在KH998、KH1561和KH110的單株中各隨機選擇30個單株，測定其Bt蛋白的表達量(Bt蛋白含量)，結(jié)果(圖4)顯示，在3個群體中，Bt蛋白含量最大值為1.70 μg/g FW，最小值為0.02 μg/g FW，平均為0.77 μg/g FW，單株間Bt蛋白含量存在較大差異；KH998的Bt蛋白含量較總體水平偏低，平均為0.24 μg/g FW，且個體間差異不明顯，說明該抗性群體的Bt蛋白能穩(wěn)定表達；KH1561的Bt蛋白含量平均為0.65 μg/g FW，且個體間差異不明顯，說明該抗性群體的Bt蛋白也能穩(wěn)定表達；KH110的Bt蛋白含量較總體水平偏高，平均為1.41 μg/g FW，個體間差異較明顯(0.02～1.70 μg/g FW)，說明該抗性群體的Bt蛋白表達不夠穩(wěn)定。

KH998：1～30；KH1561：31～60；KH110：61～90圖4 抗性植株中cry1C*殺蟲蛋白含量檢測結(jié)果Fig.4 Detection of cry1C*insecticidal protein content in resistant plants

3 討 論

前人研究認為，培育抗螟蟲水稻新品種才是最經(jīng)濟有效的水稻螟蟲防控措施[5]，但我國水稻種質(zhì)資源中抗螟蟲材料較少，采用常規(guī)育種方法很難培育出抗螟蟲水稻品種，而以轉(zhuǎn)Bt基因水稻材料為供體，通過MAS技術結(jié)合農(nóng)藝性狀篩選，是選育抗螟蟲水稻品種的有效途徑[17，20-21]。

已有研究表明，在通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的基礎上，借助MAS和回交育種手段可改良轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻中的一些不良性狀，選育出既具有高抗螟蟲又高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)特性的水稻新品種或品系[25-27]，如高方遠等[17]將優(yōu)質(zhì)抗稻瘟病水稻恢復系成恢177與轉(zhuǎn)基因水稻Bt明恢63雜交并回交1次，采用PCR分析、試紙條檢測和田間抗性鑒定相結(jié)合的方法，育成兼具轉(zhuǎn)基因抗蟲性和稻瘟病抗性的水稻新恢復系Bt5198；劉艷等[20]將轉(zhuǎn)基因水稻Bt明恢63與水稻三系恢復系先恢207雜交并回交1次，采用PCR分析和田間抗性鑒定相結(jié)合的方法，育成抗螟蟲水稻新恢復系；田雨等[21]以轉(zhuǎn)基因水稻Bt明恢63為供體，以水稻品種9311為受體，利用MAS技術對9311的螟蟲抗性進行改良，進一步篩選出抗螟蟲雜交稻組合。這些利用MAS技術進行的水稻抗螟蟲育種，既減少了煩瑣的遺傳轉(zhuǎn)化工作，又能為轉(zhuǎn)基因抗蟲育種提供更多優(yōu)良的親本材料。本研究以T1C-19為抗蟲基因供體，通過回交轉(zhuǎn)育結(jié)合MAS技術育成的抗螟蟲恢復系KH998、KH1561和KH110，均能穩(wěn)定遺傳cry1C*基因，能成功表達Bt蛋白，且具有與供體親本T1C-19相當?shù)目瓜x能力，能有效抵御螟蟲危害，且農(nóng)藝性狀與原始親本廣恢998、桂恢1561和桂恢110相近，所配制的雜交組合野香A/KH998、天豐A/KH998、華浙2A/KH1561、華浙2A/KH110、天豐A/KH1561和天豐A/KH110也具有與供體親本T1C-19相當?shù)目瓜x能力，但產(chǎn)量與對照相當或減產(chǎn)，分析其產(chǎn)量優(yōu)勢不強的原因，一方面選用的都是小粒型、米質(zhì)優(yōu)的不育系，所配制雜交組合的千粒重明顯較對照偏低，因此產(chǎn)量優(yōu)勢不明顯，另一方面也說明雜交組合的特殊配合力不高，下一步需加強雜交組合優(yōu)勢選育方面的研究，在兼顧米質(zhì)的同時提高產(chǎn)量。

利用MAS和回交育種技術選育的抗螟蟲水稻新品系，其抗螟蟲性狀均得到顯著提高，表現(xiàn)抗蟲[17-20]，但Bt蛋白在不同材料中的表達量不一致，有的能穩(wěn)定表達，有的表達量差異較明顯。本研究育成的3個抗螟蟲恢復系中，KH998和KH1561的Bt蛋白含量在個體間差異不明顯，說明Bt蛋白能穩(wěn)定表達；而KH110的Bt蛋白含量個體間差異較明顯(0.02～1.70 μg/g FW)，說明該抗性群體的Bt蛋白表達不夠穩(wěn)定，與田雨等[21]在育成具有9311背景的抗蟲水稻品種時獲得同一時期單株間Bt蛋白含量存在較大差異的研究結(jié)果相似。可見，通過轉(zhuǎn)育獲得的抗螟蟲水稻新品系均表現(xiàn)抗蟲，但Bt蛋白的表達量可能不一致。因此，在轉(zhuǎn)育抗螟蟲水稻新品系時，在獲得穩(wěn)定抗蟲性新材料后，建議對其進行Bt蛋白含量的單株測定，以獲取Bt蛋白能穩(wěn)定表達的株系。

4 結(jié) 論

通過回交轉(zhuǎn)育結(jié)合MAS育成的3個抗螟蟲轉(zhuǎn)基因恢復系KH998、KH1561和KH110均可穩(wěn)定遺傳cry1C*基因，成功表達Bt蛋白，且具有與供體親本T1C-19相當?shù)目瓜x能力。