鄭勝蘭 耿士偉 賈書靜 尹原妍 吳瓊

(江蘇省畜產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心，江蘇 南京 210036)

洛克沙胂是一種易溶于極性有機溶劑和堿性溶液的有機砷制劑，用于豬和雞的促生長。其可增強機體同化作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，增強骨髓的造血機能，改善皮膚營養(yǎng)，改善胴體品質(zhì)，提高飼料報酬[1-3]。經(jīng)過動物代謝，洛克沙胂大多數(shù)仍會以洛克沙胂的形式排出體外，但是研究表明,在微生物、礦物和光解等條件作用下，洛克沙胂會轉(zhuǎn)化成無機砷，造成環(huán)境二次污染[4-10]。為保障動物產(chǎn)品質(zhì)量安全，維護(hù)公共衛(wèi)生安全和生態(tài)安全,2018年1月發(fā)布農(nóng)業(yè)部第2638號公告，禁止在食品動物中使用洛克沙胂。

洛克沙胂的禁用對飼料中洛克沙胂的檢測靈敏度有了更高的要求。目前，飼料中洛克沙胂的檢測遵循的是禁令頒布前的國標(biāo)《GB/T 22146-2008飼料中洛克沙胂的測定高效液相色譜法》，該檢測方法為高效液相法，方法的定量限為5mg·kg-1。顯然，該標(biāo)準(zhǔn)已無法適應(yīng)當(dāng)前檢驗的需求，亟需建立一個靈敏度更高，檢出限更低的方法。文獻(xiàn)報道的洛克沙胂的測定方法有高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜-電感耦合等離子體-串聯(lián)質(zhì)譜法等[11-13]。因此，本文以配合飼料為研究對象，建立了洛克沙胂的高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法，并且針對樣品的前處理方法進(jìn)行了較深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇(色譜純，德國默克公司)；乙腈(色譜純，德國默克公司)；甲醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲酸(色譜純，美國ACS公司)；氨水(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)品(98.5%，購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配備電噴霧離子源，美國ThermoFisher公司)；MAX固相萃取小柱(150mg·6mL-1，美國Waters公司)；振蕩器(德國IKA公司)；微孔濾膜(0.22μm，美國PALL公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品提取

稱取試樣2g(精確至0.01g)，置于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入20.00mL甲醇，振蕩提取20min，10000r·min-1離心10min，取上清液5.00mL于試管中，加入0.5mL氨水，混勻備用。

1.3.2 樣品凈化

固相萃取小柱用5mL甲醇活化，取備用液過柱，依次用5mL水和5mL甲醇淋洗，抽干。用15%甲酸甲醇溶液5mL洗脫，收集洗脫液，于60℃水浴下氮吹至干，0.1%甲酸-甲醇水溶液2.00mL溶解，混勻,0.22μm濾膜過濾后上機測試。

1.3.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列曲線的制備

稱取洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)品50mg(精確至0.01mg)，用甲醇溶解定容于50mL容量瓶中得1mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再以含有0.1%甲酸的10%甲醇溶液稀釋定容配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為5ng·mL-1、10ng·mL-1、25ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1、200ng·mL-1。稱取同類基質(zhì)的空白樣品6份，按1.3.1步驟處理至氮吹至干，分別加入2.00mL上述標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，混勻，制得理論濃度為5ng·mL-1、10ng·mL-1、25ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1、200ng·mL-1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，過膜后上機測試。在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行測定，以洛克沙胂的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 液相色譜參考條件

色譜柱：C18柱,3.0mm×150mm，粒徑1.8μm，或性能相當(dāng)者；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.5 質(zhì)譜參考條件

電離方式：電噴霧電離；掃描方式：負(fù)離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓、碰撞能量等參數(shù)應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度；定性離子對、定量離子對及碰撞能量參考值見表2。

表2 洛克沙胂的定性離子對、定量離子對及碰撞能量參考值

1.3.6 檢出限和定量限

選取空白基質(zhì)，向其中加入一定濃度的洛克沙胂對照品，按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行測定，依據(jù)信噪比(s/n)≥3及信噪比(s/n)≥10的原則，確定本方法的檢出限和定量限。

1.3.7 方法回收率測定

稱取不同基質(zhì)的試樣2g(精確至0.01g)，置于50mL離心管中，加入洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)溶液，使洛克沙胂在飼料中的添加量為0.05mg·kg-1、0.2mg·kg-1和0.5mg·kg-1，按樣品前處理方法處理樣品后上機測定。以洛克沙胂的色譜峰面積代入回歸方程計算方法回收率。

1.3.8 精密度測定

樣品處理及測定方法同1.3，每個添加水平作6份平行測定，求得日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差；選取洛克沙胂添加水平為0.2mg·kg-1的加標(biāo)樣，連續(xù)測定3d，求得日間標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的考察與確定

實驗對流動相進(jìn)行考察，當(dāng)使用甲醇作為流動相時，在相同的條件下，離子化將受到不同程度的抑制，響應(yīng)值將會明顯的降低，導(dǎo)致了靈敏度的下降，而使用乙腈作為流動相時，離子化效率明顯是要優(yōu)于甲醇，所以本實驗采用乙腈作為流動相中的有機相。在流動相中加入甲酸能夠明顯地增加化合物在ESI-模式下的離子化效率?？紤]到上樣溶液的有機相比例，起始流動相設(shè)為5%甲醇溶液(含0.1%甲酸)，考慮到飼料樣品基質(zhì)較復(fù)雜，實驗選擇梯度洗脫程序，洗脫程序見表3。

表3 液相梯度洗脫程序

參考優(yōu)化后的流動相，確定液相條件為色譜柱：C18柱，柱長150mm，內(nèi)徑3.0mm，粒徑1.8μm或者性能相當(dāng)；柱溫：30℃；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈；流速：0.3mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL。典型色譜圖見圖1。

2.2 監(jiān)測離子對的選擇及質(zhì)譜條件優(yōu)化

將100ng·mL-1的洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)溶液在質(zhì)譜ESI-上掃描，選出信號相對較強的2個碎片離子與其母離子分別組成2對監(jiān)測離子對，其中需要注意的是盡可能避免選擇與分子離子峰質(zhì)量數(shù)相差18的脫水碎片離子。在SRM模式下，實施對于透鏡電壓與碰撞能量等參數(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化。優(yōu)化過后得到的特征離子對和質(zhì)譜條件如表4所示，其定性分析標(biāo)準(zhǔn)為保留時間和選擇離子的豐度比，使得這個方法擁有更強的專屬性，并且有效地避免了來自雜質(zhì)的干擾。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離；掃描方式為負(fù)離子模式；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測。洛克沙胂的特征離子對及碰撞能量見表4。

表4 洛克沙胂的定性離子對、定量離子對及碰撞能量參考值

圖1 基于C18色譜柱的MRM色譜圖

2.3 提取劑的選擇

由于洛克沙胂易溶于甲醇和稀堿，在水中略溶解。通過實驗結(jié)果并參考相關(guān)文獻(xiàn)，選取甲醇、5%氨水甲醇、50%甲醇、10%甲醇、20g·L-1磷酸氫二鉀溶液共5種提取液，其中20g·L-1磷酸氫二鉀溶液為國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中洛克沙胂的測定高效液相色譜法》中的提取液。在0.2mg·kg-1的添加水平下加入20mL提取液考察實際樣品中目標(biāo)物的提取效率，結(jié)果如表5所示。

表5 不同提取劑提取效率考察表(n=5)

由表5可知，3種配合飼料在5種提取溶劑條件下，提取效率上沒有明顯差異。相比磷酸氫二鉀溶液，以甲醇為提取液所得到的上樣液更為澄清，過柱流暢不易堵。此外，將提取后的殘渣用甲醇進(jìn)行二次提取，未檢出洛克沙胂。因此，確定本實驗的提取液為甲醇，提取液體積為20mL。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

通過實驗發(fā)現(xiàn)，與文獻(xiàn)報道類似，MAX小柱更適合于洛克沙胂的凈化富集[14,15]。淋洗液和洗脫液的選擇和考察在筆者的論文中已有論述，不再贅述[16]。實驗選擇以MAX小柱為固相萃取柱，淋洗液為5mL水和5mL甲醇，洗脫液為15%甲酸甲醇溶液。并在此基礎(chǔ)上考察實際飼料樣品的凈化條件。

根據(jù)化合物的特質(zhì)和實驗表明，在有機相體系中，目標(biāo)物在堿性條件下能更好地保留在固定相上。在處理實際飼料樣品時發(fā)現(xiàn)，有部分飼料樣品經(jīng)甲醇提取后樣液的酸度較大，直接上柱后目標(biāo)物無法極好地保留到小柱上。

由筆者前期文章[16]淋洗液和洗脫液的考察實驗和結(jié)論表明，在有機相體系里，目標(biāo)物對洗脫液的酸度要求較為苛刻，以常規(guī)的5%甲酸甲醇溶液不能將目標(biāo)物從小柱上洗脫，反觀目標(biāo)物在堿化的有機相體系中較好地保留到小柱上的可能性較大。因此，考慮通過在樣品提取液中加入氨水的方式調(diào)節(jié)酸堿度以保證目標(biāo)物在小柱上的保留。

選取有代表性的3種飼料，分別稱取5份各2g，置于50mL離心管中，加入洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)溶液，使洛克沙胂在飼料中的含量為0.2mg·kg-1，準(zhǔn)確加入20.00mL甲醇，振蕩提取20min，離心10min，分別取上清液5.00mL于7個試管中，分別加入氨水0mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、1.0mL混勻后上柱按已確定淋洗液和洗脫液操作后吹干復(fù)溶上機。計算方法回收率所得結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，極少量氨水的加入對回收率的影響不大，當(dāng)氨水加入體積為0.5mL時，3種基質(zhì)的回收率表現(xiàn)均達(dá)到80%左右，繼續(xù)增加氨水的體積對實驗結(jié)果無影響，同時考慮到柱子的容積為6mL，確定樣液中加入氨水的體積為0.5mL。因此，確定飼料經(jīng)甲醇提取后樣液的凈化條件：取5mL上清液，加入0.5mL氨水混勻后上柱，分別用5mL水和5mL甲醇淋洗，最后用5mL的15%甲酸甲醇溶液洗脫。

圖2 3種基質(zhì)條件下氨水體積對回收率的影響

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

取不同基質(zhì)的飼料樣品，按已確認(rèn)的前處理方法步驟處理至氮吹至干，分別加入2mL濃度為25ng·mL-1和200ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻。制得理論濃度為25ng·mL-1和200ng·mL-1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，過濾膜后上機測試得到目標(biāo)物的峰面積，通過與25ng·mL-1或200ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的比值考察基質(zhì)效應(yīng)，所得結(jié)果如表6所示。

表6 不同飼料樣品的基質(zhì)效應(yīng)考察

實驗結(jié)果表明，目前確認(rèn)的前處理方法所獲得基質(zhì)溶液對目標(biāo)物洛克沙胂的質(zhì)譜響應(yīng)有一定的影響，因此選擇基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正定量。

2.6 飼料中洛克沙胂檢測的工作曲線、相關(guān)系數(shù)(r)、檢測限(LOD)

精密取適量洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)工作液，用0.1%甲酸-甲醇水溶液稀釋至洛克沙胂濃度為5ng·mL-1、10ng·mL-1、25ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1、200ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作溶液。稱取不同基質(zhì)的空白樣品各6份，按已確認(rèn)的前處理方法處理至氮吹至干，分別加入2mL上述標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，渦旋混勻。制得理論濃度為5ng·mL-1、10ng·mL-1、25ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1、200ng·mL-1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，過濾膜后在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以組分的峰面積對其質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性方程及相關(guān)系數(shù)，具體結(jié)果見表7。

表7 洛克沙胂的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

2.7 方法的檢出限和定量限

飼料基質(zhì)復(fù)雜，因此，本實驗選擇豬用配合飼料、雞用配合飼料、鴨用配合飼料分別作為考察對象。在上述空白飼料中添加一定濃度的洛克沙胂對照品，按照本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗。依據(jù)信號與噪聲比例，即s/n≥3的濃度為檢出限，s/n≥10的濃度為定量限的原則，確定了本方法的檢出限為0.02mg·kg-1，定量限為0.05mg·kg-1。典型圖譜見圖3～5。

圖3 空白豬用配合飼料色譜圖

圖4 豬用配合飼料檢出限添加濃度色譜圖

圖5 豬用配合飼料定量限添加濃度色譜圖

2.8 回收率和精密度

配合飼料中洛克沙胂測定的回收率和日間與日內(nèi)精密度見表8。實驗結(jié)果表明，在3種飼料基質(zhì)中，低、中、高3個添加水平的回收率在65.9%～75.2%。日內(nèi)測定的RSDintra(n=6)在3.5%～6.3%，日間測定的RSDinter(n=3)在4.3%～8.6%。

3 結(jié)論與討論

本文建立了配合飼料中洛克沙胂的測定方法，以甲醇為提取液，離心后取上清液經(jīng)氨水調(diào)節(jié)pH后過MAX小柱凈化，吹干后以含有0.1%甲酸的10%甲醇水溶液復(fù)溶后上LC-MS檢測，方法精密度高，回收率較好。相對于國標(biāo)方法，本方法極大地提高了檢測的靈敏度，獲得了較低的檢出限。前處理過程中增加了調(diào)節(jié)上柱液pH值的過程，對不同基質(zhì)的飼料有了更好的適用性，基本能夠完全滿足日常檢測的需求。除了洛克沙胂外，還有氨苯砷酸等其它有機砷制劑，下一步將基于目前的樣品前處理方法，開發(fā)適用于多種有機砷測定的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法，為動物產(chǎn)品質(zhì)量安全、公共衛(wèi)生安全和生態(tài)安全提供更加便捷的技術(shù)支撐。

表8 回收率和日內(nèi)、日間標(biāo)準(zhǔn)偏差