刁娟娟, 王婷婷, 李 莉*

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011; 2. 新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院, 新疆 烏魯木齊830017)

石墨烯量子點(diǎn)(Graphene quantum dots, GQDs)是由二維材料石墨烯衍生出來的零維材料，具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，在細(xì)胞成像[1]、分析檢測[2]、光電化學(xué)、生物傳感[3]、光催化等方法有良好的應(yīng)用前景。石墨量子點(diǎn)的合成方法主要分為自上而下法(Top-down synthetic route)和自下而上法(Bottom-up synthetic route)兩類[4]。自上而下法利用特殊的化學(xué)手段將石墨類材料剝離并剪切成石墨烯量子點(diǎn)，主要有電化學(xué)法、酸氧化法、溶劑熱法、微波分解法、電子束刻蝕等方法，但產(chǎn)物產(chǎn)率和熒光量子產(chǎn)率都較低，嚴(yán)重制約該方法的實(shí)際應(yīng)用[5]。自下而上法是通過分子前驅(qū)體來合成石墨烯量子點(diǎn)，主要有水熱法、熱解法、溶液化學(xué)法、熱解多環(huán)芳烴法、化學(xué)氣相法、富勒烯開籠法等[6]。這種方法易于調(diào)控石墨烯量子點(diǎn)的形貌和尺寸，從而克服了與自上而下的方法相應(yīng)的非選擇性問題。其中采用水熱法制備石墨烯量子點(diǎn)具有操作簡單、條件可控、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。石墨烯量子點(diǎn)的熒光特性容易受到其表面化學(xué)狀態(tài)的影響。表面摻雜化可調(diào)節(jié)石墨烯量子點(diǎn)電子結(jié)構(gòu)和表面化學(xué)特征，從而引起石墨烯量子點(diǎn)的光致發(fā)光強(qiáng)度和發(fā)射波長的變化，主要為氮元素、硫元素、硼元素、磷元素的摻雜，其中以氮元素最為常用[7-8]。在摻雜劑中，氮被認(rèn)為是石墨烯量子點(diǎn)中雜原子摻雜的極好候選者，因?yàn)榈优c碳原子大小相當(dāng)，并且氮原子的五個(gè)價(jià)電子可與碳原子形成強(qiáng)價(jià)鍵，從而提高熒光量子產(chǎn)率[9-10]。

摻雜型石墨烯量子點(diǎn)因具有良好的光學(xué)性能和生物相容性，合適的細(xì)胞膜滲透性和高穩(wěn)定性等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為體外和體內(nèi)成像研究的有力工具[11-12]。目前氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)已用于細(xì)胞成像[13-14]、體內(nèi)生物成像[7]、癌細(xì)胞診斷[15]、活體動物中深層腫瘤組織靶向成像[16]、細(xì)菌熒光標(biāo)記等研究中。

近年來因合成過程簡單且熒光量子產(chǎn)率高，檸檬酸已成為采用自下而上的碳化路線合成石墨烯量子點(diǎn)最常用的分子前驅(qū)體[17]。檸檬酸和胺可通過熱解法、水熱法或微波輔助法可制備氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)[18]。在本文中，以檸檬酸為碳源，乙二胺為氮源，通過一步水熱法合成出一種高熒光量子產(chǎn)率的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)，具有低毒性和良好的生物相容性，進(jìn)行細(xì)胞成像研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

檸檬酸購自天津盛奧化學(xué)試劑有限公司，乙二胺購自天津富宇精細(xì)化工有限公司，硫酸奎寧購自上海藍(lán)季生物，均為分析純。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽購自美國MP Biomedicals公司。

熒光分光光度計(jì)(RF-5301，日本島津)；紫外-可見分光光度計(jì)(UV2700，日本島津)；傅立葉變換紅外光譜儀(IRPrestige-21，日本島津)；透射電子顯微鏡(JEM123型，日本電子株式會社)；電子分析天平(AB-135S，梅特勒-托利多)；激光共聚焦顯微鏡(C2，日本尼康)；反應(yīng)釜(KH-25，上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司)；酶標(biāo)儀(1510，美國賽默飛世爾)。

1.2 氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)(N-GQDs)的制備

稱取0.21 g檸檬酸，向其中加入0.18 g乙二胺，劇烈攪拌混合后，定容到5 mL。將混合溶液轉(zhuǎn)移到25 mL的反應(yīng)釜中160 ℃下加熱4 h，然后冷卻至室溫后得到氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)(N-GQDs)。氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)合成的反應(yīng)原理見圖1。在檸檬酸的縮合反應(yīng)中有效地產(chǎn)生五元環(huán)稠和2-吡啶酮化合物，該化合物作為主要中間體在氫鍵的作用下自組裝成超分子聚集體，表現(xiàn)出光致發(fā)光的高熒光量子產(chǎn)率[20-21]。

圖1 N-GQDs合成的示意圖Fig.1 Schematic illustration of the synthesis of N-GQDs

1.3 細(xì)胞毒性檢測

通過細(xì)胞活性比色法(MTT法)檢測氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性。將長至對數(shù)期的Hela細(xì)胞用胰蛋白酶消化完成后得到混懸細(xì)胞，將細(xì)胞加至血球計(jì)數(shù)板上，用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)。通過反復(fù)調(diào)整細(xì)胞濃度，使細(xì)胞濃度在5×104/ mL，按1×104/ 孔接種至96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后用終濃度分別為0、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 mg/L N-GQDs溶液替代原來的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h以后，加入MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液150 μL，用酶標(biāo)儀測量570 nm處各孔的吸光度值。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞存活率，按以下公式(1)計(jì)算：

cellviability(%)=(ODtreated/ODcontrol)×100%

(1)

其中ODtreated表示加入N-GQDs的OD值，ODcontrol為沒有加入N-GQDs的空白培養(yǎng)液的OD值。

1.4 細(xì)胞成像

將長至對數(shù)期的HeLa細(xì)胞用胰蛋白酶消化完成后，得到細(xì)胞混懸液，用完全培養(yǎng)液稀釋，使細(xì)胞濃度在5×104/mL，在玻底皿中分別加入600 μL細(xì)胞，待細(xì)胞粘附后，再加入900 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，再加入500 mg/L N-GQDs 1 mL，培養(yǎng)24 h，PBS清洗2次，洗去沒有進(jìn)入細(xì)胞的N-GQDs，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光成像情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 N-GQDs制備影響因素考察

2.1.1 加熱時(shí)間的考察

對于脫水聚合反應(yīng)，加熱時(shí)間的長短對聚合程度有一定影響，為了探究制備過程中加熱時(shí)間對N-GQDs光致發(fā)光的影響，考察加熱時(shí)間為2、3、4、5、6 h時(shí)，N-GQDs的熒光量子產(chǎn)率的變化，見圖2(a)。隨著加熱時(shí)間的增加，熒光量子產(chǎn)率不斷增加，當(dāng)加熱時(shí)間為4 h時(shí)，石墨烯量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率最高，加熱時(shí)間較短時(shí)，檸檬酸與乙二胺的聚合反應(yīng)才開始，N-GQDs還沒有完全合成；而時(shí)間較長時(shí)，可能會發(fā)生完全的碳化聚合，量子點(diǎn)尺寸增大，生成的石墨烯較多而導(dǎo)致熒光量子產(chǎn)率降低。所以加熱4 h反應(yīng)得出的N-GQDs熒光量子產(chǎn)率最高，其把吸收的光轉(zhuǎn)化為熒光的能力最強(qiáng)。

2.1.2 加熱溫度的考察

加熱的溫度對于檸檬酸和乙二胺聚合的程度是有很大影響的，考察加熱溫度為140、150、160、180 ℃時(shí)，N-GQDs的熒光量子產(chǎn)率變化，見圖2(b)。溫度升高，增加了原材料檸檬酸和乙二胺脫水縮合的反應(yīng)速率，生成大量小尺寸的N-GQDs，但高溫下，小尺寸的N-GQDs又會聚合生成大尺寸的N-GQDs，熒光量子產(chǎn)率降低，因此選擇加熱的溫度為160 ℃。

2.1.3 反應(yīng)物加入量的考察

反應(yīng)物的加入量影響N-GQDs的熒光量子產(chǎn)率。考察反應(yīng)中檸檬酸(CA)與乙二胺(EDA)的物質(zhì)的量之比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5時(shí)，N-GQDs的熒光量子產(chǎn)率變化，見圖2(c)。隨著乙二胺的加入量增多，熒光量子產(chǎn)率先增加后減少，當(dāng)反應(yīng)物的物質(zhì)的量之比為1∶3時(shí)，熒光量子產(chǎn)率最大。

圖2 加熱時(shí)間(a)、加熱溫度(b)、檸檬酸與乙二胺的物質(zhì)的量之比(c)對熒光量子產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of reaction time(a), temperature(b), molar ratio of CA/EDA (c) on quantum yield

通過單因素對N-GQDs熒光量子產(chǎn)率的考察，得到最佳合成條件：合成N-GQDs時(shí)，加熱時(shí)間為4 h，加熱溫度為160 ℃，檸檬酸與乙二胺的物質(zhì)的量之比為1∶3，以硫酸奎寧為參比，計(jì)算得到N-GQDs的熒光量子產(chǎn)率為94%。

2.2 氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)表征

分別采用紫外-可見吸收光譜法、熒光光譜法、透射電子顯微鏡法對氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)進(jìn)行表征，研究石墨烯量子點(diǎn)的形貌及光學(xué)特性。

2.2.1 N-GQDs的紫外及熒光光譜圖分析

如圖3(a)所示，N-GQDs的紫外可見吸收光譜在350 nm處有一個(gè)特征吸收峰，歸因于C=O的n→π*躍遷，通過表面激發(fā)態(tài)的能量陷阱而產(chǎn)生強(qiáng)烈的發(fā)射，從熒光光譜圖中可以看出，N-GQDs最大激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為450 nm，在365 nm紫外燈下，橘黃色的N-GQDs呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光，說明該氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)具有很好的發(fā)光性質(zhì)，是一種高熒光量子產(chǎn)率的量子點(diǎn)。測定N-GQDs在不同激發(fā)波長(360、370、380、390、400、410、420 nm)下熒光譜圖，如圖3(b)所示。發(fā)現(xiàn)當(dāng)N-GQDs的激發(fā)波長變化時(shí)，發(fā)射波長不發(fā)生改變，N-GQDs表現(xiàn)出激發(fā)波長非依賴性的熒光行為。

圖3 (a) N-GQDs的紫外光譜、熒光光譜圖(內(nèi)側(cè)為在白光和紫外光365 nm下的對比)，(b)在不同波長下的熒光譜圖Fig.3 (a) The UV-Vis and fluorescence spectra of N-GQDs (the inside contrast between the whitelight and UV light 365 nm), (b) Emission spectra of the N-GQDs with excitation of different wavelengthes

2.2.2 N-GQDs的傅立葉紅外吸收光譜及透射電鏡圖

將N-GQDs溶液倒入蒸發(fā)皿中，水浴鍋上40 ℃揮發(fā)蒸干，得到N-GQDs固體，加入KBr進(jìn)行壓片后測定紅外光譜，N-GQDs的紅外光譜圖見圖4。檸檬酸經(jīng)過水熱反應(yīng)后，生成的N-GQDs結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，但還是保留了一些反應(yīng)物的官能團(tuán)，在2 930 cm-1及1 520 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰分別表示-CH2伸縮振動和-C=C的伸縮振動。在3 000-3 300 cm-1處有-NH的伸縮振動，在1 120 cm-1處有-CN的伸縮振動，說明N-GQDs中乙二胺和檸檬酸發(fā)生了脫水聚合。透射電鏡圖譜顯示N-GQDs的形狀呈規(guī)則的圓形，粒徑大小不一，粒徑范圍主要在20～40 nm之間，見圖5。

圖4 N-GQDs的紅外圖譜Fig.4 FTIR spectra of N-GQDs

圖5 N-GQDs的透射電鏡圖Fig.5 TEM of N-GQDs

2.3 TT法檢測氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性

隨著N-GQDs濃度的降低，細(xì)胞存活率增加，當(dāng)N-GQDs濃度降到500 mg/L以下時(shí)，細(xì)胞存活率依然保持在90%以上，說明當(dāng)N-GQDs的濃度達(dá)到500 mg/L時(shí)，依然具有良好的生物相容性，可以作為熒光探針應(yīng)用于生物體系中(見圖6)。

2.4 細(xì)胞成像

N-GQDs可成功實(shí)現(xiàn)HeLa細(xì)胞的熒光成像，且熒光標(biāo)記效果明顯。結(jié)果如圖所示，圖7(a)是明場條件下的細(xì)胞，圖7(b)為405 nm激發(fā)光后的熒光圖像，從圖中可以看出，攝取N-GQDs的HeLa細(xì)胞在405 nm激發(fā)波長下，發(fā)出藍(lán)光，N-GQDs成功地進(jìn)入細(xì)胞膜，沒有進(jìn)入細(xì)胞核。圖7(c)為明場和405 nm激發(fā)光下圖的疊加，可以清楚的看到，活細(xì)胞的膜內(nèi)有熒光，死細(xì)胞卻沒有，說明制備得到的N-GQDs可以標(biāo)記活細(xì)胞，但不能標(biāo)記死細(xì)胞。

圖6 MTT法檢測N-GQDs的細(xì)胞毒性Fig.6 Detection of cytotoxicity of N-GQDs by MTT method

圖7 HeLa細(xì)胞激光共聚焦圖片(a)明場, (b)激發(fā)波長為405 nm, (c)疊加場Fig.7 Confocal fluorescence microscopy images of HeLa cell (a) bright field, (b) excitation wavelength of 405 nm, (c) applied field

3 結(jié)論

進(jìn)行了氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)及其在細(xì)胞成像中應(yīng)用的研究。通過檸檬酸和乙二胺的水熱合成，制備氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)。合成方法具有簡單易行，綠色環(huán)保及產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)。因氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)具有良好的熒光特性和低細(xì)胞毒性，應(yīng)用于HeLa細(xì)胞熒光標(biāo)記，進(jìn)行細(xì)胞熒光成像。高熒光量子產(chǎn)率的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)可以作為一種很有前途的低毒性熒光標(biāo)記物，在生物成像方面有著巨大的潛力。氮摻雜型石墨烯量子點(diǎn)若進(jìn)一步功能化，結(jié)合激光共聚焦成像技術(shù)可成為檢測細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的有效手段，有望應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)多種活性分子的檢測。