康 忱 趙雪芳 王 鵬 李亞棟 田哲娟 吳志明

（河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河北石家莊 050051）

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成成分，具有生成分子內(nèi)與分子間氧鍵的能力。在植物體內(nèi)，纖維素構(gòu)成纖維素糖苷網(wǎng)，是承受機(jī)械壓力的支撐結(jié)構(gòu)，能夠調(diào)控植物形態(tài)學(xué)上的某些特性與特征（Joshi &Mansfield，2007）。細(xì)胞壁在植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要作用，因此纖維素合成機(jī)制的相關(guān)研究在多個(gè)學(xué)科中占有重要地位（Pauly &Keegstra，2010；Youngs &Somerville，2012）。纖維素由纖維素合成酶復(fù)合體合成，其單體主要由纖維素合成酶（cellulose synthase，CESA）基因家族成員編碼，纖維素合成酶負(fù)責(zé)植物纖維素的生物合成（Somerville，2006）。目前已從多種植物中克隆多個(gè)基因的相關(guān)序列，如擬南芥（）、煙草（）、水稻（）、毛果楊（）、四倍體海島棉（）和亞麻（）等（Richmond &Somerville，2000；Wang et al.，2010；袁紅梅 等，2016；Yuan et al.，2016；徐宗昌和孔英珍，2017）。在擬南芥中，初生壁纖維素合成需要纖維素合成酶AtCESA1、AtCESA3 和AtCESA6 的參與，三者組成纖維素合成酶復(fù)合體，次生壁纖維素合成需要AtCESA4、AtCESA7 和AtCESA8 的參與（Desprez et al.，2007；Atanassov et al.，2009；Hill et al.，2015）。纖維素合成酶的互作蛋白（cellulose synthase interactive protein 1，CSI1）和伴侶蛋白（companion of cellulose synthase，CC）是微管和纖維素合成酶復(fù)合體的相互作用中的主要成員，其中CC 蛋白具有在鹽脅迫條件下維持纖維素合成的作用（Gu et al.，2010；Endler et al.，2015）。擬南芥AtCESA5 的磷酸化則是光敏色素調(diào)控纖維素合成和下胚軸細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的重要機(jī)制（Chen et al.，2010，2016；Bischoff et al.，2011）。磷酸化蛋白組學(xué)方面的研究顯示，磷酸化修飾CESAs 能響應(yīng)植物生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境信號(hào)，調(diào)控由微管介導(dǎo)的纖維素合成的關(guān)鍵機(jī)制（Facette et al.，2013；Roitinger et al.，2015；Chen et al.，2016）。

黃瓜（L.）為葫蘆科一年生蔓生或攀援草本植物，是我國(guó)重要的蔬菜作物之一，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。2020 年我國(guó)黃瓜年種植面積達(dá)到100 萬(wàn)hm，年產(chǎn)量達(dá)到5 600 萬(wàn)t，占世界總產(chǎn)量的70%以上（FAO，http：//www.fao.org/）。在生產(chǎn)過程中，黃瓜經(jīng)常遭受各種非生物脅迫，例如低溫、高溫和鹽脅迫。低溫脅迫導(dǎo)致葉片發(fā)黃和生長(zhǎng)減慢，降低黃瓜的產(chǎn)量，特別是在冬季和早春（Dong et al.，2019）。高溫導(dǎo)致葉片曬傷和果實(shí)畸形，從而影響夏季黃瓜的產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)（于拴倉(cāng)和王永健，2003）。鹽脅迫降低了葉綠素含量和礦物質(zhì)吸收，從而影響了黃瓜的正常生長(zhǎng)發(fā)育（Yildirim et al.，2008）。植物激素在調(diào)節(jié)外界環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中很重要。脫落酸（ABA）信號(hào)傳導(dǎo)途徑是植物中鹽、干旱和低溫脅迫信號(hào)傳導(dǎo)的中心（Zhu，2016）。ABA 的生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)參與植物對(duì)低溫的響應(yīng)（Wang et al.，2019）。到目前為止，在黃瓜對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中，已經(jīng)對(duì)WRKY（Ling et al.，2011）、MADS（Hu &Liu，2012）、MLO（Zhou et al.，2013）、ARF（Liu &Hu，2013）、NAC（Liu et al.，2018）和GRAS（Li et al.，2020）等基因家族進(jìn)行了深入研究，但是，CESAs 作為植物生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)過程中的一個(gè)重要的基因家族，在黃瓜中還鮮見報(bào)道。目前纖維素合成酶基因家族的研究有較大進(jìn)展，但大多局限于擬南芥、煙草等模式植物和棉花、楊樹、亞麻、毛竹等木本植物中，黃瓜中絕大部分CESA家族成員未得到鑒定，隨著黃瓜基因組序列的公布和完善，對(duì)纖維素合成酶家族基因進(jìn)行全基因組挖掘和全面、系統(tǒng)的分析十分必要。本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法對(duì)黃瓜CESA 基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對(duì)它們的染色體位置、基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化分化特征以及物種間的共線性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。通過施加外源植物激素（ABA 和MeJA）和非生物脅迫（NaCl）處理，分析CESA 家族基因的表達(dá)模式，為更好地了解CESA 基因家族成員及其在黃瓜非生物脅迫響應(yīng)中的生物學(xué)功能提供依據(jù)，為進(jìn)一步探索該家族在黃瓜響應(yīng)非生物脅迫調(diào)節(jié)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

供試材料為河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所保存的黃瓜品系9930。2021 年3 月上旬將供試黃瓜材料播種于本所育苗溫室，選取兩葉一心時(shí)期的黃瓜幼苗，在塑料花盆中培養(yǎng)，第1 組用200 mmol·LNaCl 水培處理，第2 組用100 μmol·L的脫落酸（ABA）噴灑葉面，第3 組用100 μmol·L的茉莉酸甲酯（MeJA）噴灑葉面，第2 組和第3 組利用滅菌的營(yíng)養(yǎng)土和蛭石混合栽培。將所有處理放置于植物組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度為28 ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照周期為光16 h/暗8 h。分別在處理后0、3、6、12 h 和24 h 對(duì)葉片取樣，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存用于RNA 提取。每個(gè)處理采用3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 黃瓜纖維素合成酶基因家族成員的獲得與 鑒定

黃瓜基因組序列于2009 年完成（Huang et al.，2009）。從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)CuGenDB（Cucurbit Genomics Database，http：//www.cucurbitgenomics.org/organism/2）下載“黃瓜基因組9930_V2 版本”（9930 作為參考基因組）基因組數(shù)據(jù)。從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org/）獲得擬南芥CESA 基因家族的基因ID 和氨基酸序列信息。利用BioEdit 軟件，以e為臨界值選取候選CESA 基因，用本地Perl 語(yǔ)言提取候選基因蛋白序列，初步獲得CESA 基因家族成員。結(jié)合下載于Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pfam.xfam.org/）的CESA 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（PF03352，PF14569），使用Pfam 中的HMMScan 和PfamScan 對(duì)上一步獲得的候選基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，剔除不含CESA 蛋白典型結(jié)構(gòu)域的序列，確定CESA 基因家族的最終成員。

1.3 黃瓜纖維素合成酶基因家族生物信息學(xué)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

通過ExPASy網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/compute_pi/）對(duì)黃瓜纖維素合成酶家族蛋白的等電點(diǎn)（pI）和分子量（Mw）進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用在線網(wǎng)站MEME（https：//meme-suite.org/meme/index.html）進(jìn)行motif 預(yù)測(cè)，數(shù)量設(shè)置為10 個(gè)，其余參數(shù)選擇默認(rèn)。提取CESA 基因家族成員的gff文件信息，通過網(wǎng)站Gene Structure Display Server 2.0（GSDS 2.0，http：//gsds.gao-lab.org/）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。利用在線軟件Softberry（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml）對(duì)家族蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)。從黃瓜基因組序列注釋文件中提取每個(gè)基因的染色體位置，利用在線網(wǎng)站MapGene2Chrom web v2（MG2C，http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）繪制基因在各條染色體上的位置圖譜。利用TBtools 中的MCscanX 分析黃瓜、擬南芥和番茄CESA 家族基因之間以及黃瓜、西瓜和甜瓜CESA 家族基因之間的同源性，生成共線性分析圖。

使用軟件MEGA 7.0 分別對(duì)黃瓜、擬南芥、番茄和黃瓜、西瓜、甜瓜中CESA 的蛋白序列進(jìn)行多重比較，通過鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹，設(shè)BootStrap 抽樣次數(shù)為1 000。使用在線網(wǎng)站ITOL（https：//itol/embl.de/）優(yōu)化進(jìn)化樹，并將CESA 家族進(jìn)一步分為不同group。

1.4 黃瓜纖維素合成酶家族基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

為了分析黃瓜CESA 基因啟動(dòng)子區(qū)域包含的順式作用元件，用軟件TBtools 提取每個(gè)基因起始密碼子‘ATG’上游2 000 bp 的序列，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，然后使用TBtools 軟件對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.5 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的基因組織表達(dá)與脅迫響應(yīng)分析

為了確定基因的組織特異性表達(dá)，從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)CuGenDB 下載并分析了已發(fā)表的RNA-seq 數(shù)據(jù)，分別為10 個(gè)黃瓜組織〔根、莖、葉、受精子房（已膨大）、子房（未膨大）、雌花、未受精子房（已膨大）、雄花、卷須基部和卷須〕（PRJNA80169）、NaCl處理（PRJNA437579）和低溫處理（PRJNA438923）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

1.6 黃瓜纖維素合成酶家族基因表達(dá)分析

使用植物總RNA 提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕從樣品中提取總RNA，使用PrimeScript ? RT reagent Kit 試劑盒〔寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司〕完成第一鏈cDNA 的合成，使用的儀器為ABI PRISM 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（操作軟件為7500 Fast Real-Time PCR Systems，v2.0.6，USA），熒光染料為TB Green。試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司的TB Green? Premix Ex Taq ?（Tli RNaseH Plus）。使用Primer Premier 3 在線設(shè)計(jì)特異性引物，序列如表1 所示。qRT-PCR 反應(yīng)體系10 μL：5 μL 的 TB Green Premix Ex（Tli RNaseH Plus）（2×），1 μL cDNA模板，primer-F/R 各0.2 μL（終濃度為0.2 μmol·L），0.2 μL ROX Reference Dye II（50×），3.4 μL ddHO。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 20 s。以（Csa3G806800）為內(nèi)參基因。使用2算法分析基因的相對(duì)表達(dá)水平（Rieu &Powers，2009）。

表1 qRT-PCR 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜纖維素合成酶基因家族的成員鑒定

利用已發(fā)表的擬南芥CESA 的蛋白序列作為源序列，通過BlastP 的方式采用BioEdit 軟件對(duì)黃瓜基因組蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以E ＜10為篩選條件，結(jié)合CESA 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（PF03352，PF14569）共鑒定得到35 個(gè)CESA 基因家族成員。根據(jù)在染色體上的位置信息，利用在線軟件MG2C 進(jìn)行基因定位并繪制其在染色體上的位置圖譜（圖1），35 個(gè)基因均分布在除5 號(hào)染色體外的7 條染色體上，1～7 號(hào)染色體上基因數(shù)目分別為1、10、3、11、0、3、7個(gè)。根據(jù)在染色體上的位置，將35 個(gè)基因命名為從到。其中，有3 對(duì)片段重復(fù)基因。CsCESA 蛋白的氨基酸殘基數(shù)目在205～1 146 之間，分子量在23.2～128.4 kD 之間，蛋白等電點(diǎn)（PI）在5.18～8.95 之間。利用在線網(wǎng)站Softberry 對(duì)基因家族蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)，大部分家族成員定位于質(zhì)膜上，少部分成員定位于高爾基體上（表2）。

圖1 黃瓜纖維素合成酶基因家族在染色體上的位置

表2 黃瓜纖維素合成酶基因全基因組鑒定與分子特征分析

2.2 黃瓜纖維素合成酶家族基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析

通過網(wǎng)站GSDS 2.0 對(duì)黃瓜CESA 家族基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，如圖2 所示：黃瓜CESA 基因家族外顯子數(shù)目差異明顯，外顯子數(shù)目為2～15 個(gè)不等。其中含有2 個(gè)外顯子，含有15 個(gè)外顯子，分別有2 個(gè)成員含有7、12 個(gè)和13個(gè)外顯子，分別有3 個(gè)成員含有3、5 個(gè)和14 個(gè)外顯子，分別有4 個(gè)成員含有4、8 個(gè)和9 個(gè)外顯子，分別有6 個(gè)成員含有6 個(gè)外顯子。

利用在線網(wǎng)站MEME 對(duì)CESA 基因家族進(jìn)行motif 預(yù)測(cè)，數(shù)量設(shè)置為10 個(gè)，其余參數(shù)選擇默認(rèn)。黃瓜的CESA 蛋白都含有該家族的保守結(jié)構(gòu)域Cellulose-synt（PF03552），除了CsCESA5、CsCESA6、CsCESA20、CsCESA21 和CsCESA31分別含有3、4、3、6、5 個(gè)motif 外，其 余CsCESA 都含有7～10 個(gè)motif，這些motif 在基因家族中的分布表現(xiàn)出相似的模式，說明CESA 在進(jìn)化過程中保守性較高（圖2）。10 個(gè)motif 長(zhǎng)度在27～50 個(gè)氨基酸之間，平均為36.2。

圖2 黃瓜纖維素合成酶基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化和結(jié)構(gòu)特征

為了分析黃瓜纖維素合成酶基因家族的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA 7.0 軟件和在線軟件ITOL 對(duì)黃瓜（35）、擬南芥（10）、番茄（16）、西瓜（28）和甜瓜（33）中的CESA 基因家族蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。如圖3-A 所示，黃瓜、擬南芥和番茄CESA 基因家族成員被分為6 個(gè)group，其中g(shù)roup1、group2、group4 和group5 包含3 個(gè)物種的CESA 基因，group3 僅有黃瓜CESA 基因，group6包含黃瓜和番茄CESA 基因；如圖3-B 所示，黃瓜、西瓜和甜瓜CESA 基因家族成員均勻地分布在6 個(gè)分支上（group1～group6）。

圖3 不同作物纖維素合成酶基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹

為了進(jìn)一步了解黃瓜CESA 基因家族的進(jìn)化關(guān)系，通過軟件MCscanX 對(duì)黃瓜、擬南芥、番茄、西瓜和甜瓜中CESA 家族基因進(jìn)行了物種間共線性分析。與、家族基因之間的同源性分析結(jié)果如圖4-A 所示，和家族基因之間有15 個(gè)同源基因?qū)?；和家族基因之間有12 個(gè)同源基因?qū)?；就單條染色體上的共線性基因分布而言，黃瓜5 號(hào)染色體上無(wú)共線性基因；2、3、4、6 號(hào)和7 號(hào)染色體上共線性基因數(shù)量較多，為4～6 條；1 號(hào)染色體上共線性基因較少，為1 條。與、家族基因之間的同源性分析結(jié)果如圖4-B 所示，和家族基因之間有19 個(gè)同源基因?qū)Γ缓图易寤蛑g有20 個(gè)同源基因?qū)?。就單條染色體上的共線性基因分布而言，黃瓜5 號(hào)染色體上無(wú)共線性基因；7 號(hào)染色體上共線性基因最多，為10 條；2、3、4 號(hào)和6 號(hào)染色體上共線性基因數(shù)量較多，為6～8 條；1 號(hào)染色體上共線性基因較少，為1 條。

圖4 不同作物纖維素合成酶基因家族的共線性分析

2.3 黃瓜纖維素合成酶家族基因啟動(dòng)子中順式作用元件分析

為了更好地了解CESA 家族基因的調(diào)控機(jī)制，提取了CESA 家族中各基因的啟動(dòng)子區(qū)域（ATG 起始位點(diǎn)上游2 000 bp 的堿基序列），利用在線網(wǎng)站 PlantCARE 對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，然后使用TBtools 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化（圖5）。這些順式作用元件包括光響應(yīng)元件、防御和脅迫響應(yīng)元件（干旱、低溫）、植物激素響應(yīng)元件（茉莉酸甲酯、脫落酸、赤霉素、生長(zhǎng)素和水楊酸）、空間基因表達(dá)元件（分生組織、胚乳、種子細(xì)胞）和生物過程中涉及到的相關(guān)的響應(yīng)元件（代謝、晝夜節(jié)律和細(xì)胞周期等），推測(cè)CESA 基因家族成員可能通過調(diào)控上游轉(zhuǎn)錄因子參與整合多種反應(yīng)。

圖5 黃瓜纖維素合成酶基因家族成員啟動(dòng)子序列順式作用元件分析

2.4 黃瓜纖維素合成酶家族基因的組織表達(dá)分析

利用從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)CuGenDB下載的10個(gè)黃瓜組織（根、莖、葉、受精子房、子房、雌花、未受精子房、雄花、卷須基部和卷須）的RNA-seq 數(shù)據(jù)，研究CESA 家族基因的組織表達(dá)情況，并將這些數(shù)據(jù)生成熱圖（圖6-A）。、和在各組織中均有較高的表達(dá)水平；、、、、、、、、、、和在各組織中均有一定的表達(dá)水平；在除去根、在除去雄花、和在除去根和雄花、在除去根、卷須和卷須基部之外的各組織中均有一定的表達(dá)；、、、、、、和在各組織中的表達(dá)量比較低。以上結(jié)果表明了其成員功能的分化和組織表達(dá)的特異性。

圖6 黃瓜纖維素合成酶家族基因的表達(dá)模式

2.5 黃瓜纖維素合成酶家族基因在非生物脅迫和激素處理下的表達(dá)分析

利用黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載來自黃瓜幼苗在NaCl處理（PRJNA437579）以及低溫脅迫（PRJNA438923）下的RNA-seq數(shù)據(jù)。如圖6-B和6-C所示，大部分成員受NaCl和低溫的誘導(dǎo)表達(dá)，在NaCl處理下，、、、、、、、、和下調(diào)表達(dá)；、、、和表達(dá)量沒有明顯變化；其余基因均上調(diào)表達(dá)。低溫處理下，、、、、和上調(diào)表達(dá)；、、和在2h時(shí)上調(diào)表達(dá)；、和在2h和6h時(shí)上調(diào)表達(dá)；和在2h和12h時(shí)上調(diào)表達(dá)；、、、、和在6 h 和12 h 時(shí)上調(diào)表達(dá)；其余均下調(diào)表達(dá)或無(wú)明顯表達(dá)差異。對(duì)不同非生物脅迫處理有不同程度的響應(yīng)，表明其可能在黃瓜植株響應(yīng)非生物脅迫的過程中發(fā)揮作用。

選取黃瓜CESA 基因家族中的、、、、、、和進(jìn)行非生物脅迫和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下的表達(dá)分析，利用qRT-PCR檢測(cè)黃瓜品系9930在NaCl、ABA和MeJA不同時(shí)間梯度（0、3、6、12h和24h）處理下的表達(dá)譜，結(jié)果顯示：以上基因不同程度地受到鹽脅迫和植物激素ABA、MeJA的誘導(dǎo)。如圖7所示，在NaCl處理下，除和表達(dá)量下降以外，其余基因均受NaCl的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。外施激素ABA處理下，從0～24h，和上調(diào)表達(dá)；和下調(diào)表達(dá)；和表達(dá)量先升高后下降；表達(dá)量先下降后升高；表達(dá)量先下降后升高再降低。MeJA處理下，從0～24h，、、和上調(diào)表達(dá)；在3h上調(diào)表達(dá)，之后表達(dá)量下調(diào)；在6h上調(diào)表達(dá)，24h表達(dá)量下調(diào)；在12h表達(dá)量上調(diào)；在12h和24h表達(dá)量下調(diào)。8個(gè)基因均能響應(yīng)非生物脅迫（包括低溫和鹽脅迫）和植物激素（ABA、MeJA）的誘導(dǎo)（圖6、7），其中、和表達(dá)量的峰值更高，表明這3個(gè)基因在黃瓜植株響應(yīng)非生物脅迫的過程中更具有研究?jī)r(jià)值。

圖7 黃瓜纖維素合成酶基因在非生物脅迫（NaCl、ABA 和MeJA）誘導(dǎo)下的 qRT-PCR 表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，主要由36根β-1，4 糖苷鏈結(jié)晶而成的小微纖絲組成。纖維素合成酶（CESA）是一種與膜結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶，可以催化UDP-葡萄糖形成β-1，4 糖苷鏈合成纖維素（Festucci-buselli et al.，2007）。纖維素合成酶被稱之為“復(fù)合物的復(fù)合物”，其家族由多個(gè)成員組成（Somerville，2006）。近年來，人們對(duì)纖維素合成酶基因家族的研究集中于擬南芥、煙草等模式植物和棉花、楊樹、亞麻、毛竹等木本植物，黃瓜中纖維素合成酶基因家族的系統(tǒng)鑒定和分析還未見報(bào)道。從前人的研究中可以發(fā)現(xiàn)不同物種的CESA基因家族成員的數(shù)量存在很大差異，擬南芥、煙草、水稻、毛果楊及四倍體海島棉中分別鑒定出10、21、14、18個(gè)和37 個(gè)CESA（Richmond & Somerville，2000；Wang et al.，2010；袁紅梅 等，2016；Yuan et al.，2016；徐宗昌和孔英珍，2017）。

本試驗(yàn)對(duì)黃瓜CESA 基因家族進(jìn)行全基因組生物信息學(xué)分析，共鑒定出35 個(gè)CESA 基因家族成員，分布在除5 號(hào)染色體外的6 條染色體上，2、4、7 號(hào)染色體上分布較多，1、3、6 號(hào)染色體上分布較少，基因的不均勻分布可能與遺傳變異和物種進(jìn)化相關(guān)。CESA 家族成員含有的motif 數(shù)量差異不大，其分布表現(xiàn)出相似的模式，說明CESA 基因家族成員在進(jìn)化過程中具有較高的保守性。CESA家族成員含有的內(nèi)含子、外顯子數(shù)量存在一定的差異，且所含有的氨基酸位點(diǎn)數(shù)量以及理化特征明顯不同，表明CsCESA 蛋白可能在其自身的微環(huán)境中發(fā)揮不同的作用。在系統(tǒng)發(fā)育分析中，黃瓜、擬南芥和番茄CESA 家族成員被分為6 個(gè)group，其中g(shù)roup1、group2、group4 和group5 包含3 個(gè)物種的CESA 基因，group3 僅有黃瓜CESA 基因，group6包含黃瓜和番茄CESA 基因，說明該家族的主要特征極有可能在雙子葉/單子葉分裂之前就已經(jīng)產(chǎn)生并出現(xiàn)了分化；黃瓜、西瓜和甜瓜CESA 基因家族成員均勻地分布在6 個(gè)分支上，說明CESA 家族成員在葫蘆科植物之間具有較高的結(jié)構(gòu)和功能相似性。前人研究表明，基因復(fù)制的兩種模式串聯(lián)基因復(fù)制和片段基因復(fù)制被認(rèn)為是進(jìn)化過程中基因家族擴(kuò)張的主要推動(dòng)力。發(fā)生拷貝數(shù)變異的基因可能存在表達(dá)和功能上的分化，并在獲得環(huán)境適應(yīng)優(yōu)勢(shì)的過程中起著重要作用（Cannon et al.，2004）。本試驗(yàn)揭示了片段重復(fù)是負(fù)責(zé)CsCESA 基因家族進(jìn)化的主要原因，經(jīng)過物種內(nèi)的共線性分析發(fā)現(xiàn)有3 對(duì)片段重復(fù)基因?qū)?，無(wú)串聯(lián)重復(fù)基因?qū)Γ▓D1）。

植物細(xì)胞壁除了人們常規(guī)認(rèn)為的機(jī)械支持和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ芡?，還可以對(duì)各種逆境脅迫做出響應(yīng)。植物細(xì)胞壁響應(yīng)逆境脅迫是個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，細(xì)胞壁的多種成分均參與響應(yīng)的機(jī)制，表現(xiàn)為：細(xì)胞壁組分的含量和結(jié)構(gòu)的變化，包括細(xì)胞壁多糖、細(xì)胞壁蛋白和酶以及質(zhì)外體小分子物質(zhì)，以上這些變化都是通過一系列相關(guān)酶的有序調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)的（Endler et al.，2015）。在植物中，CESA 基因家族成員具有較高的系統(tǒng)發(fā)育相似性，但是在不同物種中的時(shí)空表達(dá)模式不同，表達(dá)水平和表達(dá)種類具有明顯的組織特異性，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控也存在功能分化的現(xiàn)象（Hill et al.，2015；李秀云 等，2017；徐宗昌和孔英珍，2017）。前人研究結(jié)果表明，植物中纖維素含量的變化會(huì)引起植物對(duì)非生物和生物脅迫的響應(yīng)，在擬南芥中，纖維素合成酶基因的突變導(dǎo)致纖維素含量減少，進(jìn)而影響乙烯和茉莉酸甲酯信號(hào)途徑、病原微生物侵染、損傷誘導(dǎo)和干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)（Ellis et al.，2002）。擬南芥的基因耐旱突變體可以通過調(diào)節(jié)脯氨酸、可溶性糖、ABA 含量和纖維素的轉(zhuǎn)化比例來調(diào)節(jié)植物的滲透能力，從而增強(qiáng)植物對(duì)干旱和滲透脅迫的耐受性（Chen et al.，2005）。本試驗(yàn)中，低溫和鹽脅迫對(duì)基因有不同的調(diào)控作用，基因可能通過相同或者不同的調(diào)節(jié)機(jī)制來響應(yīng)這些非生物脅迫。例如在低溫脅迫下上調(diào)表達(dá)，在鹽脅迫下下調(diào)表達(dá)，在低溫脅迫下下調(diào)表達(dá)，在鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)，這些數(shù)據(jù)表明，和通過不同的機(jī)制對(duì)相同的脅迫做出反應(yīng)。和在低溫和鹽脅迫下均下調(diào)表達(dá)，表明它們可能享有相同的調(diào)節(jié)機(jī)制或途徑。鹽脅迫處理下，、和未檢測(cè)到表達(dá)變化。說明CESA 基因能夠廣泛參與多種逆境脅迫的適應(yīng)過程。

植物激素信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)對(duì)于植物逆境響應(yīng)至關(guān)重要。ABA 在植物對(duì)低溫和鹽脅迫的響應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用（Suzuki et al.，2016）。茉莉酸（JA）及其甲酯（MeJA）是內(nèi)源性信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)脅迫響應(yīng)和植物發(fā)育中起著關(guān)鍵作用（Fung et al.，2004）。本試驗(yàn)中，大多數(shù)基因受到ABA和MeJA 的誘導(dǎo)表達(dá)，尤其是，表達(dá)量上調(diào)的倍數(shù)最高。以上結(jié)果表明，基因家族可能在各種植物激素之間的串?dāng)_中起關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)中、和能夠響應(yīng)非生物脅迫（包括低溫和鹽脅迫），此外，它們能夠受到ABA（一種整合各種脅迫信號(hào)并控制下游應(yīng)答的激素）和MeJA（一種參與非生物脅迫的信號(hào)分子）的誘導(dǎo)表達(dá)，且這3 個(gè)基因的表達(dá)量相對(duì)較高。與和同源性最高的和的基因功能還未明確；與同源性最高的在種子粘液中的纖維素生成中起著重要的作用（Sullivan et al.，2011），并且在根組織中能受到干旱脅迫的誘導(dǎo)從而使表達(dá)量上調(diào)（Heidari et al.，2019）。因此，黃瓜中、和響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

本試驗(yàn)從9930_V2 版本基因組中鑒定到35 個(gè)CESA 基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析。在植物生長(zhǎng)和發(fā)育過程中，基因具有明顯的組織表達(dá)差異性，協(xié)同調(diào)控了黃瓜的生長(zhǎng)發(fā)育?；虻谋磉_(dá)對(duì)非生物脅迫和植物激素處理的反應(yīng)不同，其中、和均能響應(yīng)非生物脅迫（包括低溫和鹽脅迫）和植物激素（ABA 和MeJA）的誘導(dǎo)，說明它們是應(yīng)激反應(yīng)中潛在的關(guān)鍵調(diào)控因子。本試驗(yàn)結(jié)果有助于了解基因在黃瓜響應(yīng)非生物脅迫過程中的作用，推動(dòng)CESA 基因家族的研究與發(fā)展，接下來的試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)一步研究、和響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)制，減少非生物脅迫對(duì)黃瓜以及園藝植物生產(chǎn)的影響。