樊守金 郭秀秀

(山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，250014，濟(jì)南)

葉綠體是植物細(xì)胞中承擔(dān)能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器.葉綠體內(nèi)進(jìn)行的光合作用是自然界最重要的化學(xué)反應(yīng).地球上的綠色植物通過(guò)光合作用將太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化為生物能源的產(chǎn)量高達(dá)2 200億t/年，相當(dāng)于全球能耗的10倍.葉綠體及光合作用為地球上的大多數(shù)生物提供了必需的能源[1].除了光合作用，葉綠體還提供了大量合成具有生物活性的天然產(chǎn)物所需的能量和碳骨架，具有潛在的藥物用途，例如氨基酸和UDP-葡萄糖的生物合成就發(fā)生在葉綠體中[2].葉綠體DNA最先是由Ris和Plaut[3]在觀察衣藻時(shí)發(fā)現(xiàn)的.而早在1909年兩位德國(guó)科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)紫茉莉和天竺葵的花色和葉色遺傳不符合孟德?tīng)栠z傳定律，并且認(rèn)為這種遺傳和葉綠體有關(guān)[4,5].第一個(gè)發(fā)表的葉綠體基因組序列是Shinozaki等人[6]在煙草(Nicotianatabacum)中獲得的.同年，Ohyama等人[7]又發(fā)表了地錢(qián)(Marchantiapolymorpha)葉綠體基因組的完整序列.過(guò)去的幾十年，由于高純度葉綠體DNA獲取較為困難，且受到測(cè)序技術(shù)和測(cè)序成本的局限，葉綠體基因組研究較為緩慢.近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序成本的降低，葉綠體基因組研究迅速加快.截止到2021年4月11日，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已公布了5 379個(gè)葉綠體基因組數(shù)據(jù)，其中也包含了一些常見(jiàn)作物的不同品種的葉綠體基因組數(shù)據(jù).

自20世紀(jì)80年代以后，分子生物學(xué)快速發(fā)展，以前基于形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)逐漸轉(zhuǎn)向結(jié)合形態(tài)和分子數(shù)據(jù)的研究，即開(kāi)始利用DNA或氨基酸的序列信息，解析生物的進(jìn)化歷史[8].葉綠體基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，基因組較小，但包含大量的遺傳信息.其次，葉綠體基因組核苷酸置換率適中，且編碼區(qū)和非編碼區(qū)的分子進(jìn)化速率差異顯著，分別適用于不同分類(lèi)階元的研究[9].因此，葉綠體基因組廣泛應(yīng)用在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)[10，11]，居群遺傳學(xué)[12，13]，譜系地理學(xué)[14，15]等領(lǐng)域.

Boynton等人[16]借助基因槍法實(shí)現(xiàn)了葉綠體的轉(zhuǎn)化，是葉綠體轉(zhuǎn)化成功的首次報(bào)道.1990年，外源cat基因在煙草葉綠體的瞬時(shí)表達(dá)，是高等植物葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的開(kāi)端[17].葉綠體基因工程與核基因組基因工程相比，外源基因表達(dá)量高，不存在基因沉默現(xiàn)象并且環(huán)境安全性更高[18].此外，葉綠體的雙層膜結(jié)構(gòu)將葉綠體區(qū)隔化出獨(dú)立的空間，可以作為生物反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞質(zhì)有害物質(zhì)的表達(dá)，而不傷害植物細(xì)胞[19,20].目前，葉綠體基因工程已經(jīng)在提高植物的除草劑抗性和抗蟲(chóng)性，提高植物抗逆性及合成某些生物制劑領(lǐng)域得到應(yīng)用.

1 葉綠體研究進(jìn)展

1.1葉綠體起源關(guān)于葉綠體的起源，目前普遍接受的是內(nèi)共生起源假說(shuō)，該假說(shuō)是由Mereschkowsky[21]最先提出的.該假說(shuō)認(rèn)為大約在10億年前，原始的真核細(xì)胞吞噬了具有光合能力的古藍(lán)細(xì)菌，古藍(lán)細(xì)菌與宿主細(xì)胞形成共生關(guān)系，并逐漸失去了自身的大部分基因，被吞噬的古藍(lán)細(xì)菌形成了現(xiàn)在的葉綠體[22].普遍認(rèn)為，葉綠體多數(shù)基因通過(guò)與核內(nèi)共生基因轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移到核基因組中，葉綠體基因組本身只保留了少數(shù)基因[23，24].支持該假說(shuō)的證據(jù)有以下五方面[1]：①葉綠體有獨(dú)立的DNA，且與原核生物的DNA更為相似；②葉綠體的蛋白合成機(jī)制類(lèi)似于細(xì)菌，蛋白質(zhì)合成從N-甲酰甲硫氨酸開(kāi)始；③葉綠體的DNA和RNA可以被原核生物DNA/RNA聚合酶抑制劑所抑制；④葉綠體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)層膜與原核生物細(xì)胞膜十分相似；⑤某些葉綠素和藍(lán)細(xì)菌的蛋白質(zhì)相似.

1.2葉綠體DNA的遺傳方式Ris和Plaut[3]借助電子顯微鏡首次在衣藻葉綠體中發(fā)現(xiàn)了DNA纖絲，這是葉綠體含有自主遺傳物質(zhì)的直接證據(jù).Baur[4]和Correns[5]的研究發(fā)現(xiàn)紫茉莉(紫茉莉科)和天竺葵(牻牛兒苗科)花色和葉色遺傳，不符合孟德?tīng)栠z傳定律，并且認(rèn)為葉綠體與葉色遺傳有關(guān)，并表現(xiàn)出隨機(jī)的遺傳方式.隨后，Grant等人[25]和Stubbe[26]在衣藻和月見(jiàn)草屬也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象，并將這種隨機(jī)分離，子代總是表現(xiàn)出母本性狀的遺傳現(xiàn)象稱(chēng)為葉綠體母系遺傳.葉綠體DNA是由細(xì)胞內(nèi)膜包被的獨(dú)立基因組，屬于細(xì)胞質(zhì)遺傳，以非孟德?tīng)栠z傳方式遺傳給下一代.目前的研究認(rèn)為葉綠體DNA有三種不同的遺傳模式，分別是母系遺傳、父系遺傳和雙親遺傳.不同進(jìn)化地位植物類(lèi)群的葉綠體DNA遺傳方式表明，雙親遺傳可能是最原始的遺傳模式[27].大部分被子植物的葉綠體DNA遵循母系遺傳[28, 29]，但也有一些類(lèi)群葉綠體DNA是父系遺傳，例如傘形科胡蘿卜屬[30]，旋花科番薯屬[31]，獼猴桃科獼猴桃屬[32]，蒺藜科蒺藜屬[33]和豆科甘草屬[34]等.裸子植物葉綠體DNA一般為父系遺傳[35，36]，如松柏類(lèi)[37].

1.3葉綠體基因組的基本結(jié)構(gòu)葉綠體DNA一般為雙鏈環(huán)狀分子，大多數(shù)高等植物的葉綠體基因組是高度保守的四分體結(jié)構(gòu)，包括大單拷貝區(qū)(Large Single Copy，LSC，長(zhǎng)約81～90 kb)，小單拷貝區(qū)(Small Single Copy，SSC，長(zhǎng)度介于18～20 kb之間)和兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)(Inverted Reapet Sequence，IRa和IRb，長(zhǎng)度約為20～30 kb)[38](圖1).也有少數(shù)植物，如牻牛兒苗屬植物[39]，蒺藜苜蓿、鷹嘴豆、三葉草等豆科植物[40]，因?yàn)閬G失了一個(gè)反向重復(fù)區(qū)而不具有四分體結(jié)構(gòu).

圖1 被子植物無(wú)油樟(Amborella trichopoda)的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)圖示[46]

植物葉綠體基因組長(zhǎng)度一般為107～218 kb，而葉綠體基因組長(zhǎng)度的變化主要是由IR區(qū)的收縮和擴(kuò)張導(dǎo)致的[41].目前已知的葉綠體基因組最大的被子植物是牻牛兒苗科的天竺葵(Pelargoniumxhortorum)，其葉綠體基因組大小為217 942 bp(NC_008454).天竺葵的反向重復(fù)區(qū)發(fā)生了明顯的擴(kuò)張，其IR區(qū)達(dá)到了75 kb[42].由于猴耳環(huán)屬植物Pithecellobiumflexicaule葉綠體基因組IR區(qū)(長(zhǎng)度達(dá)到41 503 bp)向LSC區(qū)的擴(kuò)張，使其成為目前已報(bào)道的豆科植物最大的葉綠體基因組[43].黑松Pinusthunbergii葉綠體基因組長(zhǎng)度僅有119 707 bp(NC_001631)，主要是因?yàn)楹谒扇~綠體基因組的反向重復(fù)區(qū)發(fā)生了嚴(yán)重的收縮，其IR區(qū)的長(zhǎng)度僅有495 bp[44].此外，葉綠體基因的插入缺失或重復(fù)序列的數(shù)量也會(huì)影響葉綠體基因組的大小.例如單子葉植物葉綠體基因組普遍比雙子葉植物的葉綠體基因組小15 kb左右，這主要是由于單子葉植物中丟失或部分丟失了ycf1(約5～7 kb)和ycf2(約5 kb)這兩個(gè)較長(zhǎng)的基因片段[45].在天竺葵葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)了大量大于100 bp的重復(fù)序列，占葉綠體基因組的17.5%～26.9%.

葉綠體基因組大約編碼110～130個(gè)基因，按照基因功能不同可以分為四大類(lèi)[38].第一類(lèi)是光合作用相關(guān)的基因，包括與光系統(tǒng)I相關(guān)的psa基因家族、ycf3和ycf4，與光系統(tǒng)II相關(guān)的psb基因家族，NAD(P)H脫氫酶類(lèi)基因ndh基因家族，細(xì)胞色素b/f復(fù)合體類(lèi)基因pet基因家族，ATP合成酶類(lèi)基因atp基因家族和核糖體大亞基基因rbcL.第二類(lèi)是與葉綠體基因表達(dá)相關(guān)的基因，包括編碼核糖體大亞基蛋白類(lèi)基因rpl基因家族，編碼核糖體小亞基蛋白類(lèi)基因rps基因家族，RNA聚合酶類(lèi)基因rpo基因家族，核糖體RNA類(lèi)基因和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA類(lèi)基因.第三類(lèi)是與葉綠體中生物合成相關(guān)的基因，包括成熟酶基因matK，蛋白酶基因clpP，包膜蛋白基因cemA，乙酰輔酶A羧化酶基因accD，細(xì)胞色素酶合成基因ccsA和翻譯起始因子infA.第四類(lèi)是一些功能未知的開(kāi)放閱讀框，如ycf1，ycf2和ycf15等.

1.4葉綠體基因組進(jìn)化被子植物葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)高度保守，分子進(jìn)化速率適中，約是核基因進(jìn)化速率的1/3，是線粒體進(jìn)化速率的3倍[47].反向重復(fù)區(qū)對(duì)于維持葉綠體基因組結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有重要意義，IR基因的堿基替代率僅為單拷貝區(qū)基因的1/4[48].

自葉綠體起源演化至今，被子植物葉綠體基因組僅保留了其祖先5%的基因含量，而且這一過(guò)程還在繼續(xù)[39].基因丟失最明顯的例子是寄生植物，列當(dāng)科(Orobanchaceae)[49，50]，蘭科地下蘭植物(Rhizanthellagardneri)[51]，旋花科菟絲子屬(Cuscuta)[52]等植物丟失了大部分與光合作用相關(guān)的基因，全寄生植物大花草的葉綠體基因甚至完全丟失[53]，體現(xiàn)了與寄主的協(xié)同進(jìn)化.NAD(P)H脫氫酶復(fù)合體編碼基因是一類(lèi)參與光系統(tǒng)I電子傳遞過(guò)程的重要基因，通常由11個(gè)ndh基因組成，然而該基因家族在澤瀉目(Alismatales)[54]，蘭科(Orchidaceae)[55]，牻牛兒苗科(Geraniaceae)[56]等多個(gè)類(lèi)群中普遍存在缺失現(xiàn)象.禾本科植物accD、ycf1、ycf2基因和clpP、rpoC1基因內(nèi)含子也發(fā)生了丟失[57].除了基因丟失，還發(fā)現(xiàn)了一些葉綠體基因向核基因或線粒體基因組的轉(zhuǎn)移.擬南芥的比較基因組分析顯示，核基因組中由葉綠體基因組起源的基因比例至少占到18%[24].在線粒體基因組中，葉綠體基因組起源的基因比例達(dá)到了1/3[58].

葉綠體基因組的重排往往發(fā)生在大單拷貝區(qū)的基因間隔區(qū)，大片段的重排是進(jìn)化事件，具有一定的系統(tǒng)發(fā)育意義[59].類(lèi)群特異性的重排常見(jiàn)于桔?？芠60]，牻牛兒苗科[61，62]，豆科[40]，菊科[63]和禾本科[57，64]，例如禾本科葉綠體基因組在trnR至trnfM，trnG至psbD以及trnT區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)了3次倒置[65].

2 葉綠體基因組應(yīng)用

2.1葉綠體基因組在系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用葉綠體基因組具有以下優(yōu)點(diǎn)：①葉綠體基因組較小，但其拷貝數(shù)多，全基因組序列更容易獲得；②葉綠體基因組一般為單親遺傳，不存在基因重組等問(wèn)題；③進(jìn)化速率適中，約為基因組進(jìn)化速率的1/3，同時(shí)葉綠體基因組中基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)的進(jìn)化速度差異顯著.因此葉綠體基因組適合于不同分類(lèi)階元的系統(tǒng)發(fā)育研究[66].基于全葉綠體基因組序列信息位點(diǎn)重建不同階元的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系得到了廣泛的應(yīng)用并較好地解決了被子植物目級(jí)、科間、屬間甚至屬下種間的關(guān)系.Jansen等人[67]基于64個(gè)葉綠體基因組重建了被子植物目級(jí)水平的系統(tǒng)發(fā)育框架，結(jié)果表明Amborella是被子植物中最早分化的類(lèi)群；Li等人[68]選擇被子植物全部64目，利用2,881個(gè)質(zhì)體基因組的80個(gè)基因，重建了目前為止取樣最廣泛的、高分辨率的被子植物葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).在科或亞科水平上，Wu等人[69]基于22個(gè)葉綠體基因組的76個(gè)蛋白編碼基因序列重建了禾本科內(nèi)部BEP分支亞科間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；Zhang等人[70]基于質(zhì)體基因組學(xué)數(shù)據(jù)重建了被子植物重要類(lèi)群薔薇科的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，研究包含了薔薇科79屬132種，成功解析了薔薇科各亞科、族和屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；Zhai等人[71]利用葉綠體基因組對(duì)毛茛科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了研究；Zhang等人[72]選取豆科全部6個(gè)亞科和97%族的葉綠體基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行全面分析，獲得了豆科具有強(qiáng)統(tǒng)計(jì)支持且基本一致的系統(tǒng)樹(shù).此外，葉綠體基因組還用于研究榆科[73]、蕓香科[74]等的系統(tǒng)發(fā)育研究.

Liu等人[11]基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)對(duì)畫(huà)眉草族下畫(huà)眉草屬、鐮稃草屬及九頂草屬的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果不支持鐮稃草屬的成立，鐮稃草應(yīng)為畫(huà)眉草屬下的一個(gè)種；Bruunlund等人[75]基于葉綠體基因組重建了榕屬屬下組間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，獲得了高支持的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，解決了無(wú)花果及其主要類(lèi)群之間的關(guān)系，并且很大程度上支持了基于核基因序列的結(jié)果.Asaf等人[76]將野生稻與其近緣種的葉綠體基因組進(jìn)行比較，并基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)解析了野生稻與其近緣種的親緣關(guān)系.Asaf等人[77]比較了Nicotianaotophora及其近緣種的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)并基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)重建了煙草屬下種間關(guān)系.Wang等人[10]基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)探討了隱子草屬屬下種間關(guān)系，雖然沒(méi)有完全解析該屬下所有種的關(guān)系，但是質(zhì)體數(shù)據(jù)高度支持Cleistogenessquarrosa是該屬的基部類(lèi)群.此外，葉綠體基因組也在山茶屬[78]、蔥屬[79，80]、松屬[81]等系統(tǒng)發(fā)育研究中得到了應(yīng)用.

雖然葉綠體基因組數(shù)據(jù)目前已經(jīng)廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育研究[82-85]，但仍存在一些問(wèn)題.近年來(lái)，基于葉綠體系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究比較有爭(zhēng)議的問(wèn)題就是由系統(tǒng)誤差導(dǎo)致的長(zhǎng)枝吸引效應(yīng).長(zhǎng)枝吸引效應(yīng)(Long Branch Attraction，LBA)是指基于有限的數(shù)據(jù)集進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究過(guò)程中，由于高頻率的平行突變、回復(fù)突變或進(jìn)化速率較快等因素存在，使原本親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的類(lèi)群序列達(dá)到相似，而系統(tǒng)發(fā)育分析過(guò)程中會(huì)錯(cuò)誤地把這些不是來(lái)自共同祖先的類(lèi)群聚在一起的現(xiàn)象[86].在利用組學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究的過(guò)程中，LBA效應(yīng)會(huì)被顯著放大，對(duì)精確重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系產(chǎn)生不利影響[87-89].目前，在柏木亞科[90]等類(lèi)群中研究了質(zhì)體系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)中的LBA效應(yīng).引起長(zhǎng)枝吸引效應(yīng)的原因有很多，最常見(jiàn)的原因是取樣不全或取樣不當(dāng).一個(gè)典型的例子就是關(guān)于被子植物基部類(lèi)群的研究[46，91-93].許多系統(tǒng)發(fā)育研究工作者提出了幾種避免長(zhǎng)枝吸引效應(yīng)的方法，主要包括：①模型優(yōu)化，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)之前，將比對(duì)好的數(shù)據(jù)矩陣通過(guò)設(shè)定gamma分布參數(shù)進(jìn)行最優(yōu)模型選擇[94, 95]；②去除快速演化的基因或位點(diǎn)，如第三位密碼子等[96, 97];③增加代表類(lèi)群取樣，尤其是增加與長(zhǎng)枝分類(lèi)單元較近對(duì)的類(lèi)群[98].此外，僅僅依靠葉綠體基因組數(shù)據(jù)重建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不能解釋網(wǎng)狀進(jìn)化、雜交和多倍化等現(xiàn)象.因此，想要反映物種的真實(shí)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍需要結(jié)合更多的分子、細(xì)胞和形態(tài)等數(shù)據(jù).

2.2葉綠體基因組在居群遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用居群遺傳學(xué)(Population genetics)主要研究生物居群等位基因頻率及居群的相互關(guān)系，主要有自然選擇、遺傳漂變、基因突變和基因流四個(gè)過(guò)程.目前居群遺傳學(xué)主要研究種內(nèi)居群間或近緣物種之間的進(jìn)化歷史，其研究?jī)?nèi)容主要集中在遺傳多樣性、遺傳分化和物種進(jìn)化方式等方面[99].遺傳多樣性指的是種內(nèi)遺傳多樣性或遺傳變異，是生物多樣性的重要組成部分.遺傳多樣性實(shí)質(zhì)是內(nèi)在遺傳物質(zhì)的變異[100].DNA序列的多態(tài)性為遺傳分析奠定了基礎(chǔ)，單親遺傳且一般沒(méi)有重組使得葉綠體基因組序列成為研究植物居群遺傳的得力工具[101].SSR位點(diǎn)在真核生物基因組分析中普遍存在，多態(tài)性高，可通過(guò)PCR快速分型.葉綠體基因組中的SSR位點(diǎn)可以為植物居群遺傳結(jié)構(gòu)的分析提供重要的信息.在松屬植物中，葉綠體基因組是通過(guò)花粉遺傳的，借助PCR方法可以檢測(cè)該屬植物的基因流[102].利用跨越葉綠體基因組不同區(qū)域并且可以擴(kuò)增編碼區(qū)和非編碼區(qū)的100對(duì)引物(72對(duì)引物位于LSC區(qū)，13對(duì)引物位于SSC區(qū)，15對(duì)引物位于IR區(qū))，對(duì)13種單子葉植物進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)薯蕷屬、馬唐屬和狼尾草屬植物的多樣性主要表現(xiàn)為單核苷酸多態(tài)性.棕櫚科(Arecaceae)植物的多樣性還包括可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列，最容易發(fā)生變異的基因座(rps15-ycf1、rpl32-ccsA、ndhF-rpl32、ndhG-ndhI和ccsA)位于SSC區(qū)[13].Zhao等人[12]基于葉綠體全基因組、轉(zhuǎn)錄組和基因分型測(cè)序(GBS)研究了中國(guó)胡桃屬植物的居群遺傳、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和雜交物種形成.

2.3葉綠體基因組在譜系地理學(xué)研究中的應(yīng)用譜系地理學(xué)是生物地理學(xué)的一個(gè)分支，主要研究近緣物種之間及種內(nèi)不同居群間的親緣關(guān)系，探究物種演化與地質(zhì)歷史的關(guān)系，并結(jié)合多學(xué)科推斷種群動(dòng)態(tài)、進(jìn)化歷程及物種現(xiàn)有分布格局的成因[103].葉綠體基因組為單親遺傳且進(jìn)化速率適中，在譜系地理學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛.目前，多以葉綠體分子標(biāo)記進(jìn)行植物譜系地理學(xué)研究[104-106].隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于比較葉綠體基因組研究開(kāi)發(fā)特異性標(biāo)記已經(jīng)成為趨勢(shì)，對(duì)紫薇屬六個(gè)物種全葉綠體基因組比較分析，鑒定到12個(gè)高可變區(qū)，為紫薇屬的居群遺傳學(xué)和譜系地理分析提供了可用的質(zhì)體標(biāo)記[107].對(duì)紫檀屬五個(gè)物種葉綠體基因組比較分析鑒定到8個(gè)高度可變區(qū)，可以作為特異性標(biāo)記進(jìn)行紫檀屬的譜系地理學(xué)研究[14].Xu等人[15]基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)對(duì)風(fēng)毛菊屬的分類(lèi)、物種分布和地理歷史進(jìn)行了研究，表明青藏高原及周邊地區(qū)如橫斷山脈的景觀異質(zhì)性對(duì)風(fēng)毛菊屬的演化具有重要的作用，青藏高原及周邊地區(qū)的持續(xù)抬升和全球變冷可能導(dǎo)致風(fēng)毛菊屬的地理擴(kuò)張和擴(kuò)散.

2.4葉綠體基因工程Daniell等人[108]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)EDTA處理后的黃瓜黃化質(zhì)體可以吸收外源DNA，并在體內(nèi)表達(dá).基因槍轟擊法極大地簡(jiǎn)化了葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化體系，Boynton等人[16]首次利用基因槍法將atpB基因?qū)朐摶蛲蛔円略迦~綠體中，獲得了光合作用恢復(fù)的衣藻；Svab等人[109]獲得了高等植物煙草的葉綠體穩(wěn)定遺傳植株.Ruf等人[110]結(jié)合CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，開(kāi)發(fā)了新的高效穩(wěn)定的葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化方法.與傳統(tǒng)的以核基因組為受體的遺傳轉(zhuǎn)化相比，葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化具有很多優(yōu)勢(shì)[18]：目的基因表達(dá)效率高，不存在轉(zhuǎn)化后基因沉默現(xiàn)象；葉綠體基因表達(dá)方式與原核生物相似，可以進(jìn)行多順?lè)醋颖磉_(dá)；葉綠體是一個(gè)生物反應(yīng)器，能夠在葉綠體中積累任何的外來(lái)蛋白和其他生物產(chǎn)物，尤其是在細(xì)胞質(zhì)中有害的生物產(chǎn)物；多為母系遺傳，外源基因不會(huì)隨花粉擴(kuò)散，環(huán)境安全性高.除煙草外，小麥[111]、水稻[112]、大豆[113]、棉花[114]、番茄[115]、馬鈴薯[116]、胡蘿卜[117]、萵苣[118]和擬南芥[119]等植物的葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化研究也取得了成功.

通過(guò)葉綠體基因工程將抗性基因?qū)肴~綠體基因組中，可以增強(qiáng)植物對(duì)除草劑的耐受性或增強(qiáng)植物抗蟲(chóng)性.在植物中表達(dá)對(duì)草甘膦不敏感的epsps基因是培育耐除草劑作物的主要方式[120].將epsps基因?qū)霟煵萑~綠體基因組后，得到的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了高草甘膦抗性[121].類(lèi)似的，通過(guò)葉綠體基因工程獲得的轉(zhuǎn)Bar基因植株，也表現(xiàn)出了對(duì)草銨膦類(lèi)除草劑的抗性[122].McBride等人[123]將抗蟲(chóng)基因cry1Ac導(dǎo)入煙草葉綠體基因組中，轉(zhuǎn)基因植株中Bt蛋白的表達(dá)量顯著高于核基因轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化植株的表達(dá)量，這是葉綠體基因工程對(duì)農(nóng)藝性狀改良的首次應(yīng)用.Zhang等人[124]利用質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在煙草和馬鈴薯中高效表達(dá)了馬鈴薯葉甲蟲(chóng)的雙鏈RNA，在提高植物抗蟲(chóng)性上取得了突破性進(jìn)展.

滲透保護(hù)劑在植物應(yīng)對(duì)干旱和鹽脅迫等非生物逆境過(guò)程中起重要作用，將編碼滲透保護(hù)劑相關(guān)基因在植物體內(nèi)過(guò)表達(dá)，可以有效提高植物的耐鹽和耐旱能力.Kumar等人[117]將編碼甜菜堿脫氫酶的BADH基因?qū)牒}卜葉綠體基因組中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株BADH基因的表達(dá)量顯著提高，明顯提高了轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽能力.將編碼阿拉伯糖醇脫氫酶的ArDH基因?qū)霟煵萑~綠體基因組中，獲得了能夠在含350 mmol/L NaCl的土壤中正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株[125].在煙草葉綠體中表達(dá)脫氫抗壞血酸還原酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽還原酶提高了植物對(duì)非生物脅迫的耐受性[126].

由于葉綠體數(shù)目龐大，葉綠體基因組的拷貝數(shù)多，其整合的外源基因表達(dá)效率高，所以葉綠體轉(zhuǎn)基因植株是生產(chǎn)生長(zhǎng)激素、抗體和蛋白質(zhì)最好的生物反應(yīng)器，其表達(dá)量比核基因組轉(zhuǎn)化系統(tǒng)高300倍[127].此外，有些在細(xì)胞質(zhì)中可能是有害的物質(zhì)，不能通過(guò)核基因轉(zhuǎn)化獲得[128].例如，霍亂β亞基(CTB)基因，通過(guò)核基因組在葉片中表達(dá)時(shí)，即使表達(dá)水平很低，仍會(huì)對(duì)葉片造成毒害，但當(dāng)該基因?qū)肴~綠體基因組并大量表達(dá)積累時(shí)是無(wú)毒的[19，20].海藻糖是一種醫(yī)藥工業(yè)的防腐劑，當(dāng)它在細(xì)胞質(zhì)中積累時(shí)，對(duì)植物細(xì)胞毒性很大，但當(dāng)其在葉綠體中區(qū)隔時(shí)，對(duì)細(xì)胞是無(wú)毒的[129].不同于在核基因組的轉(zhuǎn)化和表達(dá)，木聚糖酶在葉綠體中高表達(dá)不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁降解也不會(huì)影響植物生長(zhǎng)[130].

3 展 望

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，是植物特有的細(xì)胞器.與核基因組相比，葉綠體基因組具有拷貝數(shù)高、進(jìn)化速率適中等優(yōu)點(diǎn).隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，葉綠體基因組測(cè)序開(kāi)始變得簡(jiǎn)單.葉綠體基因組數(shù)據(jù)已經(jīng)在系統(tǒng)發(fā)育、居群遺傳和譜系地理研究中得到了廣泛的應(yīng)用.但是對(duì)于一些特殊植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)變異機(jī)制的研究還不夠深入，對(duì)于葉綠體基因的RNA編輯、水平轉(zhuǎn)移、核質(zhì)互作等進(jìn)化方面的研究仍需要廣泛開(kāi)展.對(duì)葉綠體基因組的深入研究將會(huì)促進(jìn)我們更好地應(yīng)用葉綠體基因組.