賈文燕, 唐明華, 章俊輝, 袁黎明

(云南師范大學化學化工學院,云南 昆明 650500)

手性分離一直都是分離分析研究的重點和難點[1],手性分離在制藥、食品、化學等領域被廣泛應用。例如在藥物方面[2],用于臨床的2 000多種藥品中,就有500多種為外消旋體,手性藥物的構型與細胞中的受體相匹配極為關鍵,如果不匹配,可能會降低藥效,甚至會產(chǎn)生相反的藥理作用,對人體造成傷害,所以手性藥物的拆分顯得尤為重要。毛細管電泳具有高效率、低能耗、分離模式多樣等優(yōu)點,已經(jīng)發(fā)展成為手性分離最具應用前景的方法之一。毛細管電色譜(CEC)是結合了毛細管電泳與高效液相色譜優(yōu)點而發(fā)展起來的一種分離分析方法,色譜柱由外層涂敷著聚酰亞胺、內徑為25～100 μm的熔融石英管制成。石英色譜柱具有電阻大、內徑小、比表面積大等特點,使得CEC可以在微電流、高電壓的環(huán)境下工作。與HPLC相比,其分析用樣品量較少,分離效率更高,分析成本更低,故CEC被廣泛運用于化學、環(huán)保、醫(yī)藥等領域[3,4]。

多孔有機籠(POCs)[5,6]是通過亞胺鍵、碳碳鍵、硼酸酯鍵等共價鍵連接、依靠分子間堆積組裝而成的多孔材料。該多孔材料的形狀一般為四面體、八面體、十二面體、球型。但是由于形成的多孔材料[7,8]中的亞胺鍵不穩(wěn)定,易發(fā)生水解,尤其是在酸性或堿性環(huán)境下,因此大大限制了多孔材料的應用。為解決這一問題,Cooper等[9]通過一種合成策略,將多孔有機籠的頂點與含羰基的物質(如乙醛)結合在一起,以此來維持晶體的穩(wěn)定性,使其孔隙大小不發(fā)生改變。

目前,構筑手性POCs材料主要有兩種方法:利用金屬離子或者金屬簇與純光學手性有機配體通過自組裝堆積形成;通過誘導引入手性基團,以非手性有機模板作為橋連配體組裝堆積合成[10],用伯胺與醛或者酮發(fā)生席夫堿反應獲得有機分子胺籠[11,12],且胺籠上的氨基較為活潑,為后期衍生和將POCs功能化提供了很多可能性。

POCs是一種較為理想的手性固定相材料。2015年,Yuan課題組[13]將多孔有機分子籠CC3-R用作毛細管氣相色譜手性固定相,證實了該材料對手性物質有良好的分離能力。Kewley等[14]報道了POCs在氣相色譜(GC)和電色譜中的應用,證明了POCs是一種可靠的拆分材料。2019年有文獻[15]報道將POCs用于液相色譜分離手性化合物,并取得了不錯的分離效果。POCs在吸附、分離、傳感和催化等方面也有許多潛在運用[16],揭示POCs的廣闊應用前景。

POCs與沸石、金屬-有機骨架、共價有機骨架、介孔二氧化硅等多孔材料不同,POCs在大部分有機溶劑中都能溶解。本文將POCs用于毛細管電色譜固定相,涂敷在毛細管內壁制成色譜柱,通過拆分外消旋體、位置異構體來研究其分離性能。通過緩沖溶液的濃度、操作電壓以及pH值的變化來探究其對4種手性藥物拆分效果的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

CL 1020高效毛細管電泳儀(北京華陽利民儀器有限公司);Bruker DXR 500 MHz核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司);D/Max 2000粉末衍射儀(日本Rigaku公司);Vario EL Ⅲ有機化學元素分析儀(北京來亨科貿有限責任公司);SDT-650熱重分析儀(美國TA儀器);XL 30 ESEM-TMP掃描電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司);純水器(英國Elga公司)。

三氟乙酸、1R,2R-1,2-二苯基乙二胺、硫脲、苯酚、六亞甲基四胺、氘代氯仿(CDCl3)、氘代二甲亞砜(DMSO-d6)購于上海Adamas試劑有限公司;二氯甲烷、甲醇、二甲亞砜(DMSO)、氫氧化鈉、2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛、三氯甲烷、鹽酸和磷酸(H3PO4)均購于天津風船化學試劑有限公司;生物緩沖劑三羥基甲基氨基甲烷(Tris)購于北京Solarbio公司;吡喹酮、二氫黃酮、萘普生、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺均購于比利時Acros Organics公司;位置異構體:o,m,p-碘苯胺、o,m,p-硝基苯胺購于上海Aladdin試劑有限公司。實驗所用試劑純度均≥99%。

1.2 2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛的合成

參考文獻[17]方法合成2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛。在N2保護下,稱取2.96 g (0.028 mol)苯酚與8.6 g (0.061 mol)六亞甲基四胺,加入30 mL三氟乙酸,于130 ℃油浴中攪拌24 h。將反應升溫至150 ℃攪拌2.5 h后冷卻至120 ℃,加入50 mL 4 mol/LHCl,靜置12 h后獲得淡黃色粉末,依次用甲醇、1 mol/L HCl、二氯甲烷洗滌得到2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛。

1.3 多孔有機籠的合成

根據(jù)文獻[18]方法合成POCs。將0.171 g (0.001 5 mol)1R,2R-二苯基乙二胺充分溶解在30 mL DMSO與3 mL三氯甲烷的混合溶液中,緩慢加入0.178 g (0.001 mol)2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛,然后加入0.01 mL三氟乙酸,并將上述混合物在室溫下攪拌14 d。獲得的橙色固體進行真空干燥后即可得到目標粗產(chǎn)物POCs,為了得到高純度產(chǎn)品,依次用三氯甲烷、乙醚洗滌。合成路線見圖1。

圖1 POCs的合成路線Fig.1 Synthesis route of porous organic cages (POCs)

1.4 多孔有機籠開管柱的制備

用1 mol/L NaOH溶液沖洗熔融石英毛細管2 h使其內壁粗糙化,接著用高純水和0.1 mol/L HCl各沖洗1 h,再用高純水沖洗至中性,最后將粗糙化后的石英毛細管柱用氮氣在120 ℃下吹干、冷卻后備用。

將POCs溶解于二氯甲烷溶液中,過濾。采用動態(tài)涂漬法[19]將該溶液在氮氣的推動下通過上述內壁被粗糙化處理的毛細管,使其在管壁內形成一層濕的涂層,繼續(xù)用氮氣流將毛細管吹干,放入氣相色譜柱溫箱中進行老化,從30 ℃開始升溫,以1 ℃/min的速率升至200 ℃,并在該溫度下保持4 h,冷卻后即得到所需的POCs開管柱。

1.5 毛細管電色譜實驗條件

截取58 cm上述POCs開管柱(內徑75 μm),在距末端8 cm處開窗,使該色譜柱的有效分離長度為50 cm。所用緩沖溶液均為Tris-H3PO4,電滲流標記物選用2 mg/mL硫脲。初次使用該色譜柱時,依次用去離子水、緩沖溶液沖洗色譜柱直至基線平穩(wěn)。每次進樣前,用緩沖溶液對色譜柱進行沖洗,以保證色譜柱的高效性與重復性。進樣采用虹吸的方法,進樣高差為5 cm,進樣時間為2 s,樣品的檢測波長為254 nm。

拆分二氫黃酮、吡喹酮、萘普生和3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺的工作電壓分別為13、14、14和12 kV;二氫黃酮適宜緩沖溶液濃度為0.075 mol/L,吡喹酮、萘普生和3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺為0.100 mol/L;4種手性樣品拆分時的pH值均為3.51。

2 結果與討論

2.1 2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛的結構表征

將2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛溶解于DMSO進行核磁共振實驗。1H NMR (500 MHz,DMSO-d6):δ10.33 (s,2H,OH),10.02 (s,1H,CHO),8.56 (s,2H,Ar-H);13C NMR (125 MHz,DMSO-d6):δ192.14、191.18、166.74、137.77、128.58、124.75。上述所得數(shù)據(jù)與文獻[17]報道一致,表明已經(jīng)成功合成2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛。

2.2 POCs的結構表征

采用核磁共振、紅外光譜、X射線粉末衍射(XRD)等方法對合成的POCs進行表征。將POCs溶解于CDCl3中測得核磁共振氫譜,1H NMR (500 MHz,CDCl3):δ8.80～8.56 (m,4H),8.38～8.25 (m,4H),8.10～8.03 (m,4H),7.94～7.86 (m,8H),3.46～3.24 (m,12H),1.83～1.46 (m,48H),所得數(shù)據(jù)與文獻[18]報道一致。

在紅外光譜圖2a中,1 602、1 489和1 458 cm-1處的吸收峰由苯環(huán)中C=C-H和C=C拉伸振動產(chǎn)生。1 636 cm-1處較強的特征吸收峰為亞胺鍵(C=N)拉伸帶,位于2 900 cm-1左右的兩峰為C-H產(chǎn)生,位于3 420 cm-1處的吸收峰是-OH拉伸帶,所得實驗數(shù)據(jù)與文獻[18]報道結果一致。圖2b是XRD測試圖,POCs粉末衍射數(shù)據(jù)與模擬數(shù)據(jù)一致。以上測試均表明已經(jīng)成功合成了POCs。

圖2 POCs的(a)紅外光譜圖和(b)X射線粉末衍射圖Fig.2 (a)IR spectrum and (b)X-ray powder diffraction (XRD)pattern of POCs

為考察該多孔有機籠的熱穩(wěn)定性,將熱重儀的參數(shù)設置成以1 min/℃從室溫升至800 ℃,進行熱重分析,從圖3可以看到,該材料在大約380 ℃時才開始分解,熱穩(wěn)定性好,電泳中產(chǎn)生的焦耳熱對其穩(wěn)定性沒有影響,適于做手性開管毛細管柱。

圖3 POCs熱重曲線圖Fig.3 Thermogravimetric curve of POCs

2.3 POCs的氮氣吸附測試

該多孔有機籠是一種具有四面體結構的多孔材料,為測試其比表面積、空腔體積及孔徑大小,進行氮氣吸附實驗,結果見圖4。POCs的比表面積為209.91 m2/g,孔體積為0.078 cm3/g,孔徑大小為1.98 nm。說明POCs比表面積較大,適用于一般有機化合物的分離。

圖4 POCs的(a)氮氣吸附脫附等溫線和(b)孔徑分布曲線Fig.4 (a)Nitrogen adsorption and desorption isotherms and (b)pore size distribution curves of POCs

2.4 POCs毛細管柱掃描電鏡表征

為觀察POCs在毛細管內壁的涂漬情況,將制成的色譜柱進行掃描電鏡分析(見圖5),對比未涂敷的空毛細管柱與已經(jīng)涂敷了POCs手性固定相的色譜柱掃描電鏡圖,可以明顯看到毛細管內壁已經(jīng)涂敷上一層厚度較為均勻的POCs材料。

圖5 石英毛細管柱掃描電鏡圖Fig.5 SEM of quartz capillary columnsa.empty column;b.POCs chiral column.

2.5 POCs色譜柱對手性化合物的拆分

POCs的手性識別能力,可能是受到該多孔有機籠獨特的手性結構及官能團的影響。在弱范德華力的作用下,通過分子之間的自組裝形成了具有四面體結構的多孔材料。當外消旋體進入到毛細管色譜柱中,與分子籠的表面或內部充分接觸時,偶極-偶極之間的相互作用，以及π-π鍵、氫鍵等的相互作用會對手性分離產(chǎn)生影響。此外,較弱的范德華力也會產(chǎn)生一定影響?？傊鸱质中苑肿邮且粋€較為復雜的過程,涉及許多影響因素,但不可否認的是手性固定相在其中起到的作用是無可替代的。

為了探究該色譜柱對手性化合物的拆分能力,選用二氫黃酮、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺、萘普生和吡喹酮為樣品,改變實驗中的分離電壓、緩沖溶液濃度、緩沖溶液pH值,優(yōu)化拆分4種外消旋體的最佳實驗條件。

2.5.1分離電壓對手性化合物拆分的影響

選用0.100 mol/L、pH 3.51的Tris-H3PO4緩沖體系,考察工作電壓(10～20 kV)對分離對映異構體的影響。從表1部分數(shù)據(jù)可知,分離度(Rs)先是隨著電壓的增加而增加,但隨后分離度降低。增加操作電壓,可以使電滲流增大,從而縮短樣品出峰時間和增加分離度,但是過大的電流會加大焦耳熱,降低化合物的分離度。二氫黃酮、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺、吡喹酮與萘普生獲得較好分離效果所需的工作電壓分別為13、12、14、14 kV。

表1 不同分離電壓下4種外消旋體的拆分結果Table 1 Separation results of the four racemates at different separation voltages

2.5.2緩沖液濃度對手性化合物拆分的影響

在最優(yōu)分離電壓條件下,采用pH值為3.51但濃度不同的緩沖溶液,4種外消旋體的色譜拆分情況如表2所示。當分離二氫黃酮時,緩沖溶液濃度由0.050 mol/L升至0.075 mol/L,其分離度增大;繼續(xù)增至0.125 mol/L,分離度卻一直降低。當緩沖溶液濃度為0.05 mol/L時,3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺和吡喹酮都無法分開,繼續(xù)由0.075 mol/L增至0.100 mol/L時,3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺、吡喹酮的分離度都增大,但是當濃度升至0.125 mol/L時,二者分離度都降低。當緩沖溶液濃度由0.050 mol/L增至0.100 mol/L時,萘普生的分離度逐漸增大,繼續(xù)增至0.125 mol/L時,萘普生則無法分開。因此,適當范圍內增加緩沖溶液的濃度可以提高手性分離效果,但過高濃度不但會降低拆分效率,還會導致不能手性分離。二氫黃酮得到較好分離的緩沖溶液濃度是0.075 mol/L,其他3種皆是0.100 mol/L。

表2 不同濃度的緩沖溶液下4種外消旋體的拆分結果Table 2 Separation results of the four racemates at different concentrations of buffer solution

2.5.3緩沖液pH值對手性化合物拆分的影響

在優(yōu)化后的分離電壓和緩沖液濃度下,考察實驗緩沖溶液pH值對外消旋體分離的影響,實驗數(shù)據(jù)如表3所示。當pH值從2.48增加到3.51,二氫黃酮、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺、吡喹酮分離度隨之增大;當pH值增加到4.50時,分離度反而降低。萘普生pH值為3.51時,其分離度為3.59,但隨著pH值的升高,反而無法將其分開。太低的pH值能影響色譜固定相的活性,太高的pH值能增大電滲流,縮短分析物的保留時間,影響分析物的拆分效果。拆分4種手性物質的最佳pH值均為3.51。

表3 不同pH值緩沖溶液下4種外消旋體的拆分結果Table 3 Separation results of the four racemates at different pH values of buffer solution

經(jīng)過上述3個實驗的研究探討,得到4種手性物質在最佳拆分條件的電色譜圖(見圖6),二氫黃酮、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺、吡喹酮與萘普生它們的分離度分別是2.99、2.10、2.58、3.59,全部都達到了基線分離,表明POCs手性色譜柱對外消旋體具有良好的手性識別能力和分離效果。

圖6 POCs手性柱對4種外消旋體的電色譜圖Fig.6 Electrochromatograms of the four racemates on POCs chiral columns

2.6 POCs色譜柱對位置異構體的拆分

POCs毛細管柱對位置異構體o,m,p-碘苯胺、o,m,p-硝基苯胺也進行了分離研究(見圖7)。電色譜分離介質為0.100 mol/L、pH 3.51的Tris-H3PO4緩沖溶液,分離電壓為15 kV。位置異構體與POCs固定相間存在著相互作用力,因位置異構體的分子結構、大小各不相同,與固定相接觸時產(chǎn)生的效果存在差異,在苯系位置異構體中,其鄰、間、對位的長寬比不一樣,與固定相的作用力大小也不一樣,其保留時間不同,從而使位置異構體分離。

圖7 POCs手性柱對(a)o,m,p-硝基苯胺和(b)o,m,p-碘苯胺的分離電色譜圖Fig.7 Electrochromatograms of (a)o,m,p-nitroaniline and (b)o,m,p-iodoaniline on POCs chiral columns

3 結論

將手性POCs用作毛細管電色譜固定相,能對二氫黃酮、吡喹酮、萘普生、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺手性化合物進行基線分離,對o,m,p-硝基苯胺、o,m,p-碘苯胺位置異構體具有良好的分離效果。該研究表明,手性POCs是一類很有發(fā)展?jié)摿Φ氖中苑蛛x材料,對該類材料的深入研究,必將推進手性識別材料的發(fā)展,拓展毛細管電色譜在手性分離領域的廣泛應用。